Elektroforeza – metoda rozdziału substancji, rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym.

Podstawowym zjawiskiem wykorzystywanym w tej metodzie jest zróżnicowana ruchliwość jonów w polu elektrycznym. W zależności od posiadanego ładunku wypadkowego ruch odbywa się w kierunku do katody lub do anody.

Szybkość i kierunek poruszania się cząsteczek w polu elektrycznym są uzależnione od wypadkowego ładunku elektrycznego cząsteczki, wielkości i kształtu cząsteczek, siły jonowej elektrolitu, temperatury, sił tarcia w środowisku, gradientu potencjału, natężenia prądu i innych czynników.

Zależnie od sposobu przeprowadzania rozdziału wyróżnia się dwa podstawowe rodzaje elektroforezy:
* elektroforezę swobodną (prowadzoną w roztworach)
* prowadzoną na nośnikach, którymi są materiały o strukturze porowatej lub żelowej - np. bibuła.

Trzy metody elektroforetyczne:
* elektroforeza żelowa; w żelu poliakrylamidowym, agarozowym lub skrobiowym. żel służy do stabilizowania środowiska rozdziału, ponadto można uzyskiwać żele o różnych średnicach porów dla polepszenia rozdziału, wykorzystując zasadę sita molekularnego. Metoda elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) Odmiana PAGE w obecności detergentu (najczęściej SDS) może służyć w odpowiednich warunkach do oznaczania masy cząsteczkowej nieznanych białek przez porównanie z białkami o znanej masie cząsteczkowej. SDS powoduje denaturację białek i tworzy z nimi kompleksy o stałym stosunku SDS-białko. Kompleksy takie posiadają bardzo duży i prawie jednakowy ujemny ładunek pochodzący z dysocjacji reszt siarczanowych, w związku z czym ruchliwość elektroforetyczna jest uzależniona tylko od wielkości cząsteczki kompleksu.
* ogniskowanie izoelektryczne polega na prowadzeniu elektroforezy w stałym gradiencie pH otworzonym między anodą i katodą. Wykorzystano tu zjawisko nieoddziaływania pola elektrycznego na cząsteczki o zerowym ładunku wypadkowym. Substancje rozdzielane elektroforetycznie mają zazwyczaj własności amfoteryczne. Cząsteczki obdarzone ładunkiem wędrują w trakcie elektroforezy w kierunku elektrody o przeciwnym znaku. Podczas wędrówki przez gradient pH ładunek będzie ulegał zmianie aż do momentu gdy cząsteczka znajdzie się w pH równym jej punktowi izoelektrycznemu. W tym momencie cząsteczka będzie elektrycznie obojętna - a więc nie będzie się przemieszczać dalej. Cząsteczki o jednakowym punkcie izoelektrycznym będą się gromadziły razem.
* elektroforeza kapilarna - najnowocześniejsza technika elektroforetyczna, opierająca się na rozdziale badanych substancji w bardzo cienkiej kapilarze kwarcowej, wypełnionej buforem lub żelem. Można ją stosować zarówno do prostych jonów nieorganicznych jak i do całych komórek (!).

Dla białek podstawowe metody barwienia to:
* wybarwianie barwnikiem organicznym Coomassie Brillant Blue, który adsorbuje si ę na cząsteczkach białka zawartych w żelu.
* wybarwianie srebrem - polegające na przekształceniu cząsteczek białka w żelu w pochodne powodujące redukcję AgNO3 do srebra metalicznego
* wybarwienie w żelu białka o określonej aktywności enzymatycznej - barwienie metodą chemiczną, w którym jedna z reakcji jest katalizowana przez ten enzym.

Izoenzymy- różne formy tego samego enzymu.
Barwienie histochemiczne elektroferogramu homogenatu określonej tkanki wykazuje często obecność w niej kilku form tego samego enzymu.

Dzięki temu że geny kodujące białka są polimorficzne (występują w postaci kilku alleli tego samego genu) oraz temu, że obydwa allele są aktywne w procesie biosyntezy białek i są widoczne w profilu izoenzymatycznym (wykazują kodominację).

Najważniejszym czynnikiem wpływającym na różnice ruchliwości elektroforetycznej izoenzymów s ą zmiany w pierwszorzędowej strukturze białka, będące odbiciem różnic w allelach tego samego genu.

Możliwe jest kilka rodzajów mutacji punktowych polegających na zamianie w tym kodonie jednej zasady azotowej na inną:
(1) zamiana kodonu TTC na TCC spowoduje zamianę z lizyny na argininę, dzięki czemu otrzymamy nowy allel, kodujący nową alloproteinę (inną formę tego samego białka). Ponieważ reszta argininowa podobnie jak lizynowa ma ładunek dodatni, białko będzie miało wypadkowy ładunek nadal równy +3;
2) Jeżeli kodon TTC zmutuje do TGC, nowa alloproteina będzie miała treoninę w poz. 5. Ponieważ aminokwas ten jest neutralny, cząsteczka będzie miała wypadkowy ładunek +2.
3) Mutacja TTC do CTC spowoduje wbudowywanie w miejscu lizyny glutaminy, dysocjującej na jon ujemny. Wypadkowy ładunek będzie wynosił +1.
4) W końcu, jeżeli kodon TTC zmutuje do TTT, jego znaczenie pozostanie takie samo (będzie nadal kodował lizynę).

Próbka: roślinna np. liście szpinaku, preparat reduktazy ferredoksyna: NADP+ ze szpinaku.
Bufor: 1. Do zawieszania próbki– tris, glicerol lub sacharoza, błękit bromofenolowy ph 6,8.
2. Elektrodowy- tris, glicyna, woda, ph 8,8

Przygotowanie żelu uszczelniającego i rozdzielającego (10% wzgl. akrylamidu)
Zmieszać wody 8.3 ml, roztworu A (akrylomid, bis-akrylomid) 6.7 ml, roztworu B (tris w wodzie ph 8,8) 5.0 ml.
Z przygotowanego roztworu pobrać 3 ml, dodać: r-ru nadsiarczanu 100 ul, TEMED-u 10 ul.

Wlać natychmiast mieszaninę do uprzednio przygotowanego zestawu szybek aparatu do elektroforezy tak, by utworzyła się na dnie warstwa ok. 0.5 cm. Po jej spolimeryzowaniu dodać do pozostałej części przygotowanego roztworu 150 ml r-ru nadsiarczanu i 15 ml TEMED-u i wlać do aparatu do wysokości ok. 2 cm od górnej kraw ędzi szyb. Na roztwór mi ędzy szybkami nanieść ostrożnie ok. 1 cm warstwę wody, co powoduje wyrównanie powierzchni żelu.

Po ok. 60 min. odsączyć z powierzchni żelu wodę i wlać uprzednio przygotowany roztwór dla otrzymania żelu zagęszczającego o składzie: