REGULACJA REPLIKACJI GENOMU EUKARIOTYCZNEGO

Replikacja genomowego DNA w komórkach eukario­tów jest regulowana na dwóch poziomach:

1. Replikacja jest koordynowana z cyklem komór­kowym tak, żeby zawsze w momencie podziału komórki dwie kopie genomu były wcześniej przy­gotowane.

2. Sam proces replikacji może ulegać zatrzymaniu w warunkach niekorzystnych dla życia komórki; np. gdy DNA ulegnie uszkodzeniu i musi być naprawiony, zanim jego kopiowanie dobiegnie końca.

Koordynacja procesu replikacji genomu i podziału komórkowego

Po odkryciu, że DNA - główny składnik chromosomów jest nośnikiem in­formacji genetycznej, znaczenie interfazy wzrosło. Wtedy zajęto się identyfikacją okresu, w którym zachodzi replikacja genomu, co doprowa­dziło do reinterpretacji cyklu komórkowego i nowego jego podziału na proces czterofazowy, a więc:

• Faza M lub mitoza; okres, w którym podziałowi ulega jądro i cała komórka.

• Faza G1; okres przerwy, w czasie której zachodzą najważniejsze procesy syntezy podstawowych skła­dników budulcowych komórki, jak transkrypcja, translacja i temu podobne.

• Faza S; okres, w którym genom komórki ulega replikacji.

• Faza G2; okres kolejnej przerwy w oczekiwaniu na mitozę.

Główne punkty kontrolne cyklu komór­kowego:

• Okres poprzedzający przejście komórki w fazę S

• Okres poprzedzający przejście komórki w fazę M

Zatrzymanie cyklu komórkowego zachodzi zawsze tylko w jednym z tych dwóch punktów, a powodem tego zatrzymania mogą być albo mutacje w genach odpowiedzialnych za kontrolę cyklu komórkowego, albo doznanie cięż­kiego urazu przez komórkę, jak np. poważne uszkodzenie DNA.

INICJACJA

Inicjacja cyklu podziału komórkowego wymaga obecności zewnątrzkomórkowych czynników wzrostu, tzw. mitogenów. W przypadku braku mitogenów komórki wycofują się z cyklu komórkowego w fazie G1 i wchodzą w spoczynkową fazę GO. Punkt fazy G1, w którym zbierana jest informacja na temat środowiska otaczającego komórkę, i w którym komórka podejmuje decyzję wejścia w następny etap cyklu, nazywany jest punktem restrykcyjnym (punkt R). Komórki, które są pozbawione mitogenów przed osiągnięciem punku R, wchodzą w fazę GO i nie rozpoczynają nowego podziału komórkowego, natomiast komórki wystawione na brak mitogenów już po przejściu przez punkt R, kontynuują cykl komórkowy i wchodzą w fazę GO po zakończeniu podziału. W większości typów komórek punkt R osiągany jest kilka godzin po mitozie. Punkt R ma kluczowe znaczenie w decyzjach komórki co do jej dalszych losów. Przerwa w fazie G1 pomiędzy mitozą a osiągnięciem punktu R jest czasem, w którym pojawia się wiele sygnałów i oddziaływań decydujących o losach komórki.

Zbudowanie kompleksu pre-replikacyjnego umożliwia rozpoczęcie replikacji genomu

Badania, prowadzone początkowo tylko na drożdżach Saccharomyces cerevisiae, pozwoliły na stworzenie mo­delu procesu kontroli synchronizacji fazy S postulują­cego, że replikacja genomu wymaga zbudowania kompleksu pre-replikacyjnego w obszarze inicjacji replikacji, który zaraz po jej rozpoczęciu ulegałby przekształceniu w kompleks post-RC. Kompleks ten byłby już nie­zdolny do inicjacji replikacji DNA oraz do rozpo­czynania następnej rundy replikacyjnej. Byłby to więc mechanizm zabezpieczający komórki przed powtórną replikacją genomu, zanim mitoza, a więc i podział komórki, dobiegnie końca. Obecnie uważa się, że ORC stanowi podstawę do konstrukcji pre-RC.

Dwa inne białka zostały wzięte pod uwagę jako potencjalni kandydaci do budowy pre-RC:

• białko Cdc6p, które pierwotnie zostało ziden­tyfikowane tylko w drożdżach, obecnie wiadomo, że jego homologi występują również i w komórkach wyższych eukariotów.

