Dominika Nynek

W-7 Ochrona Środowiska

Nr albumu: 186490

MIKROBIOLOGIA

SPRAWOZDANIE z ćw. nr 4 i 5.

Sterylizacja i dezynfekcja

1. Cel ćwiczenia.

Zaznajomienie się z podstawowymi metodami wyjaławiania i ich skutecznością, takimi jak: sterylizacja za pomocą pary wodnej pod ciśnieniem, budową autoklawu, różnicami pomiędzy sterylizacją a dezynsekcją, podstawowymi grupami związków używanych do dezynfekcji i ich działaniem. Zapoznanie się ze sposobem określania skuteczności środka dezynfekującego w zależności od jego stężeń – przybliżenie metody współczynnika fenolowego. Poznanie wpływu promieniowania UV na drobnoustroje.

1. Cześć doświadczalna

   1. Mikrobiologiczna kontrola skuteczności sterylizacji parą wodną w autoklawie - zadanie 1

W ćwiczeniu określa się skuteczność sterylizacji na przykładzie wybranego szczepu zarodników laseczek bakterii Bacillus naniesionych na specjalnie przygotowane, krążki, po przez namaczanie ich w zawiesinie owych mikroorganizmów, nazywane sporalami A. Następnie sporale A poddaje się sterylizacji parą wodną, po czym umieszcza się je w wcześniej przygotowanym bulionie i pozostawia do inkubacji na 7 dni.

1. Wyniki

W próbie kontrolnej gdzie nie zastosowano sterylizacji pojawiło się zmętnienie a w bulionie, w którym umieszczono sporal A poddany sterylizacji bulion był klarowny.

1. Wnioski

Na podstawie otrzymanych wyników można potwierdzić skuteczność wyjaławiania w autoklawie. Gdyż nie rozwinęły się laseczki bakterii Bacillus z zarodników. Ćwiczenie pozwalało na określenie jak dobrze pracuje konkretny autoklaw – zatem użyte urządzenie jest sprawne i dobrze pracuje.

1. Mikrobiologiczna kontrola skuteczności sterylizacji w suchym gorącym powietrzu - zadanie 2

Podobnie jak w zadaniu pierwszym określa się skuteczność sterylizacji z użyciem konkretnego szczepu z rodzaju Bacillus z użyciem nasiąkniętym zawiesiną krążkiem – sporalem B. Badając efektywność tej techniki wyjaławiania poddaje się krążek z zawiesiną wysokim temperaturom równocześnie takie podgrzane, suche powietrze ma właściwości wysuszające. Następnie tak spreparowane próby umieszcza się w przygotowanym wcześniej bulionie i pozostawia do inkubacji na okres 7 dni.

1. Wyniki

Próba z sporalem B, poddanym sterylizacji suchym gorącym powietrzem po czym umieszczonym w bulionie jest klarowna. Zaś próba bulion w próbie kontrolnej zmętniał.

1. Wnioski

Na podstawie obserwacji przejrzystości bulionu można było określić bytowanie bakterii w bulionie. Zatem zmętniony płyn oznaczał pojawienie się rozwijających się bakterii a klarowny ich brak. Taki rodzaj doświadczenia pozwala na określenie skuteczności i jakości pracy urządzenia użytego do oczyszczenia. Zatem, skoro nie wyrosły bakterie z sporalu B na pożywce, suszarka użyta do sterylizacji jest urządzeniem pozwalającym skutecznie oczyścić przedmioty oporne na działanie wysokich temperatur. Całość świadczy o prawidłowej pracy użytej suszarki.

1. Zapoznanie się z podstawowym sprzętem służącym do sterylizacji - zadanie 3

Ćwiczenie polegało na obserwacji i poznaniu urządzeń wykorzystywanych do sterylizacji, podstawowych zasad ostrożności przy obsłudze i zasad ich działania oraz podstawowych elementów konstrukcyjnych.

