Brzesko Zuzanna Prowadzący:
Michalska Aleksandra 10,03,2010
Tyrpa Magda
Ćwiczenie 1: Syntetazy amnioacylo- tRNA.
Cel: Oznaczenie aktywności syntetazy walilo- tRNA wyizolowanej z zarodków pszenicy.
1. Izolacja syntetazy aminoacylo- tRNA z zarodków pszenicy.
Masa stałego siarczanu amonu dodawana do supernatantu do wysycenia 30%:
17,6 g (NH4)2SO4 – 100 ml
X g – 19 ml
X= 3,344g
Masa stałego siarczanu amonu dodawana do supernatantu do wysycenia 70%, w celu wytrącenia syntetaz:
27,3 g (NH4)2SO4 – 100 ml
X g – 19,5 ml
X= 5,787g
Oczyszczanie białek z siarczanu amonu :
- dializa przez błonę
- na kolumnie z DEAE- celulozą
Pomiar absorbancji oczyszczonych frakcji przy 280nm:
Po kolumnie:
0,105
0.199 (ta próba wybierana do dalszych obliczeń ze względu na największą zawartość białka)
0.127
Po dializie: 0.4055
Pomiar absorbancji przeprowadzono w celu wstępnego oszacowania zawartości białek we frakcjach.
2. Oznaczanie aktywności syntetaz walilo- tRNA izolowanej z zarodków pszenicy.
Oznaczanie metodą Lowry ilości białka.
Krzywa wzorcowa przygotowywana na podstawie pomiarów absorbancji białek surowicy albuminy wołowej (BSA):
| Masa BSA: | Absorbancja przy 780nm: |
|---|---|
| 20 | 0,036 |
| 40 | 0,057 |
| 60 | 0,047 |
| 80 | 0,058 |
| 100 | 0,091 |
Oznaczanie ilości białka w preparatach syntetaz:
Przyblizone stężenie białka w próbie na podstawie ekstynkcji przy 280nm:
Po kolumnie:
0,199 µg białka – 50 µl roztworu
X – 1000 µl roztworu
X= 3,98 mg/ml
Ilość preparatu w której znajduje się 50 µg białka:
3980 µg białka – 1 ml roztworu
50 µg białka - x
X= 12,56 µl
Po dializie:
0,4055 µg białka – 50 µl roztworu
X – 1000 µl roztworu
X= 8,11 mg/ml
Ilość preparatu w której znajduje się 50 µg białka:
8110 µg białka – 1 ml roztworu
50 µg białka - x
X= 6,1 µl
Pomiar absorbancji przy 750nm:
Po dializie: 0,312
Po kolumnie: 0,319