1. CO TO JEST GENOM?

1.1. Ludzki genom
- całkowity DNA wydzielony z komórek ludzkich.

1.2. Gen
- fragment DNA zawierający informację o budowie danego białka. Istotny jest fakt, że nie cały DNA jest informacją o budowie protein - mówimy, że nie cały jest aktywny transkrypcyjnie. Wynika z tego podział DNA na :

1.3. Egzony
- sekwencje kodujące - noszące informację o budowie danej proteiny

1.4. Introny
- sekwencje niekodujące, spełniają funkcje kontrolne i stabilizujące. [1]

1.5. Materiał genetyczny
jest rozprowadzany między chromosomami, których liczba jest charakterystyczna dla danego gatunku. Zestaw 23 chromosomów zawiera całkowitą informację genetyczną zawierając ludzki genom, który jest przechowywany w trylionach ludzkich komórek.
Na poziomie podstawowym ludzki genom składa się z kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA), polimery złożonego z powtarzających się 4 nukleotydów, którymi podstawowymi elementami są: pięciocukry (deoksyryboza), grupa fosforowa i jedna z czterech zasad azotowych. Zlokalizowany w chromosomie DNA, który kieruje syntezą określonego białka tworzy gen. Dwa łańcuchy, tworzące podwójną helisę DNA połączone są słabymi wiązaniami wodorowymi pomiędzy ponad 3 bilionami par nukleotydowych z komplementarnymi elementami złożonymiz adeniny (a), tyminy (T), cytozyny (C) i guaniny (G). Podwójna helisa przypomina drabinę, w której poszczególnymi szczeblami są pary G-C i A-T. Kiedy drabina zostaje przedzielona na dwa osobne łańcuchy, para zasad może być użyta jako marker, który będzie pasował tylko do komplementarnego miejsca w drugim łańcuchu. Zmiany w którejś z zasad mogą wywołać mutacje. [6]

1.6. Budowa DNA

Rysunek 1
Budowa podwójnej helisy DNA [1]


Rysunek 2
Elementy strukturalne łańcucha DNA [1]

2. Historia badań nad ludzkim genomem
1953 James Watson i Francis Clark odkrywają strukturę podwójnej helisy DNA

1972 Paul Berg wytwarza pierwszą rekombinującą cząsteczkę DNA

1977 odkrycie metody sekwencjonowania DNA

1982 zautomatyzowane sekwencjonowanie DNA

1984 zastosowanie elektroforezy wyselekcjonowanie kompletnej sekwencji DNA z wirusa

1985 odkrycie technik do replikacji dużych fragmentów DNA

1986 pierwsza propozycja sekwencjonowania ludzkiego genomu pierwsze urządzenie do sekwencjonowania

1988 James Watson - odkrywca DNA oświadcza, że 3% budżetu genomowego powinno być przeznaczone na socjalne i etyczne

1989 powstaje komitet etycznych i socjalnych następstw programu HGP (Human Genom Program)

1990 opracowanie 5 - letniego planu na stworzenie ludzkiej mapy genetycznej opublikowanie algorytmu na wyznaczanie sekwencji

1991 GRAIL - pierwszy program ułatwiający wyszukiwanie genów opracowanie strategii na wykrycie genów ulegających ekspresji

1992 pierwsza mapa chromosomu Y oraz chromosomu 21

1995 japoński rząd przeznacza dla kilku grup opracowujących sekwencję DNA ponad 15 milionów dolarów opublikowanie pierwszej mapy ludzkiego genomu zawierającego 15000 markerów

1997 zsekwencjonowano genom komórki drożdży

1998 zsekwencjonowano genom komórki Escherihia coli

2000 firma Celera zobowiązuje się zsekwencjonować ludzki genom w 3 lata [4]