1. Wyniki – adnotacje dotyczące budowy i działania autoklawu oraz suszarki

1. Autoklaw – to urządzenie służące do wyjaławiania, w którym medium jest para wodna. Dzięki poddaniu pary wysokiemu ciśnieniu uzyskuje się duże temperatury pary wodnej – dochodzące do 121,6° C przy zwiększeniu ciśnienia do 1 atmosfery. Autoklaw składa się wykonanego z grubej blachy dwuściennego kotła zamykanego na szczelną, ciężką pokrywę, termometru, manometru i zaworu bezpieczeństwa. Woda wykorzystana w maszynie jest podgrzewana przez grzałkę, a utworzona w ten sposób para wodna wypycha powietrze przez otwarty wypust. Dzięki czemu może zadziałać automatyczny mechanizm zamknięcia. Cały cykl pracy urządzenia składa się na usuwanie starego powietrza, doprowadzenie pary do komory, właściwe wyjałowienie trwające około 20 minut i ostateczne, końcowe schładzanie. Zatem całość trwa zazwyczaj około godziny i czterdziestu minut. Zaś gdyby dać do sterylizacji kilogram ziemi lub zwinięty w kulę fartuch laboratoryjny nie zostałaby dokonana skuteczna sterylizacja gdyż para wodna nie dotarłaby do wszystkich szczelin i zakamarków. W przypadku fartucha należałoby zwiększyć ciśnienie lub wydłużyć czas pracy autoklawu. Z kolej w przypadku ziemi trzeba byłoby ją rozdzielić na mniejsze frakcje.

2. Suszarka – urządzenie przypominające zwykły domowy piekarnik w zależności od rodzaju suszarki różna jest jej praca. Łączy się to z czasem pracy powiązanym z wysokością temperatury, ilością załadunku, czasem nagrzania i oziębienia suszarki. Wyróżnia się suszarki wyposażone w wentylatory i sterylizatory bez wymuszanego obiegu – stare modele. W suszarkach bez wentylacji czas pracy jest dłuższy niż tych nowszych. Na przykład w suszarkach z wentylatorem czas wystawienia materiału poddawanego jałowieniu przy temperaturze 160° C to jedna godzina – pełny cykl wynosi około dwie i pół godziny. Z kolei dla tego samego urządzania czas ekspozycji skraca się do pół godziny przy nastawieniu temperatury na 180° C . Zaś w suszarkach bez wymuszonego obiegu czas ekspozycji wynosi od godziny i czterdziestu minut do dwóch godzin, a całkowity czas pracy zamyka się po okresie kilku godzin.

Przy tym rodzaju sterylizacji wymagane jest zabezpieczanie przedmiotów przez opakowanie papierem lub aluminiową folią

1. Wnioski

Są różne rodzaje autoklawów różniące się pojemnością bębna kotła, długością pracy i stopniem zautomatyzowania a nawet sposobem ułożenia materiału poddawanemu procesowi jałowienia – pionowy lub poziomy. Lecz sama obsługa mimo prostoty, wymaga doświadczenia, gdyż przy pewnych błędach i przypadkach zawodności technologii można doprowadzi do przedwczesnego otwarcia pokrywy i uwolnieniu pary wodnej pod wysokim ciśnieniem. Ryzyko poparzenia jest mniejsze w autoklawie przy pionowym wylocie, gdyż uwolniona para skieruję się w stronę sufitu. Jednak nadal grozi niebezpieczeństwo osobie obsługującej. Także ryzyko związane jest z otwieraniem pojemników zawierających roztwory. Niewielkie kolby zostaną ochłodzone, lecz otwierając zaraz po wyjęciu z autoklawu wielkie, oziębiające się powoli butle można doprowadzić do uwolnienia z nich pary znajdującej się pod wysokim ciśnieniem w wyniku czego może dojść do poparzeń.

Zaś sterylizacja za pomocą suszarkami znacznie różni się od jałowienia autoklawem przede wszystkim tym, że stosuje się suche ogrzane powietrze do o wiele większych temperatur niż w autoklawie, gdyż są to temperatury z zakresu 140 - 180° C. Natomiast powietrze jest pod ciśnieniem otoczenia. Zatem nie istnieje ryzyko wyrzucenia ogrzanego powierza jednak to nie znaczy, że nie należy zastosować środków ostrożności.

1. Badanie skuteczności działania wybranych środków dezynfekcyjnych – zadanie 4

Zadanie polegało na sprawdzeniu skuteczności wybranych środków dezynfekcyjnych po przez przemywanie kolejnymi środkami palców. Użyte środki to mydło, alkohol i H₂O₂ Następnie przykładano opuszki w celu naniesienia ewentualnych drobnoustrojów na pożywkę agarową w kolejnych wydzielonych sektorach szalki Petriego. Potem, po siedmiodniowej inkubacji, obserwowano ilość rozrosłych kolonii i określano ich morfologie. Wyniki badań przedstawiono po niżej.

