TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

Ćwiczenie nr IV
Przygotowanie insertu EcRDBD do klonowania (generowanie miejsc restrykcyjnych BamHI)- reakcja PCR.
Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania- elektroforetyczna analiza plazmidowego DNA oczyszczonego po trawieniu i de fosforylacji oraz szacowanie jego stężenia.
Elektroforeza analityczna produktów PCR.
Izolacja produktów PCR.

1.Przygotowanie insertu EcRDBD do klonowania (generowanie miejsc restrykcyjnych BamHI)- reakcja PCR.

- przygotowanie kontroli oraz mieszaniny reakcyjnej do reakcji PCR

a)Mieszaniene reakcyjną do reakcji PCR(dla 1grupy) przygotowano w ependorfce. Dodawana kolejno:
- wody 24,7µl
-buforu dla polimerazy 5µl (10x)
- nukleotydy dNTP 8µl
-starter WR5 4,1 µl
- starter WR6 4,2 µl
- matryce pBS-EcR zlinearyzowany przez EcoRI 3µl (stężenie matrycy 5ng/µl)

b)Mieszaniene kontrolną do reakcji PCR przygotowano w drugiej ependorfce. Dodawana kolejno:
- wody 27,7µl
-buforu dla polimerazy 5µl (10x)
- nukleotydy dNTP 8µl
-starter WR5 4,1 µl
- starter WR6 4,2 µl

c)W celu zapobiegnięcia parowaniu mieszanin reakcyjnych na powierzchnię nałożono 50µl oleju parafinowego. Tak przygotowane mieszaniny dajemy do PCRówki. Nastawiamy program reakcji PCR.

Rys. Schemat programu PCR na podstawie instrukcji do ćwiczenia nr. 4 z inżynierii genetycznej

d)Polimerazę 1µl dodajemy do mieszanin reakcyjnych po 300s reakcji PCR po tzw. „gorącym starcie” reakcji. Następnie reakcja PCR została przeprowadzona według powyższego schematu.

2.Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania- elektroforetyczna analiza plazmidowego DNA oczyszczonego po trawieniu i defosforylacji oraz szacowanie jego stężenia.

a) przygotowano próbke do elektroforezy:
3µl roztworu plazmidowego DNA po oczyszczeniu
5µl TE
2µl 6x buforu do próbek

b)Tak przygotowaną próbkę oraz marker wagowy FastRuler ^TM DNA Ladder, Middle Range,(MBI Fermentas)naniesiono na studzienki w żelu.

c)Elektroforezę prowadzono przy stałym napięciu 70V, przez ok. 30min.

d)Żel analizowano przy fali 254nm.

3.Elektroforeza analityczna produktów PCR.

Po przeprowadzeniu reakcji PCR przygotowano próbke do elektroforezy.
a)Do ependorfki dodawano kolejno:
- 5µl próbki po PCR( pobrano spod oleju)
- 5µl TE
- 2µl 6xSB

b)Przygotowanie próbki kontrolnej. Do ependorfki dodawano kolejno:
- 5µl próbki po PCR( pobrano spod oleju)
- 5µl TE
- 2µl 6xSB

c)Na studzienki w żelu naniesiono przygotowane próbki oraz 5µl markera wagowego FastRuler ^TM DNA Ladder, Middle Range,(MBI Fermentas)

d)Elektroforezę prowadzono przy stałym napięciu 70V przez 30min.

d)Pozostałą ilość mieszaniny po rekacji PCR(43µl) pobrano spod oleju prafinowego i umieszczono w suchej i czystej oraz podpisanej ependorfce.

4.Izolacja produktów PCR. (protokół Clean-up)

1. Do 45µl roztworu dodano 225µl roztworu b.

2. Otrzymaną mieszaninę naniesiono na kolumnę do oczyszczania DNA, wirowano przez 30 sekund przy około 10000g.

3. Supernatant odrzucono, kolumnę umieszczono w czystej Eppendorfce, dodano 600µl roztworu A1 i wirowano przez 30 sekund przy około 10000g.

4. Supernatant odrzucono, kolumnę umieszczono w czystej Eppendorfce, dodano 300µl roztworu A1 i wirowano przez 30 sekund przy około 10000g.

5. Supernatant odrzucono, kolumnę umieszczono w czystej Eppendorfce i inkubowano przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.

6. Osuszono kolumnę przez szybkie odwirowanie, umieszczono w podpisanej odpowiednio Eppendorfce i na złoże naniesiono 30µl buforu TE.

7. Pozostawiono do inkubacji na 3 minuty w temperaturze pokojowej.

8. Wirowano przez minutę przy około 10000g.

9. Przesącz, który pozyskano, zawierał DNA w objętości 29,2 µl.

10. Tak oczyszczony preparat, przechowywano w buforze TE w temperaturze -20°C.

Wyniki:

Elektroforeza zlinearyzowanego wektora pGEX-2T po oczyszczeniu zestawem Gel-Out

Pierwsza próbka jest markerem, która zawiera fragmenty DNA o konkretnej długości (5000, 2000, 850 pz).

Następne są próbki wszystkich grup, z oczyszczonymi plazmidami po wcześniejszej inkubacji z mieszaninami restrykcyjnymi.

Naszą próbką jest próbka nr. 6

Elektroforeza produktów PCR

Pierwsza próbka jest markerem, która zawiera fragmenty DNA o konkretnej długości (5000, 2000, 850, 400, 100 pz).

Następne są próbki wszystkich grup, z plazmidami inkubowanymi z mieszaninami restrykcyjnymi.
Naszą próbką jest próbka nr. 6
Ostatnia próbka to kontrola, która nie zawierała matrycy do reakcji PCR.

Wynik ilościowej analizy densytometrycznej wykonanej programem Image Lab 3.0 (Bio-Rad):

$$C_{w} = \frac{X_{\text{ng}}}{V_{\mu l}} = \ \frac{{1,7}_{\text{ng}}}{3_{\mu l}} = 0,57\frac{\text{ng}}{\mu l}$$

WNIOSKI:

-Rozdział elektroforetyczny zlinearyzowanego wektora pGEX-2T po oczyszczeniu zestawem Gel-Out wskazuje, że elucja DNA z żelu agarozowego przebiegła pomyślnie. Otrzymany prążek odpowiada odpowiadającemu fragmentowi DNA o długości 5000pz. Z jego intensywności oszacowano jego masę (1,7 ng). Dzięki czemu możemy oznaczyć stężenie plazmidu, które wynosi 0,57 ng/µl.

- Elektroforeza rozdziela fragmenty DNA w zależności od ich masy. Ruchliwość jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczki. Elektroforeza na żelu agarozowym jest mniej dokładna niż elektroforeza na żelu poliakrylamidowym, dlatego pomimo plazmidu krótszego o 50pz (pGEX – 2T ma 4948pz), daje on taki sam sygnał co odcinek o dlugości 5000pz.

- Po reakcj i PCR otrzymano 43µl mieszaniny z czego 5µ pobrano do elektroforezy. Pozostałą część przeniesiono do czystej podpisanej ependorfi i przechowywano w -20°C.

- Elektroforeza produktów PCR potwierdziła poprawność wykonania powielenia. Obecność jednego prążka świadczy o powstaniu jednego rodzaju kopii interesującego nas fragmentu. Długość naszego insertu to niecałe 400pz.

Bibliografia:

- Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., Biochemia, Warszawa, PWN, 2009