Aleksandra Gatlik, Jan Idzik 04.01.2010

Biotechnologia, wydział: AEiI

gr. dziekańska: Aut2

sekcja: 11

Sprawozdanie z ćwiczeń: 4,5,6

z dnia: 17.11, 1.12, 15.12. 2009r.

CZĘŚĆ I – ćw. 4 - 17.11.2009

Izolacja plazmidu do klonowania z wykorzystaniem zestawów
do izolacji DNA (miniliza), trawienie i elektroforeza plazmidu.

Celem ćwiczenia jest wyodrębnienie plazmidowego DNA, przeznaczonego do klonowania, z hodowli bakteryjnych za pomocą lizy alkalicznej.

Metoda lizy alkalicznej służy do izolacji DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych. Metoda ta pozwala na otrzymanie dobrze oczyszczonego materiału.

W pierwszej kolejności zachodzi liza komórek bakteryjnych, denaturacja białek, oraz DNA. W drugim etapie niechciane cząstki komórki są strącane, a w roztworze pozostają cząsteczki plazmidów. Metoda, podczas oddzielania DNA plazmidowego, wykorzystuje różnicę w zdolności do renaturacji plazmidów i chromosomu bakteryjnego. To pierwsze ulega szybkiej renaturacji po usunięciu czynnika denaturującego (w tym wypadku zneutralizowaniu alkalicznego pH) i jest to trzeci etap procedury.

Metoda jest szybka i prosta w wykonaniu, przez co stała się popularnym sposobem uzyskiwania oczyszczonego plazmidu z komórek bakteryjnych.

1. PRZEBIEG ĆWICZENIA:

• otrzymaną od prowadzącego hodowlę bakterii E. Coli zawieszono w 200μl roztworu L1 ( służącego do do zawieszania bakterii; skład: 50 mM Tris:HCl, pH 8.0; 10 mM EDTA; 100 ug/ml RNaza A)

• następnie wprowadzono 200 μl roztworu L2 służącego do lizy bakterii (0.2 M NaOH; 10% SDS) i całość delikatnie wymieszano

• na 3 minuty próbkę pozostawiono w temperaturze pokojowej

• dodano 400 μl zobojętniającego środowisko i wytrącającego DNA chromosomowe i białka roztworu GL3(3 M CH₃COOK; 5% CH₃COOH; 8 M chlorowodorek guanidyny). Całość wymieszano a następnie odwirowano (10 minut, maksymalne obroty)

• zebrany supernatant wprowadzono na kolumnę i całość zwirowano (1 minuta maksymalne obroty)

• przefiltrowaną część odrzucono a kolumnę przepłukano 500 μl roztworu W ponownie wirowano 1 minutę a przefiltrowaną część odrzucono

• kolumnę przemyto 700 μl roztworu A1 wirowano przez 2 minuty i ponownie przefiltrowaną część odrzucono

• kolumnę wprowadzono do nowej próbówki i naniesiono na nią 60 μl H₂O. Po 3 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, odwirowano (1 minuta, maksymalne obroty). Kolumnę odrzucono

• za pomocą spektrofotometru (rozcieńczenie x50) i korzystając ze wzoru:

C [μg/μl] = (A₂₆₀ -A₃₂₀) x rozcieńczenie x 0.05

zmierzono ilość DNA:

A₂₆₀ – A₃₂₀ =0,059
C=0,059*50*0,05
C=0,1475 [μg/μl]

• sporządzono mieszaninę do trawienia plazmidu według następujących proporcji:

  • 3,5 μl DNA (Z proporcji wyliczono, że do mieszaniny do trawienia należy dodać 3,5 µl roztworu DNA tak aby było 0,5 μg)

  • 2 μl 10xbuforu do EcoR1

  • 0,5 μl EcoR1 (dodał prowadzący ćwiczenia)

  • 14 μl H₂O (aby uzupełnić do 20 μl)