3. Wprowadzenie do badań nad ludzkim genomem.
Badania nad ludzkim genomem i różnego rodzaju testy genetyczne niosą zapowiedż jednocześnie najbardziej wartościowych i najbardziej destrukcyjnych odkryć całego milenium. Konsekwencje badań genetycznych są dalekosiężne, z możliwością znalezienia sposobów leczenia na takie schorzenia, jak wszelakiego rodzaju nowotwory, ale tez prowadza do przesądzania ludzkiego życia jeszcze przed urodzeniem, poprzez poznanie chorób, które go czekają.
Naukowe, socjologiczne i etyczne implikacje testów genetycznych wymagaja odpowiedniej ich regulacji i kontroli. Najwazniejszą w Stanach Zjednoczonych jest Food and Drug Administration (FDA).
Testy genetyczne mogą być wykorzystane do dokładnego poznania chorób dziedziczonych genetycznie. Pozwalaja pacjentom sprawdzić obecność genu kodującego je i umożliwia stwierdzenie czy choroba uaktywni się wciągu życia pacjenta lub czy przekaże ją dzieciom. Testy genetyczne są oficjalnie definiowane jako analiza ludzkiego DNA, chromosomów i pewnych metabolitów w celu wykrycia genotypów związanych z chorobami dziedzicznymi, mutacjami. Zapewnia to ocene ryzyka, zidentyfikowanie czynników aktywujących oraz ustalenie klinicznych diagnoz i prognoz. [11]
Rozwój technologii sztucznej rekombinacji DNA (łączenie różnych cząsteczek lub wymianę jednych fragmentów na inne; w wyniku powstaje DNA o nowych układach sekwencji zasad) był swoistą rewolucją w dziedzinie genetyki.
Początkowo metody tej technologii opracowano w celu uzyskania większej liczby kopii dowolnego fragmentu DNA o specyficznej sekwencji po to, aby można go było go badać za pomocą technik biochemicznych.
Dziś można "powielać" fragment DNA kilkoma metodami. [2]
Większość z nich polega na wprowadzeniu obcego DNA do komórek mikroorganizmów. DNA jest replikowany i przekazywany komórkom potomnym.
Fragment DNA o konkretnej sekwencji zostaje w ten sposób powielony, czyli sklonowany w milionach identycznych kopii.
Badania sklonowanych fragmentów DNA zawierających konkretne sekwencje dostarczyły niezwykle ważnych informacji o organizacji genów i zależnościach między genami a ich produktami.
Jedną z praktycznych zastosowań sztucznej rekombinacji DNA jest inżynieria genetyczna, mająca na celu modyfikację DNA organizmów, wprowadzanie do nich nowych genów i otrzymywanie, dzięki ich ekspresji nowych produktów. [1]

4. PODSTAWY FIZYCZNE
4.1 Elektroforeza
ELEKTROFOREZA - metoda analizowania i rozdzielania koloidów, wykorzystująca ruch naładowanych cząstek koloidowych w polu elektrycznym. [8]

Wielkością referencyjną występującego zjawiska jest ruchliwość elektroforetyczna, która określa prędkość przemieszczania się cząstek na jednostkę natężenia pola :


(1)
u - ruchliwość elektroforetyczna (C *s/kg)
v -prędkość cząstki (m/s)
E - natężenie pola elektrycznego (N/C)
lub uwzględniając wielkości dostępne w pomiarach :


(2)
gdzie:
s- droga migracji cząstki [m]
l- długość nośnika podziału [m]
t- czas trwania elektroforezy [s]
U- przyłożona różnica potencjałów

Elektroforezę przeprowadza się stosując natężenie pola w zakresie do 10 V/m. (elektroforeza niskonapięciowa) lub w warunkach chłodzenia przy natężeniu pola około 100V/m. (elektroforeza wysokonapięciowa). [9]
Analizę zjawiska elektroforezy można przeprowadzić na przykładzie analogii do spadku bańki mydlanej w powietrzu. W tym przypadku mamy do czynienia z obiektem sferycznym o promieniu a poddanemu działaniu siły grawitacyjnej Fg


(3)
Fg - siła grawitacyjna (N)
m - masa bańki (kg)
g - przyspieszenie ziemskie (m/s2)

