zad.1

Mamy do wyboru 5 różnych endonukleaz. Na podstawie poniższych danych wywnioskuj, który z produktów trawienia restrykcyjnego będzie najlepszym (najłatwiejszym), a który najgorszym (najtrudniejszym) substratem dla ligazy. Odpowiedź swą uzasadnij. W przypadku najgorszego z substratów, co należałoby zrobić by mieć jakąkolwiek szansę powodzenia ligacji?

BglII

...A↓G A T C T...3’

...T C T A G↑A...5’

ScrFI

...C C↓N G G...3’

...G G N↑C C...5’
SmaI

...C↓C C G G G...3’

...G G G C C↑C...5’

BamHI

...G↓G A T C C...3’

...C C T A G↑G...5’

SacI

...G A G↓C T C...3’

...C T C↑G A G...5’

Najlepiej będą ligowane cz. Posiadające „najdłuższe” lepkie końce, więc produktu po trawieniu: BglII, SmaI, BamHI (biorąc pod uwagę ilość tworzonych wiązań wodorowych produkt po trawieniu SmaI będzie najstabilniejszy więc najłatwiej ligowany). Najgorszym substratem dla ligazy będzie produkt po trawieniu SacI tworzący tępe końce.

Podejrzewam, że w zadaniu wymieniona miała być ligaza z E.coli, która nie liguje tępych końców, robi to natomiast ligaza z faga T4.

Zad.2

Chcemy badać aktywność odwrotnej transkryptazy (rewertazy).

a) Jeśli podczas tych badań matrycą ma być poliryboadenylan, to jakiego należałoby użyć startera?

Poli (T)

b) Czy w ogóle trzeba startera?

Tak, każda polimeraza DNA go wymaga

c) Jakich i jak zaznakowanych nukleotydów należałoby użyć do obserwacji wydłużania łańcucha?

Rewertaza, syntezując cz. DNA na matrycy RNA używa dNTPów, które mogą być wyznakowane radioaktywnie ³²P w pozycji α.

Konkretnie chodzi o Tymidylan wyznakowany w pozycji α

Zad.3

Zaproponuj prosty i czuły sposób na określenie, czy zakaźnym wirusem w konkretnym przypadku jest wirus DNA czy RNA?

Wirusy RNA kodują gen odwrotnej transkryptazy, wirusy DNA takiego genu nie mają. Na tej podstawie można je łatwo odróżnić stosując technikę PCR, używając startera komplementarnego do fragmentu DNA kodującego ten właśnie enzym.

(odpowiedź ponoc „zbyt” skomplikowana, niestety „krótszej” nie znam…)

Zad.4

Co stanie się po 1 rundzie replikacji, jeśli w rodzicielskiej cząsteczce DNA nastąpiła spontaniczna deaminacja oksydacyjna cytozyny? Jakie cząsteczki potomne powstaną? A jakie cząsteczki potomne powstaną po dwóch rundach.

Deaminacja cytozyny prowadzi do utworzenia uracylu. O ile polimeraza DNA nie będzie miała problemów z replikacją takiej cz. to w cz. potomnej zamiast G zostanie wstawiona A. Po dwóch cyklach replikacji w miejsce gdzie był U zostanie wstawiona T. Reasumując para G-C zostanie wymieniona na A-T.

Nić wyjściowa: NNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNN

Po deaminacji: NNNNNNNNNNNUNNNNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNN

1 runda: 1cz. NNNNNNNNNNNUNNNNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNN

2cz. NNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNN

2 runda: 1’cz. NNNNNNNNNNNUNNNNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNN

1’’cz. NNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNN

NNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNN

oraz 2 cz. takie same jak „2cz

Zad.5

Wiedząc, że polimeraza DNA I, ligaza i topoizomeraza I katalizują reakcję tworzenia wiązania fosfodiestrowego. Wymień/nazwij:

a) Zaktywowane produkty pośrednie w reakcjach katalizowanych przez te enzymy.

polimeraza DNA I – dNTP związany z polimerazowym centrum aktywnym

ligaza – adenylan-DNA poprzez wiązanie fosfobezwodnikowe

topoizomeraza I – wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy resztą Y enzymu a cz. DNA

b) Grupę uwalnianą podczas każdej z przeprowadzanych reakcji.

polimeraza DNA I – dwie grupy fosforanowe w formie pirofosforanu (PP_i)

ligaza – AMP/NMN i PP_i

topoizomeraza I – uwalniana jest wolna grupa Y enzymu

Zad 6.