• pozostawiono do inkubacji w temperaturze 37⁰C na 1 godzinę

• w tym czasie z naważki agarozy przygotowano i wylano żel (0.8%, 30 ml) i przygotowano preparat DNA nietrawionego:

DNA 1,7 μl + 6,3 μl H₂O + 2 μl buforu LB

• na żel naniesiono DNA nietrawione i strawione EcoR1(10 μl + 2 μl buforu LB)

• elektroforezę prowadzono około 15 minut

• preparaty nietrawionego i trawionego DNA dokładnie podpisano i oddano do zamrożenia aby wykorzystać je na następnych ćwiczeniach.

2. OBSERWACJE I WNIOSKI KOŃCOWE

Ponieważ elektroforeza przebiegała w niewłaściwym kierunku (w stronę bliższego kieszonkom końca żelu, bo ktoś odwrotnie podłączył elektrody lub odwrotnie umieścił żel) a ze zdjęć niewiele widać, nie można stwierdzić czy proces trawienia plazmidu przebiegł zgodnie z oczekiwaniami.

Prawidłowo wykonana elektroforeza powinna dać następujący efekt (fragment zdjęcia z innego źródła):

W pierwszej z przedstawionych kieszonek znajdowało się DNA niestrawione (pojedynczy prążek), w pozostałych trzech DNA strawione. W miejscu naniesienia DNA niestrawionego prążek „powędrował” dalej.

Powodem tego, że nietrawiony DNA plazmidowy porusza się szybciej w żelu są jego mniejsze rozmiary (forma kulista) natomiast trawiony DNA jest
w postaci długiej nici dodatkowo ustawionej prostopadle do kierunku przemieszczania się.

CZĘŚĆ II – ćw. 5 - 2.12.2009

Defosforylacja plazmidu i ligacja plazmidu ze wstawką

Aby otrzymać plazmid zrekombinowany przeprowadza się ligację wektora z fragmentami donorowego DNA. Aby zapobiec cyrkularyzacji wektora przed ligacją można usunąć grupy fosforanowe obecne na końcach 5’ liniowego plazmidu, niezbędne w procesie ligacji, przy użyciu fostatazy.

Po defosforylacji jedynie wektor z dołączoną wstawką może ulec cyrkularyzacji. Reakcja defosforylacji nigdy nie zachodzi ze stuprocentową wydajnością. Ligazy DNA są enzymami łączącymi dwa fragmenty DNA poprzez tworzenie wiązań

fosfodiestrowych między grupą 3’OH deoksyrybozy i grupą fosforanową (5’P) przy

wykorzystaniu energii z hydrolizy ATP.

Po ligacji powstają trzy klasy kolistych cząsteczek: odtworzony pusty wektor, zamknięte w kółko fragmenty donorowego DNA i wektor ze wstawką .

1. PRZEBIEG ĆWICZENIA:

• Do µl 10 DNA pUC19 (w poprzedniej części ćwiczenia trawionego enzymem EcoR1) wprowadzono 10 µl buforu do alkalicznej fosfatazy (50 mM Tris:HCl pH 8.8, 5 mM MgCl₂ oraz 0,5 µl alkalicznej fosfatazy z jelita cielęcia (CIAP))

• Tak przygotowaną mieszaninę zworteksowano, odwirowano a następnie wstawiono do termobloku (37⁰C) na godzinę

• Objętość próbki zmierzono jako 19 µl; w celu dopełnienia do 400µl dodano 381µl wody

• Przeprowadzono odbiałczenie: do próbki wprowadzono 400µl mieszaniny fenol: chloroform, zworteksowano i odwirowano (2 minuty;14000 obr/min). Otrzymano 2 fazy: górną wodną i dolną

• Fazę wodną zebrano i przeniesiono do osobnej próbówki

• Objętość fazy wodnej zmierzono jako 370µl; wprowadzono odpowiednią ilość wody(30µl)