Przy założeniu, że jest to jedyna działająca siła bańka będzie poruszać się ruchem jednostajnie przyspieszonym. Ale obserwacja pokazuje, że tak w rzeczywistości nie jest. Istnieje siła tarcia Ft przeciwdziałająca sile grawitacyjnej, związana z lepkością powietrza ?. Siła ta zwiększa się z prędkością v bańki i je wartość opisuje prawo Stokes'a :



(4) F - siła tarcia (N)
η - lepkość powietrza
a - przyspieszenie (m/s2)
v - prędkość (m/s)

W czasie przyspieszania bańka osiągnie pewien punkt, w którym Ft zrówna się z Fg . Potem nie obserwuje się dalszego przyspieszania i bańka porusza się ze stałą prędkością vt, którego wartość jest zdeterminowana warunkiem Fg + Ft = 0 i przedstawia się następująco:


(5)
vt - prędkość bańki (m/s)
m - masa bańki (kg)
η - lepkość powietrza
a - przyspieszenie (m/s2)
u - ruchliwość elektroforetyczna (C *s/kg)
g - przyspieszenie ziemskie (m/s2)
opisując związek z ruchliwością u.

Zamiast siły grawitacyjnej Fg = m*g [m.- masa cząstki (g), g- przyciąganie ziemskie (m/s)] przyjmujemy siłę elektryczną Fe = Q*E [Q- ładunek elektryczny (C), Ee - natężenie pola elektrycznego ( N/C)]. Możemy zatem przypuszczać, że wzór na prędkość dla cząstki naładowanej w polu elektrycznym będzie się przedstawiał następująco :


(6)
η - lepkość powietrza
a - przyspieszenie (m/s2)
Q - ładunek cząstki (C)
E - natężenie pola elektrycznego (N/C)

Nie jest to poprawne ze względu na chmurę jonów otaczających naładowaną cząstkę. Ta chmura ma ładunek przeciwny, ale równy co do wartości ładunkowi cząstki i pod wpływem zewnętrznego pola elektrycznego przemieszcza się w przeciwnym kierunku. Energia związana z przemieszczającą się chmurą jest częściowo przekazywana do otaczającego ją środowiska, a więc również do naładowanej cząstki. Przyjmując za punkt odniesienia poruszającą się cząstkę, możemy zauważyć nieruchomą sferę z roztworem elektrolitu opływającym ją z prędkościa - vt. Zilustrowano to na rysunku 3, gdzie przyjęto , że cząstka przenosi ładunek dodatni , a natężenie ma zwrot w prawo. Dla przypadku cząstki naładowanej ujemnie natężenie ma zwrot przeciwny. [8]

Rysunek 3
Model przepływu elektrolitu wokół naładowanej cząstki. [8]

5. Metody manipulowania i analizy DNA
5.1 Bakteryjne enzymy restrykcyjne
Aby wbudować fragmenty obcego DNA do wektorów plazmidowych, potrzebne są techniki pozwalające na cięcie i ponowne łączenie dwuniciowego DNA.
Odkrycie i zastosowanie endonukleaz restrykcyjnych w latach sześćdziesiątych i wczesnych siedemdziesiątych było kluczowym dokonaniem, dzięki któremu stało się możliwe cięcie DNA.
Enzymy restrykcyjne rozcinają symetrycznie obydwie nici DNA w obrębie krótkich palindromowych (symetrycznych) sekwencji, stanowiących rozpoznawane przez nie miejsca restrykcyjne.
Pozostawiają one grupę fosforanową na końcu 5', a grupę OH na końcu 3' cząsteczki DNA Rozcinając DNA tworzą tępe końce lub końce wystające od strony 3' lub 5', które są znane pod nazwą końców kohezyjnych lub lepkich. [1]

Rysunek 4
Działanie endonukleaz restrykcyjnych zilustrowane na przykładzie enzymu restrykcyjnego HindIII. [1]

