IMMOBILIZACJA ENZYMÓW

PODSTAWOWE SPOSOBY IMMOBILIZACJI BIAŁKA:

1. Adsorpcja na nierozpuszczalnych nośnikach

1. Wiązanie kowalencyjne z nośnikiem zwykle aktywowanych przez czynnik sprzęgający

1. Inkluzja w strukturze żelu lub w półprzepuszczalnych błonach

Immobilizacja to przestrzenne ograniczenie czegoś np. składnika E w układzie. Istnieje immobilizacja powierzchniowa (1 i 2) i objętościowa (3).

Metoda 1 i 3 dotyczy tez immobilizacji organicznej i tkanek (biofilm). Z kolei 3 pozwala też na zamknięcie mikroorganizmów żywych.

ZALETY PRACY Z ENZYMAMI IMMOBILIZOWANYMI

1. łatwość izolacji katalizatora od mieszaniny reakcyjnej z możliwością jego wielokrotnego wykorzystania – układ dwufazowy: ciało stałe-ciecz

2. możliwość prowadzenia reakcji w systemie ciągłym

• systemy okresowe

• układ stacjonarny

Kiedy reakcja wolna, a wrażliwa na mieszanie

• układ z mieszaniem

Układ pseudojednorodny – takie same warunki panują w całej objętości, brak lokalnych gradientów stężeń. Pseudo – bo to heterogeniczny układ

• Proces (pół)ciągły

• charakteryzuje się tym, że w sposób ciągły dozujemy do roztwór substratu do bioreaktora (np. kolumna z wypełnieniem)

• tam gdzie jest biokatalizator – tam jest reakcja czyli reaktor

• żeby był tylko „odbiór produktu” bez substratu należy zmienić (zwiększyć) długość kolumny (czas przebywania w reaktorach) lub natężenie (wolniej dozować)

• półciągły, gdy strumień jest dzielony: jest odbiór produktu + zawracanie mieszaniny reakcyjnej

• dla E natywnego nie stosuje się procesu ciągłego, bo będzie „wychodził” z kolumny

1. wysoka stabilność katalizatora zmiana struktury

2. zmiana specyficzności substratowej białka

ADSORPCJA

• wiązania wodorowe

• oddziaływania van der Waalsa

• oddziaływania elektrostatyczne

• oddziaływania hydrofobowe

Rzadko nośnikiem jest C_aktywny, raczej polimer akrylowy, tworzywa sztuczne, granit czy szkło.

Silny wpływ środowiska

• wartość pH, siła jonowa roztworu białka (oddziaływanie elektrostatyczne)

• stężenie enzymu w roztworze (liczba miejsc wiązania enzymu)

• temperatura (dyfuzja T, aktywność enzymu T )

• Powierzchnia właściwa, porowatość nośnika (średnica porów. ½ średnica białka)

Adsorpcja

duża dostępność do czyszczenia (-)uwzględnia niską trwałość,

nośników (-) enzymu (+) silny wpływ środowiska(pH),

odrywanie się nośnika (desorpcja)

Nośniki:

• Nieorganiczne:

• krzemionka

• wodorotlenek glinu/tytanu

• glinokrzemiany

• szkło porowate

• węgiel aktywny

• materiały ceramiczne

• Organiczne:

• polisacharydy (agar, celuloza, skrobia –dekstran)

• polimeryczne żywice jonowymienne

• kolagen

• Modyfikacje nośników

• Odpowiednie uwodnienie

• Zmiana pH

• Przyłączenie grup hydrofobowych (alkilowych, fenolowych)

IMMOBILIZACJA PRZEZ WIĄZANIA CHEMICZNE

Znajomość struktury białka

Grupy obecne w białku, potencjalnie tworzące wiązania z nośnikiem:

• tiolowe (Cys)

• grupy wodorotlenowe (Ser, Tyr, Thr)

• karboksylowe (Glu, Asp, C’-końcowe COO^-)

• guanidynowe (Arg) łatwo dobrać

• imidazowe (His) aktywator

• aminowe (Lys, N’-końcowe NH₃⁺):