• Dodatkowo dodano 40µl 3M octanu sodu pH 5,2 i 880µl schłodzonego 96% alkoholu etylowego

• Próbówkę włożono do pojemnika z lodem i wstawiono do lodówki na 20 minut; następnie odwirowano w szafie chłodniczej (30 minut; 14000 obr/min)

• Ściągnięto nadsącz z nad niewidocznej warstwy, która zebrała się na jednej ze ścian próbówki. Osad pozostawiono do wysuszenia przez około 15 minut

• Osad rozpuszczono w 10µl wody dejonizowanej

• Na podstawie danych podanych przez Prowadzącego i zawartych w instrukcji obliczono następujący skład mieszaniny reakcyjnej:

Dane:

Plazmid: 2686 pz * 660 [g/mol]= 1772760 [g/mol]
Wstawka: 828 pz* 660[g/mol] = 546480 [g/mol]

Stężenie wstawki: 0,033 µg/µl


jeżeli 1 mol – 1772760 g
to x     moli   –   100 * 10^-9 ng

x= 5,641*10 ^-4 mol  
żeby otrzymać stosunek 5:1:
5,641*10 ^-4   * 5= 2,82*10^-13 mol wstawki

jeżeli 1 mol      – 546480 g
to 2,82*10^-13 mol – x

x= 1,541* 10^-7 g

0,033 µg – 1 µl
0,541 µg –  x

x= 4,67 µl

• 9 µl wody

• 4µl wektora

• 2 µl (2U) buforu do ligacji, ponieważ 1U /1µl ( dodał prowadzący)

• 4 µl Ligazy DNA z faga T4 (dodał prowadzący)

• 4,7µl wstawki

• Sporządzono mieszaninę na podstawie powyższych danych

• Mieszaninę ligacyjną przekazano prowadzącemu (ligacja w temperaturze pokojowej przez noc)

CZĘŚĆ III – ćw. 6 – 15.12.2009

Transformacja bakterii

Transformacja to wprowadzenie DNA do komórek bakterii. Bakterie muszą być odpowiednio przygotowane na przyjęcie DNA – muszą być kompetentne. Najczęściej komórki uzyskują kompetencję między innymi po potraktowaniu jonami wapnia w niskiej temperaturze , a następnie poddaniu szokowi cieplnemu (w temp.37^oC-42^oC).

Wniknięcie DNA do komórki bakteryjnej można również uzyskać przeprowadzając elektroporację, czyli zastosowanie silnego impulsu elektrycznego uszkadzającego błonę komórkową. Po transformacji bakterie wysiewa się na odpowiednie podłoże selekcyjne.

Selekcja opiera się na obecności w wektorze genu markerowego, który nadaje transformatom określony fenotyp, np. oporność na antybiotyk.

Transformanty rosnące na podłożu selekcyjnym będą zawierały pusty wektor albo wektor ze wstawką. Zasada klonowania opiera się na założeniu, że do jednej komórki bakteryjnej wnika tylko jedna cząsteczka plazmidu.

Potomstwo takiego transformanta to klon.

1.PRZEBIEG ĆWICZENIA:

• Wszystkie poniższe czynności wykonano przy zachowaniu wszelkich zasad sterylności

• Do otrzymanej od prowadzącego zawiesiny komórek DH5α dodano 100µl pożywki LB, zworteksowano i całość rozdzielono do 2 próbówek po 50 µl

• Do pierwszej z nich wprowadzono 50µg komórek zawierającego plazmid niestrawiony enzymem o stężeniu C=0,1475 [μg/μl] co wynosiło 7,25 μl

• drugiej z nich dodaliśmy 3,94 μl mieszaniny ligacyjnej; potrzebna objętość mieszaniny ligacyjnej została wyznaczona w opisany poniżej sposób

Dodana objętość mieszaniny ligacyjnej miała zawierać 50 ng (0,05 μg) DNA. 20 μl mieszaniny sporządziliśmy z użyciem 4,64 μl zawiesiny o zawartości wstawki 0,153 μg i 4 μl zawiesiny o zawartości wektora 0,1 μg (razem 0,253 μg).