Enzymy restrykcyjne przecinają DNA w miejscach, w których występują sekwencje identyczne jak po przeciwnej stronie łańcucha. Prowadzi to do powstania dwóch lepkich końców.
Póżniej mogą się one łączyć przez oddziaływania między tworzącymi pary zasadami (hybrydyzację) jednoniciowych krótkich fragmentów z końcami innych cząsteczek DNA mających taką samą wystającą sekwencję. [1]

5.2 Trawienie restrykcyjne
Trawienie plazmidu lub genomowego DNA przeprowadza się na skalę preparatywną lub analityczna używając dostępnych w handlu enzymów restrykcyjnych i buforów.
Wszystkie enzymy restrykcyjne wymagają Mg2+, zwykle w stężeniach dochodzących do 10 mM, lecz różne enzymy wymagają do optymalnej aktywności różnego pH, stężenia NaCl lub obecności innych składników buforu.
Trawienie kilkuset nanogramów (< 1ľg) plazmidowego DNA wystarcza aby produkty trawienia można było analizować poprzez elektroforezę w zelu agarozowym.
W skali preparatywnej używa się kilku mikrogramów DNA.
DNA jest inkubowany enzymem i odpowiednim buforem w optymalnej temperaturze (zwykle 37oC), zazwyczaj w objętości 20 mikrolitrów. Nastepnie do próby dodawany jest barwnik i próbkę nanosi się na żel agarozowy. [2]

5.3 Elektroforeza DNA w żelu agarozowym
Agaroza - polisacharyd rozpuszczony w roztworze wodnym tworzy stały żel.
Próbki DNA są umieszczane w kieszonkach formowanych w żelu, włączane jest żródło prądu i DNA może się przemieszczać poprzez żel w osobnych ścieżkach. [2]

Rysunek 5
Aparat do elektroforezy w żelu agarozowym. [2]

Kiedy poddamy żel działaniu pola elektrycznego w obecności buforu, który przewodzi prąd elektryczny, fragmenty DNA migrują w żelu w kierunku elektrody dodatniej ( DNA ma silny ładunek ujemny) z szybkością zależną od ich wielkości i kształtu. [2]
Proces ten może być zatem wykorzystywany do rozdzielenia mieszaniny fragmentów DNA o różnej wielkości. [1]

Rysunek 6
Rozdzielanie mieszaniny fragmentów DNA o różnej wielkości. [1]

Małe liniowe fragmenty poruszają się szybciej niż większe, których ruch jest silniej hamowany przez plątaninę włókien agarozy tworzących żel.
Szybkość, z jaką przesuwa się w żelu cząsteczka DNA jest odwrotnie proporcjonalna do jej masy cząsteczkowej. Umieszczenie w niektórych studzienkach fragmentów DNA o znanej wielkości pozwala na dokładny pomiar masy cząsteczkowej badanych fragmentów.
Dodany barwnik ( najczęściej bromek etydyny) także migruje i jego ruch pozwala na śledzenie przebiegu elektroforezy. Barwnik ten, po związaniu z DNA fluoryzuje w świetle UV. [1]

Rysunek 7
Związany z DNA bromek etydyny fluoryzujący w świetle UV. [1]

Bardziej dokładnie wielkość liniowych fragmentów można ustalić poprzez wykreślenie krzywej kalibracyjnej (zależności między długością znanych fragmentów DNA a odległościami jakie badane fragmenty przebyły podczas elektroforezy). [1]

Rysunek 8 Zależność długości fragmentów DNA od przebytej odległości w czasie elektroforezy [2]

Wykres ten można wykorzystać do określania wielkości liniowego fragmentu DNA o nieznanej masie na podstawie jego ruchliwości elektroforetycznej w tym samym żelu, odczytując jego długość. [2]

5.4 Chromosomy drożdżowe
Części składowe chromosomu eukariotycznego, które wymagane są do replikacji i segregacji, przynajmniej w drożdżach stanowią raczej małe i dobrze zdefiniowane sekwencje.
Odkrycie to doprowadziło do skonstruowania zrekombinowanych chromosomów (sztucznych chromosomów drożdżowych, ang. yeast artificial chromosomes YAC).