• występują licznie

• występuje wysoce reaktywna – ilość i jakość reakcji

• II-rzędna funkcja w utrzymywaniu struktury, aktywności białka

Prościej dobrać aktywator od nośnika

Przykłady:

• immobilizacja przez wiązania amidowe C-N

czynnik acylujący (aktywator) to chlorobezwodnik kw. karboksylowego

• immobilizacja przez wiązanie –C=N-

IMMOBILIZACJA NA DRODZE CHEMICZNEJ

1. duża trwałość, mały wpływ środowiska zewnętrznego (+)

2. oddalenie enzymu od nośnika (-), zmniejszenie wpływu dyfuzji (substratu)

3. zmiana właściwości immobilizowanego katalizatora (+/-)

INKLUZJA W ŻELU/BŁONACH PÓŁPRZEPUSZCZALNYCH

monomer polimer

Efektywność immobilizacji na drodze inkluzji

zawartość enzymu charakter polimerycznej matrycy

w żelu (+kopolimer)

rozmiary porów w żelu

(skład sieciujący) rozmiary cząsteczek żelu

Polimeryzacja – połączenie się cząsteczek monomeru w proste lub rozgałęzione polimery.
Zachodzi samorzutnie lub/z dodatkiem kopolimeru, który pomaga
w polimeryzacji np. skrobia

Stężenie i jakość monomeru i kopolimeru > wpływają na polimeryzację (zwarty polimer,
ale nie za bardzo, bo substrat nie dotrze
do wnętrza polimeru)

MIKROKAPSUŁKOWANIE

Roztwór enzymu + eter dietylowy (emulgator) + monomer eterowy roztwór polimeru np. azotan celulozy

Po zetknięciu z powierzchnię zemulgowanych kropelek nierozpuszczalnych w wodzie – monomer polimeryzuje tworząc cienką warstewkę

Stężenie emulgatora wpływa na ∅ kapsułki:

• małe utrudniają transport S/P

• duże ulegają destrukcji

Wielkość porów polimeru decyduje o transporcie substancji i produktu – małe utrudniają.

ZAMKNIĘCIE WE WŁÓKNACH

Roztwór enzymu w organicznym roztworze monomeru, który polimeryzując tworzy włókno pochodne celulozy, polichlorek winylu, poli-L-metyloglutaminian

Dysze przytłaczające roztwór do cieczy organicznych (np. toluen), w której następuje polimeryzacja.

Rola kopolimeru:

• wiązanie pośrednie z monomerami

• stwarza środowisko, które ułatwia łączenie się z monomerami

SIECIOWANIE np. aldehyd glutarowy

• wiąże się po grupach –NH₃

• reaguje z grupami aminowymi

• łapie grupy NH₃ i łączy je z grupami enzymu

• najprostsza metoda – jeżeli enzym jest aktywny

OZNACZENIA PO IMMOBILIZACJI – BADANIE PARAMETRÓW

• wydajność wiązania

ile enzymu się związało w stosunku do masy enzymu, która podaliśmy – metoda Lowry’ego – zadawalająca ≥ 70%

• aktywność enzymu po immobilizacji

porównuje się z aktywnością enzymu natywnego, wyrażana w g lub molach białka (jak aktywny jest g białka) np. amylazy hydroliza skrobi aktywność > 50%

• stabilność aktywności preparatu

powtarza się co pewien czas h/24h/miesiąc, test na aktywność, spadający procent aktywności w czasie

• czas połowicznego zaniku

+ uniwersalność względem enzymów komórki (systemy wieloenzymatyczne)

+ wysoka odporność preparatów (chemiczna, termiczna, mechaniczna)

+ wysoka odporność na zakażenia mikrobiologiczne (decyduje porowatość)

• utrudniona dyfuzja substratów- pobiera substancje wielkocząsteczkowe

Inkluzja pozwala na przeprowadzenie procesu z wieloma cząsteczkami enzymu róznych np. hydroliza skrobi wymaga 3 enzymów