• Stężenie DNA w mieszaninie ligacyjnej:

0,253 μg : 20 μl = 1,27 x 10^-2 μg x μl^-1

• Objętość mieszaniny zawierająca 50 ng (0,05 μg) DNA

0,05 μg : 1,27 x 10^-2 μg x μl^-1 = 3,94 μl

• Zworteksowano i pozostawiono na lodzie przez 30 minut

• Obie próbówki przeniesiono następnie do łaźni wodnej (o temperaturze 42⁰C) i pozostawione je tam przez 90 sekund.

• Następnie próbówki ponownie przeniesiono na lód na 2 minuty

• W tym czasie odmierzono 800µl pożywki i wprowadzono do każdej z próbówek

• Próbki z pożywką umieszczono na 45 minut w wytrząsarce, w której panowała temperatura 37⁰C

• Otrzymaną od prowadzącego szalkę z agarem zawierającym ampicylinę, opisano i zachowując sterylne warunki naniesiono na nią:

  • Na pierwszą połówkę 60 µl stransformowanych komórek i rozprowadzono sterylną głaszczką

  • Na drugą połówkę w ten sam sposób 60 µl komórki stransformowane samym plazmidem z drugiej probówki

• Po wchłonięciu się cieczy szalkę odwrócono i pozostawiono do inkubacji w cieplarce

• Po 2 dniach przeprowadzono obserwację kolonii:

Zdjęcie:

1: transformowane komórki DHα

2: komórki stransformowane samym plazmidem

1. OBSERWACJE I WNIOSKI KOŃCOWE

Zgodnie z przewidywaniami na całej szalce, na którą posialiśmy bakterie transformowane powinniśmy zaobserwować wzrost kolonii bakterii. Bakterie te powinny być oporne na ampicylinę, ponieważ zawierały gen odporności właśnie na ten antybiotyk (przeszły transformacje) i ze względu na zawartość tego antybiotyku w podłożu mogły się na nim rozwijać. Na połówce szalki, na którą posialiśmy bakterie transformowane plazmidami zawierającymi wstawkę i gen oporności na ampicylinę nie zaobserwowaliśmy wzrostu kolonii. Naszym zdaniem, proces transformacji nie powiódł się:

- nasza wydajność procesu była zbyt mała, by zaszła transformacja, przez co bakterie nie dostały genu odporności na ampicylinę i nie wyrosły na agarze,

- mogliśmy popełnić błąd w obliczeniach, co skutkuje widocznym efektem,

- prawdopodobne szalka została zakażona bakteriami spoza probówek w wyniku niezachowania warunków sterylności pracy,

- żel agarozowy w wyniku przegrzania wykrystalizował się.

Na połówce szalki z bakteriami DH5α widoczne są kolonie bakterii ze względu na niewielką wydajność procesu transformacji i na fakt, że część plazmidów w mieszaninie ligacyjnej pozostaje w postaci liniowej, ze względu na brak zajścia reakcji ligacji i brak możliwości recyrkularyzacji przeciętych enzymem EcoRI plazmidów ze względu na defosforylację ich końców 5'. Plazmidy nie były przecinane enzymem restrykcyjnym i po ich wchłonięciu do bakterii prawdopodobieństwo ich zniszczenia przez nukleazy było o wiele mniejsze niż w przypadku liniowych cząsteczek pozostających w mieszaninie ligacyjnej.

Niestety komórki te umarły w skutek destrukcji podłoża w wyniku zbyt długiego przebywania szalki w inkubatorze. Nie jesteśmy w stanie wyjaśnić tej sytuacji, ponieważ tylko naszej sekcji wyszedł taki wynik.