1. Wyniki

Na pierwszym obszarze – próba kontrolna, zauważono wystąpienie jednej kolonii pleśni o kolorze czarnym oraz dziesięć kolonii bakterii. Jedna z kolonii miała kształt nieregularny, brzeg postrzępiony, powierzchnie nitkowatą, wzniesienie stożkowate i kolor beżowo - kremowym. Zaś pozostałe kolonie miały kształt okrągły, wzniesienie wypukłe, brzeg równy a powierzchnię gładką. Część powyższych kolonii była biała a reszta żółta.

W kolejnym sektorze – drugim gdzie zastosowano mycie mydłem stwierdzono brak kolonii beżowo – kremowej i pleśni. Jednak zmieniła się liczebność kolonii a nawet pojawiła się nowa różniąca się od żółtych i białych tylko kolorem, gdyż była to kolonia o kolorze różowym. W sumie stwierdzono około 35 skupisk.

W trzecim obszarze pozostały już tylko kolonie bakterii żółtych i białych a łączna ich ilość wyniosła około trzydziestu.

Na ostatnim sektorze – czwartym zaobserwowano już tylko i wyłącznie jedną kolonię białą i jedną żółtą.

1. Wnioski

Stwierdzone różnice pomiędzy kolejnymi sektorami świadczą o skuteczności zastosowanego środka. Zatem najskuteczniejszym środkiem jest woda utleniona. Alkohol oczyszcza tylko z grzybów i części bakterii a w mydle pojawiło się zanieczyszczenie przez poprzedniego użytkownika w postaci nowego rodzaju bakterii. Wynika z tego że mycie mydłem radykalnie nie usunęło wszystkie drobnoustroje z powierzchni palca. Należałoby przede wszystkim uniknąć kontaktu różnych osób z tym samym mydłem, aby ograniczyć przenoszenie cudzych drobnoustrojów. Jednak mycie mydłem rąk ma znaczenie higieniczne, gdyż usuwa częściowo drobnoustroje przejściowe (luźno związane ze skórą nie zdolne do namnażania się i przebywania przez dłuższy czas na powierzchni skóry), kiedy nie jest wymagana określona redukcja liczby mikroorganizmów. Środki dezynfekcyjne takie jak np. H₂O₂ w istocie są skuteczniejsze od mydła w eliminacji drobnoustrojów to jednak nie usuwają substancji organicznych i brudu ze skóry. Natomiast takie zanieczyszczenia osłabiają właściwości bakteriobójcze przykładowej wody utlenionej, ponieważ chronią mikroorganizmy stwarzając barierę między środkiem a drobnoustrojami.

1. Oznaczanie współczynnika fenolowego – zadanie 5

Wyznaczając współczynnik fenolowy, można uzyskać informacje o skuteczności środka dezynfekcyjnego. W tym celu należało uzyskać różne stężenia badanego 4 % Virkon poczynając od dodania 2 ml roztworu do probówek pobierając z jednej i dodając do drugiej probówki. Do tak rozcieńczonego środka dodawano 0,2 ml roztworu z zawiesiną bakterii E. coli. Następnie przygotowany materiał przeniesiono ezą do bulionu i pozostawiono do inkubacji.

1. Wyniki

Nazwa środka dezynfekcyjnego
Lp.
1
2
3
4
5
6

• Współczynnik fenolowy

$$WF = \frac{najwieksze\ rozcienczenie\ badanego\ zwiazku\ zabijacego\ bakterie}{najwieksze\ rozcienczenie\ fenolu\ zabijacego\ bakterie}$$

- w przypadku zastosowania stężeń zamiast rozcieńczeń wzór zostanie przekształcony do postaci:

$$WF = \frac{najwieksze\ stezenie\ fenolu\ zabijacego\ bakterie}{najwieksze\ rozcienczenie\ badanego\ zwiazku\ zabijacego\ bakterie}$$

• Virkon

$$WF = \frac{2\%}{0,5\%} = 4$$

• Domestos

$$WF = \frac{2\%}{1\%} = 2$$

• Ludwik

$$WF = \frac{2\%}{4\%} = 0,5$$

1. Wnioski

Już na etapie opracowania tabeli można było zauważyć, że najbardziej skutecznym środkiem dezynfekcyjnym jest Virkon, co potwierdzają przedstawione obliczenia. Gdyż nie trzeba dużego stężenia by ów związek był bakteriobójczy. W pozostałych specyfikach by osiągnąć zamierzone skutki oczyszczenia należy stosować niewielkie rozcieńczenia.

