Bioreaktor techniki separacji katalizatory, substratu nieprzereagowane

Ilość kroków separacji to ilość reagentów.

5 reagentów to 4 różne metody separacji. Wytrącanie lub zawrócenie do reaktora na koniec procesu.

SEPERACJE BIOPRODUKTÓW

Izolacja biokatalizatora Izolacja produktu

w drugiej fazie

enzymu natywnego (połączenie reakcji

(rozpuszczony w roztworze) z ekstrakcją)

w postaci precypitatu

mikroorganizmów (kryształki, miał)

enzymu immobilizowanego

(stały preparat) rozpuszczony lub zawieszony w roztworze

W hodowli

- wydzielony z komórek do medium hodowlanego

(rozpuszczony precypitat)

- związany ze ścianą komórkową

(wcześniej rozerwanie komórki)

- gromadzony w komórkach

- charakter mieszany

PRZY DOBORZE METODY OCZYSZCZANIA BIOPRODUKTÓW NALEŻY UWZGLĘDNIĆ JEGO:

1. Wymagany stopień oczyszczenia

Im częściej jest przyjmowana większa dawka np. hormonów, czystość tego związku musi być czystsza. Jeżeli jest to szczepionka – nie musi być tak czyszczony dokładnie.

I tak: - diagnostyka in vitro - dawka 100 mg czystość 95%

- szczepionka – 1g – 99%

- antybiotyk 3g – 99,9%

- enzym - 99,99%

- hormon >10g – 99,999%

1. Właściwości

• reaktywność

• charakter jonowy

• polarność

• hydrofobowość

1. Wrażliwość na warunki fizyczne

• temperaturę

• pH

• siłę jonową

1. Lokalizacja

Konieczna jeśli jest to hodowla mikroorganizmów.

Jeżeli dany produkt znajduję się wewnątrz komórki mikroorganizmu, proces separacji poprzedzony jest rozerwaniem komórki.

ROZRYWANIE KOMÓREK

1. Metody mechaniczne

• zastosowanie fal ultradźwiękowych

• mielenie i wytrząsanie komórek

• nagła zmiana ciśnienia w układzie (do 100 atm.)

1. Metody łączone

• chemiczna lub biologiczna destrukcja ściany komórkowej

• fizyczne rozerwanie błony komórkowej

METODY ŁĄCZONE – DESTRUKCJA ŚCIANY KOMÓRKOWEJ

• zastosowanie środków chemicznych (detergentów, alkaliów, rozpuszczalników organicznych)

• wykorzystanie enzymów hydrolizujących wiązanie pomiędzy związkami tworzącymi ścianę komórkową (ułatwić to można poprzez zmutowanie ściany komórkowej, poprzez wzrost hodowli np. w obecności jonów Mg, antybiotyków penicyliny, cykloseryny)

Te środki chemiczne dodawane po zabiciu, nie mogą wpływać tylko na produkt.

Jony Mg muszą dobrze działać na hodowlę.

Związek dodawany do hodowli – mający na celu osłabić ścianę komórkową:

• DAD – kwas dwuaminopimelinowy

• G-N – acetyloglukozamina

• M-kwas-N-acetylomuraminowy

G – M – G

Ala – Glu – DAD – Ala

pentapeptyd

Lys – Glu – DAD – Ala

G – M - G

Destrukcja ściany komórkowej poprzez:

• wiązanie pomiędzy M-G endoacetylomuramidazy

• wiązanie pomiędzy G-M anedoacetyloglukoamidazy i egzaacetyloglukoamidazy

• wiązanie pomiędzy M – Ala – amidazy acetylomuramylo-L-alaniny

• pomiędzy resztami aminokwasowymi pentapeptydu – peptydazy

Metody łączone – rozerwanie błony komórkowej

• nagłe obniżenie ciśnienia (naprężenie fizyczne)

• nagła zmiana temperatury (szok osmotyczny)

Ważna tabelka!!!