Drożdżowe białko Cdc6p jest syntetyzowane w końcowym etapie fazy G2, gdy komórka wchodzi w mitozę, a ulega połączeniu z chromatyną we wczesnym etapie G1, gdy rozpoczyna się replikacja DNA.

• cała grupa białek nazwanych czynnikami licencjonującymi replikację. Podobnie jak w przypadku Cdc6p białka te zostały najpierw zidentyfikowane w droż­dżach (rodzina białek MCM), a następnie ich homologi znaleziono w komórkach wyższych eukariotów. Białka RLF łączą się z chromatyną w końcowym etapie fazy M i pozostają z nią związane aż do początku fazy S, po czym są stopniowo usuwane z chromosomowego DNA w trakcie jego replikacji.

Regulacja składania pre-RC

Kontrola cyklu komórkowego jest procesem złożonym, sterowanym głównie przez kinazy biał­kowe, które poprzez fosforylację aktywują inne en­zymy i białka o bardzo specyficznych zadaniach spełnianych w ciągu całego cyklu. Kontrola aktywności jest sprawowana w części przez białka nazwane cyklinami, których ilości w jądrze zmieniają się w zależności od fazy cyklu komór­kowego, w części przez inne kinazy białkowe, których rolą jest aktywowanie kinaz zależnych od cyklin, oraz w części przez inhibitory białkowe.

Wiele rodzajów cyklin zostało powiązanych z pro­cesem aktywacji replikacji DNA i zapobiegania przed ponownym formowaniem się kompleksu pre-RC po zakończeniu replikacji.

Należą do nich:

• cykliny mitozy, których główną funkcją jest nie tylko aktywowanie tej fazy cyklu, lecz również represja replikacji DNA. Jeśli działanie tych cyklin zostanie zablokowane, na przykład przez nadpro­dukcję białek odpowiedzialnych za hamowanie ich aktywności, komórki nie tylko tracą zdolność do wejścia w fazę M, lecz również replikacja DNA przebiega w nich w sposób nie kontrolowany i nie­ustannie powtarzający się.

• cykliny o bardzo specyficznym oddziaływaniu tylko na fazę S, takie jak cykliny Clb5p i Clb6p u S. cereińsiae, których inaktywacja opóźnia lub hamuje replikację DNA,

• inne cykliny mitotyczne, wykazujące aktywność tylko w ciągu fazy G2, gdzie blokują składanie pre-RC, zaraz po zakończeniu replikacji genomu, ale jeszcze przed podziałem komórkowym.

Poza systemem kontrolnym zależnym od cyklin, replikacja DNA jest regulowana przez kinazy białkowe niezależne od cyklin. Wśród nich można wymienić kinazę Cdc7p-Dbf4p. Obec­ność kinazy Cdc7p-Dbf4p jest niezbędna do zajścia procesu replikacji, gdyż sygnały regulacyjne zależne od cyklin są niewystarczające do zainicjowania w ko­mórce fazy S.

Głównym mechanizmem kontroli następowania po sobie faz cyklu komórkowego jest fosforylacja białek. Kontrolę nad tym sprawują specy­ficzne kinazy białkowe, składające się z podjednostek regulatorowej i katalitycznej. Podjednostki regulatorowe to cykliny, a katalityczne to kinazy zależne od cyklin. Kinazy CDK nie mają aktywności katalitycznej, jeżeli nie są związane z cykliną, przy czym mogą wiązać różne typy cyklin. CDK i cyklina, obecne w specy­ficznym kompleksie cyklina-CDK, wspólnie wyznaczają, które białko docelowe będzie fosforylowane przez kinazę.

Występują trzy różne klasy kompleksów cyklina-CDK:

• Kompleksy CDK G1 przygotowują komórkę do fazy S, poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych, które to kierują ekspresją enzymów wymaganych do syntezy DNA i ekspresją białek kompleksów cyklina-CDK fazy S.

• Kom­pleksy CDK S stymulują zapoczątkowanie syntezy DNA. Maszyneria syntezy zapewnia, że każdy z chromosomów zostanie zreplikowany tylko jeden raz.