1. Badanie skuteczności działania promieniowania ultrafioletowego na drobnoustroje obecne w powietrzu – zadanie 6

Przygotowane szalki Petriego z pożywką agarową i Sabourauda wystawiono otwarte na powietrze przed i po zastosowaniu promieniowania UV. W ten sposób unoszące się w powietrzu zarodniki drobnoustrojów mogły osiadać na odżywce po przez grawitacyjne opadanie. Jeden rodzaj pożywki (agar odżywczy) przeznaczony jest głównie do hodowli bakterii zaś drugi (Sabourauda) do hodowli grzybów. Wyniki po siedmiodniowej inkubacji zestawiono w tabeli.

1. Wyniki

Czas poboru próby	Liczba kolonii grzybów/ płytka	Udział procentowy [%]	Liczba kolonii bakterii/ płytka	Udział procentowy [%]
Przed sterylizacją promieniami UV	6,7,4,7	22,86	7,19,13,17	53,33
	Średnia=6		Średnia=14
Po sterylizacji promieniami UV	5,0,3,0	7,62	1,8,6,3	16,19
	Średnia=2		Średnia=4,25

1. Wnioski

Z danych zestawionych w tabeli wynika, że skuteczność promieniami UV nie jest duża, gdyż ginie mniej niż 50% drobnoustrojów. Zależy to od wielu czynników: ilości unoszących się cząstek mechanicznych w powietrzu, objętości powietrza poddawanego promieniowaniu, intensywności ruchów powietrza, długości emitowanych fal, przy czym najsilniejsze działanie przeciwbakteryjne mają długości fal w zakresie 240- 260 nm. Także wpływ ma czas napromieniowania (w doświadczeniu napromieniowano powietrze przez 30 minut), bezpośredniość padania promieniowania, wilgotność powietrza i odległość na jaką działają promienie. Dlatego też w tym ćwiczeniu mogło pod wpływem źle dobranych warunków dojść do obniżenia skuteczności tej metody dezynfekcji. Różne gatunki i formy drobnoustrojów są w odmiennym stopniu wrażliwe na promieniowanie nadfioletowe. Porównując wyniki między grzybami a bakteriami, można zauważyć, iż bardziej podatne na ten rodzaj dezynfekcji są grzyby, ponieważ ginie ich więcej niż bakterii.

1. Badanie skuteczności filtracji – zadanie 7

Proces filtracji służy do mechanicznego zatrzymania drobnoustrojów na filtrze w celu oczyszczenia płynów zawierających składniki wrażliwe na czynniki fizyczne. Dzięki tej metodzie możliwe jest oddzielenie płynu od form zarówno wegetatywnych jak i przetrwalnych, a także martwych komórek oraz ich części. W doświadczeniu użyto do filtracji sączka membranowego. Ze względu na małe pory staje się konieczne zastosowania podciśnienia w filtrze by przesączyć płyn, ponieważ siły ciężkości nie pozwalają już na opadanie filtratu. Dlatego też po połączeniu wszystkich elementów urządzenia podłączono pompkę wodną. Po wlaniu wody przeznaczonej do filtracji pobrano przesącz i posiano do probówki z bulionem. Jednak wcześniej pobrano wodę przed filtracją w celu porównania. Natomiast wykorzystany sączek włożono do szaliki Petriego. Wszystkie próby pozostawiono do inkubacji.

1. Wyniki

W próbie na skuteczność filtracji stwierdzono, że w obu probówkach buliony były zmętniałe, a na filtrze membranowym, umieszczonym w szalce Petriego, zauważono bardzo dużą liczebność kolonii drobnoustrojów. Dlatego staje się niemożliwe policzenie ich.

1. Wnioski

Uzyskany wynik nie doczyszczenia przesączu w probówce jest spowodowany nieszczelnością filtra. Nieszczelność ta powstała przez złapanie sączka membranowego zbyt gorącą pesetą, co spowodowało powstanie wypalonej w nim dziury na brzegu. Z kolei tak liczne kolonie wyrosłe w szalce Petriego świadczą o dużym stopniu zanieczyszczenia użytej wody.