Fotoreaktywne enzymy - fotoliazy DNA zmieniają energię świetlna z zakresu 300-500 nm (bliski fiolet i światło widzialne) na energie chemiczną, pozwalająca rozerwać pierścień cyklo-butylowy w dimerze pirymidynowym. Wiadomo jednak, że w nieobecności substratu enzymy te nie absorbują światła o długości fali dłuższej niż 300 nm. Dlaczego indukowana obecnością substratu absorpcja światła jest korzystna?

Enzym nie rozcina nici DNA w przypadku gdy nie występują dimery pirymidynowe, czyli kiedy nie jest to potrzebne; brak/obecność substratu jest molekularnym włącznikiem i punktem kontroli dla fotoliaz.

Zad 7.

a) Wyeksponowanie Salmonelli na działanie tylko wody miało pokazać czy mikroorganizm sam z siebie jest zdolny do odwrócenia mutacji zinaktywowanego genu, tzw. „background”.

b) Ażeby można było porównać siłę badanego mutagenu z mutagenem już znanym i określić jego „siłę”,

c) Związek C jest w formie nieaktywnej, która praktycznie nie jest mutagenna i wymaga aktywacji aby stać się mutagenną,

d) enzymy wątrobowe mogą aktywować niektóre szkodliwe związki, czyniąc je mutagennymi (źródło http://wps.prenhall.com/esm_klug_essentials_5/17/4576/1171475.cw/index.html ).

Cytochromy metabolizują różne związki heterocykliczne do wysoce reaktywnych epoksydów, którymi paradoksalnie komórka sama siebie „truje”. Czyli mitochondrialne cytochromy, konkretnie chodzi o system cytochromu P450.

Zad8.

Pewien Archeon odkryty w kwaśnych gorących źródłach, ma topoizomerazę, która katalizuje, zależne od hydrolizy ATP, wprowadzanie do DNA „+”superhelikalnych skrętów (superskrętów). Jakie korzyści z posiadania tego enzymu może czerpać ten Archeon?

Enzym się nazywa odwrotna gyraza, jest specyficznym typem topoizomerazy I a dodatnie superskręty zwiększają odporność temperaturową genomu usztywniając genom

Jako, że acydofilne hipertermofile mają niską zawartość par G-C (31% dla fakultatywnego tlenowca termo-acydofilnego Acidianus infernus, T_opt=88°C, pH_opt=1,5÷5), możliwe, że dodatnie skręty są adaptacją rekompensującą niskie T_m cz.

Zad.9

Wyobraź sobie, że chcesz otrzymać radioaktywną cząsteczkę DNA i że jesteś w posiadaniu następujących odczynników:

1. Niespecyficznej endonukleazy, która wielokrotnie nacina jedną z nici DNA, pozostawiając grupę OH na końcu i fosforan na końcu .

2. Całą polimerazę DNA I (zastanów się co oznacza stwierdzenie „całą”)

3. Radioaktywne dNTP

1. Zaproponuj sposób uzyskania radioaktywnych cząsteczek DNA.

   Dna jest traktowane niespecyficzną nukleazą tak aby fragmenty DNA zostały wycięte z cz. DNA (fragmenty restrykcyjne). Wydaje mi się, że potem trzeba zinaktywować endonukleazę, najpewniej temperaturowo. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodawane są dNTPy wyznakowane radioaktywnie i polimeraza DNA I. Polimeraza wypełnia powstałe ‘luki’ w dwuciniowym DNA i przesuwa nick na koniec cz., przy okazji wycinając nieradioaktywne nukleotydy zastępując je wyznakowanymi.

2. Jak nazywamy tę technikę radioaktywnego znakowania cząsteczek?

   Ta konkretna metoda to, tzw. „Nick Translation”.

3. Jak wpłynęłoby użycie fragmentu Klenowa zamiast polimerazę DNA I na ten eksperyment?

   Fragment Klenowa to polimeraza DNA I pozbawiona aktywności 5’-> nukleazowej.

Bez tej aktywności enzym nie może przesuwać ‘nicka’.

(Fragment Klenowa jest wykorzystywany w metodzie Random Priming)

Polimerazie DNA I wystarczy jeden nick, żeby zacząć wycinanie deoksynukleotydów, zastępując je wyznakowanymi radioaktywnie i przy okazji przesuwając nieciągłość (brak 1 wiązania fosfodiestrowego).