• Kompleksy mitotyczne CDK indukują kondensację chromoso­mów i prawidłowe rozdzielenie chromosomów do dwóch potomnych komórek.

Aktywność kompleksów CDK jest regulowana na trzy sposoby:

• Przez kontrolowanie transkrypcji podjednostek kompleksów CDK.

• Za pomocą inhibitorów, które redukują aktywność kompleksów CDK. Na przykład mitotyczne kompleksy CDK są syntetyzowane w fazach S i G2, ale ich aktywność jest hamowana do czasu ukończenia syntezy DNA.

• Przez zorganizowaną proteolizę kompleksów CDK w określonym sta­dium cyklu komórkowego, kiedy nie są już potrzebne.

Zdarzenia w fazie G1 i przejście z fazy G1 do fazy S cyklu komórkowego są po części regulowane przez aktywację (w niektórych przypadkach przez inhibicję) transkrypcji genów, podczas gdy przejścia w następnych fazach cyklu są regulowane przede wszystkim przez mechanizmy potranskrypcyjne. Przejście przez kluczowy punkt R fazy G1 w pełni zależy od aktywacji czynnika transkrypcyjnego E2F. E2F stymu­luje transkrypcję i ekspresję genów kodujących białka biorące udział zarówno w replikacji DNA i syntezie deoksyrybonukleotydów, jak i cykli­ny i kinazy CDK wymagane w następnych fazach cyklu. Aktywność E2F jest hamowana przez związanie białka supresorowego transformacji retinoblastomy (Rb) lub podobnych białek. Kiedy Rb jest nieufosforylowany, aktyw­ność E2F jest hamowana. Fosforylacja Rb przez kompleksy cyklina-CDK w środku i pod koniec fazy G1 uwalnia E2F i umożliwia mu aktywowanie transkrypcji.

Kontrola wewnątrz fazy S

Inicjacja replikacji nie zachodzi we wszystkich miejs­cach inicjacyjnych jednocześnie. Różne miej­sca inicjacji nie rozpoczynają swego działania w sposób całkowicie przypadkowy. Niektóre partie genomu są zawsze replikowane we wczesnej fazie S, a inne tylko w późnej. Kolejność rozpoczynania replikacji jest stała i nie ulega zmianom podczas kolejnych podziałów komórkowych.

Ogólny rozkład obszarów wczesnej i późnej re­plikacji wskazuje, że geny podlegające aktywnej trans­krypcji ulegają replikacji we wczesnej fazie S, a regiony nietranskrybowane w fazie późnej, z tym że obszar centromerowy chromosomu replikowany jest zawsze na końcu. Wczesne obszary inicjacji replikacji są więc tkankowo specyficzne i odzwierciedlają rozkład eks­presji genetycznej zachodzącej w danej komórce.

Przyczyny określające czas „odpalania" poszczególnych miejsc inicjacji nie wynikają tylko z sekwencji miejsc inicjacji, ponieważ przeniesienie segmentów DNA z ich pozycji normalnej w inne miejsca tego samego lub innych chromosomów może spowodować zmianę czasu „odpalania" wszystkich miejsc inicjacji zawartych w przeniesionym fragmencie DNA. Ten skutek zmiany miejsca może być związany ze zmianą organizacji chromatyny i z tego powodu podlegać wpływowi takich struktur, jak miejsce kontrolne regionu, które odpowiada za kontrolę upakowania DNA w chromosomie.

Punkty kontrolne fazy S

Tak jak przy wejściu komórki w fazę S, regulacja punktów kontrolnych wewnątrz tej fazy okazała się również związana z obecnością kinaz regulowanych przez cykliny. Może to mieć związek z odpowiedzią na sygnały wykrywające uszkodzenia w DNA, a po­chodzące od białek towarzyszących widełkom replikacyjnym. Szczególnie dobrym kandydatem na takie białko sygnałowe może być polimeraza DNA, której precyzyjna funkcja w replikacji DNA nie została ustalona, natomiast wiadomo, że komór­ki mutantów o zmienionej polimerazie wykazują zupełnie inną odpowiedź na uszkodzenia DNA niż komórki prawidłowe. Inne białka widełek replikacyjnych, jak białka RPA wiążące jednoniciowy DNA czy towarzyszące im białka RFC, mogą także ucze­stniczyć w wykrywaniu uszkodzeń w DNA.