Początkowo były one używane do badania procesów reprodukcji i trwania chromosomów, a póżniej zaczęto je stosować jako wektory zdolne do przyjęcia bardzo dużych klonowanych fragmentów DNA.
Metoda konstrukcji klonów polega na ligacji dwóch odcinków końcowych wektora z sekwencją docelową, dzięki czemu powstaje kompletny chromosom wprowadzany następnie do komórek drożdżowych.
Wektory YAC mogą przyjąć fragmenty DNA o długości przekraczającej 1Mpz, co umożliwia klonowanie całych ludzkich genów, takich jak gen odpowiedzialny za mukowiscydozę, którego długość wynosi 250kpz.
Sztuczne chromosomy drożdżowe są nieocenione podczas mapowania dużych genomów, szczególnie przy mapowaniu genomu człowieka. [2]

5.5 Biblioteki genomowe
Biblioteka genowa jest zbiorem różnych sekwencji DNA , które zostały sklonowane w wektorze w celu ich łatwiejszego oczyszczania, przechowywania i analizy. Jeśli żródłem jest genomowy DNA, biblioteka nazywana jest biblioteką genomową. [1]

Rysunek 9 Konstrukcja biblioteki genomowej ludzkiego DNA [1]

Konstrukcja biblioteki genomowej ( zgodnie z przedstawionym powyżej rysunkiem) przebiega następująco:
(a) DNA z komórek ludzkich przecina się specyficznym enzymem restrykcyjnym na fragmenty (b), które łączy się za pomocą ligazy DNA z przeciętymi odpowiednim enzymem restrykcyjnym cząsteczkami wektora (c),które zawieraja również gen odporności na antybiotyk.(R)
Zrekombinowanymi plazmidami ( mała, kolista cząsteczka DNA, która może się replikować w komórce bakterii) transformuje się (osłabia ścianę komórkową bakterii, aby stała się przepuszczalna dla cząst. plazmidowego DNA) bakterie wrażliwego na antybiotyk szczepu E.coli. [1]
Warunki transformacji są tak dobrane, by każda komórka mogła otrzymać tylko jedną cząsteczkę plazmidu.(d).
Komórki hoduje się następnie na stałym podłożu odżywczym zawierającym antybiotyk. Przeżywają tylko te, które otrzymały plazmid.
Biblioteka nie jest reprezentatywna jeśli nie zawiera wszystkich oryginalnych sekwencji tzn. sekwencje nie klonowały się w całości ( np. sekwencje powtarzające się nie zawierające miejsc restrykcyjnych.
Podobnie jeśli biblioteka nie zawiera wystarczającej liczby klonów, jest prawdopodobne, że niektóre geny są pominięte.
W celu przygotowania reprezentatywnej biblioteki genomowej, genomowy DNA musi być oczyszczony, a następnie porozcinany losowo na fragmenty o wielkości odpowiedniej do klonowania w wybranym wektorze.
Oczyszczanie genomowego DNA zwykle przeprowadza się przygotowujac najpierw jądra komórkowe , oddzielone od innych organelli (mitochondria i chloroplasty zawieraja DNA, który mógłby zanieczyszczać preparat jądrowego DNA), a następnie usuwając białka, lipidy i inne niepożądane makrocząsteczki - za pomocą trawienia proteazą i ekstrakcji fazowej (mieszanina fenol - chloroform).
Genomowy DNA przygotowany w ten sposób składa się z fragmentów o długości kilkuset kpz pochodzących z chromosomów.
Istnieją dwie podstawowe metody fragmentowania tego DNA :
- mechaniczne rozrywanie
- trawienie enzymem restrykcyjnym
Mechaniczne rozrywanie spowodowane siłami tarcia podczas pipetowania, mieszania lub sonikacji (działanie ultradżwiękami) rozbija DNA progresywnie na coraz mniejsze fragmenty w sposób najzupełniej przypadkowy.
Zastosowanie enzymów restrykcyjnych gwarantuje mniej przypadkowe rezultaty, co wynika z lepszej dystrybucji miejsc restrykcyjnych.
Wybór metody i czas działania zależy od wielkości fragmentów wymaganych dla wybranego wektora. [1]