UKŁADY HETEROGENICZNE
Układ makrodyspersyjny
Układ mikrodyspersyjny
UKŁADY HOMOGENICZNE
Układ koloidalny
Roztwory molekularne
Roztwory jonowe

UKŁAD MAKRODYSPERSYJNY

1. zawiesina, ciało stałe-ciecz (te same cząstki, różne rozmiary)

• Komórki mikroorganizmów

• Nośniki ziarniste z immobilizowanych katalizatorem (enzymy na granulkach)

• Struktury żelowate z enzymem w okluzji (enzym usieciowany przez aldehyd glutarowy)

• Kryształy (osad) reagentu = precypitat

1. Emulsja, ciecz-ciecz (dwie fazy, różna dyspersja; jedna ciecz jest oleista, nie zawsze ta zemulgowana jest oleistą)

• Substraty oleiste – enzym działa jako katalizator, jak i jako emulgator lipazy
  (rzadko esterazy); działają na granicy faz

• Dodatek rozpuszczalników organicznych dla hydrofobowych substratów (lipazy, proteazy, oksydazy) – rozbudowana powierzchnia do aktywacji lipaz

Układy heterogeniczne Układy homogeniczne

• filtracja – destylacja

• wirowanie – ekstrakcja procesy dyfuzyjne

• sedymentacja – sorpcja

• flotacja

TECHNIKI SEPARACJI

dodatkowe procesy jednostkowe

różnica ciśnień Δp	różnica stężeń ΔC
rozpuszczanie selektywne koagulacja dla koloidów poł. się cząst. flokulacja i odseparowanie ty koloidów	zatężanie krystalizacja precypitacja suszenie

• Siła napędowa to różnica ciśnień dla heterogenicznego układu; wyjątek: nanofiltracja (homogen)

• Siła napędowa to różnica stężeń dla homogenicznego układu

• Proces dyfuzji: ciecz-ciecz, ciecz-nośnik (adsorpcja), ciecz-para

• Procesy membranowe – nanofiltracja

ETAPY OCZYSZCZANIA

Etap 1

Separacja związków, które nie są rozpuszczone

• komórek

• pozostałości komórkowych

• agregatów białkowych

• nie rozpuszczalnych w wodzie reagentów

  • sedymentacja

  • wirowanie

  • filtracja

  • flokulacja

Etap 2

Izolacja i koncentracja

Izolacja pożądanego produktu od ogólnie pojętych zanieczyszczeń

• wytrącanie

• destylacja

• ekstrakcja

• ciśnieniowe procesy membranowe

Etap 3

Oczyszczanie główne

Bardziej selektywne aniżeli izolacja, uwzględnia się właściwości fizyko-chemiczne poszczególnych reagentów

• frakcjonowane wytrącanie

• chromatografia

Etap 4

Końcowe doczyszczanie

Dotyczy gównie substancji wykorzystywanych w medycynie

• krystalizacja

• suszenie

• liofilizacja

PRODUKCJA PENICYLINY (Penicillum chrysogenum)

Penicylina wydzielana z przesączu hodowlanego, czyli etap 1 – oddzielanie grzybni (filtracja)

Bioreaktor

1. namnażanie grzybni

2. hodowla posiewowa

3. hodowla produkcyjna

Praca z roztworem w układzie homogenicznym

1. filtracja

2. ekstrakcja np. octanem butylu

3. precypitacja po dodaniu octanu potasu

4. filtracja

5. rozpuszczanie w alkoholu izopropylowym

6. krystalizacja

7. filtracja

8. suszenie

9. PENICYLINA

Pozostałości to np. bulion spożywczy

Penicylina ma dobry współczynnik podziału woda/octan butylu

Heterogeniczny układ potem homo potem ponownie hetero (po precypitacji), dalej filtracja, żeby pozbyć się związków innych. Końcowy etap – przejście do postaci sypkiej od krystalizacji

Koszty produkcji penicyliny

Operacja:

Fermentacja - 50%

Filtracja - 5%

Ekstrakcja - 25%

Krystalizacja - 10%

Suszenie - 10%

PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO (Aspergillus Niger)

Produkt znajduje się głównie w płynie pohodowlanym, ale także w ok. 15% grzybni, stąd etap 1 – przemywanie i wyciskanie grzybni

grzybnia

płyn pohodowlany filtracja przemywanie i wyciskanie grzybni

filtrat

osad precypitacja szczawianu

przez dodanie Ca(OH)­₂

wytrącanie cytrynianu filtracja

poprzez dodanie Ca(OH)₂

przesącz filtracja rozpuszczanie w H₂SO₄

filtracja

osad

przesącz sorpcja

jonity

krystalizacja KWAS CYTRYNOWY

- procesy prowadzone w bioreaktorze

- praca z roztworem w układzie homogenicznym

Koszty produkcji kwasu cytrynowego: fermentacja 40%, oczyszczanie 60%