5.6 Sonda genetyczna
Powszechnie stosowana metoda wykrywania poszukiwanego DNA polega na użyciu sondy genetycznej, którą jest zwykle wyznakowany radioaktywnie fragment RNA lub jednoniciowego DNA o sekwencji komplementarnej do jednej z nici poszukiwanego genu.
Przykładowo, chcąc zlokalizować gen kodujący insulinę (znamy sekwencję aminokwasów insuliny) należy zsyntetyzować jednoniciową, wyznakowaną radioaktywnie cząsteczkę DNA, komplementarną do tej kodującej insulinę.
Sonda, którą jest jednoniciowy DNA, hybrydyzuje (łączy się tworząc komplementarne pary zasad) z fragmentem DNA zawierającym sekwencję kodującą insulinę.
Zawarty w komórkach tworzących pojedynczą kolonię DNA, który hybrydyzuje z sonda, staje się radioaktywny i może być wykryty za pomocą kliszy rentgenowskiej. [1]

Rysunek 10 Działanie sondy genetycznej {1]

5.7 Sekwencjonowanie DNA
Najczęściej stosowana metoda sekwencjonowania DNA polega na syntezie komplementarnych kopii jednej z jego nici za pomocą polimerazy DNA.

Rysunek 11 Schematyczny przebieg sekwencjonowania DNA. [1]

Nowo syntezowane łańcuchy DNA są wyznakowane na jednym końcu, by można było je zidentyfikować.
(a) W trakcie syntezy następuje przypadkowe włączanie dideoksynukleotydów, zmodyfikowanych nukleotydów, które nie mają grupy OH na końcu 3' i z tego powodu blokują dalsze wydłużanie łańcucha DNA.
(b) Do sekwencjonowania fragmentu DNA uzywa się 4 róznych mieszanin reakcyjnych. Każda z nic zawiera niewielką ilość dideoksynukleotydu , np. adeninę (dideoksy-ATP) i dużą ilość 4 normalnych deoksynukleotydów.
(c) Przypadkowe włączanie dideoksy-ATP do rosnącego łańcucha powoduje powstanie serii mniejszych fragmentów DNA., kończących się we wszystkich możliwych miejscach, w których w wyjściowym fragmencie DNA występuje adenina ( w nici komplementarnej do tej, która jest sekwencjonowana).
(d) Radioaktywne produkty każdej z czterech reakcji rozdziela się za pomoca elektroforezy w żelu i lokalizuje eksponując żel z kliszą rentgenowską. Sekwencję nukleotydów w nowo zsyntezowanym DNA odczytuje się bezpośrednio z filmu.
(e) Film rentgenowski po ekspozycji z żelem sekencjonującym.
Cztery ścieżki odpowiadają mieszaninom reakcyjnym zawierającym odpowiednio:dideoksy-GTP, dideoksy-CTP, dideoksy-ATP,dideoksy-TTP. [1]
Wraz z rozwojem sekwenatorów DNA i automatów przygotowujących próbki do sekwencjonowania, kilka zespołów badawczych zaangażowało się w określenie pełnej sekwencji genomowej ważnych człowieka.
Przygotowano mapę genetyczną każdego chromosomu, a następnie biblioteki poszczególnych chromosomów w sztucznych chromosomach drożdżowych (YAC).
Częściowo pokrywające się klony YAC izoluje się dopóty, dopóki nie zajmą one całej długości chromosomu.
Następnie określa się pełną sekwencję DNA każdego insertu YAC i wprowadza się do komputera, w których analizuje się i porównuje z sekwencjami innych klonów YAC.
Analizowana sekwencja insertu w jednym klonie powinna się pokrywać częściowo z sekwencjami dwóch innych insertów YAC, co pozwala wydedukować jedną ciągłą sekwencję całego DNA danego chromosomu.
W ten sposób buduje się kompletne sekwencje genomowe.