DNA fingerprinting, metoda „genetycznych odcisków palców”, metoda polegająca na izolowaniu i sporządzaniu obrazów fragmentów DNA. Opracowana przez Brytyjczyka Aleca Jeffreysa w 1984.
Pobrane z komórek DNA izoluje się, następnie trawi odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, które tną DNA w specyficznych miejscach. Pocięte fragmenty DNA sortuje i rozdziela się elektroforetecznie. Rozdzielone fragmenty DNA przenosi się na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzuje się z radioaktywnymi sondami, następnie fotografuje. Dostaje się w ten sposób „genetyczne odciski palców” – obraz fragmentu DNA przypominający swoim wyglądem kod paskowy.
W przypadku zbyt małej wyjściowej ilości DNA - namnaża się DNA, stosując PCR. Ponieważ każdy osobnik posiada swój własny charakterystyczny wzór DNA, metodę tę określa się jako metodę genetycznych odcisków palców.
DNA fingerprinting stosuje się w diagnostyce chorób dziedzicznych (np. hemofilii, anemii sierpowatej, choroby Alzheimera, choroby Huntingtona), w kryminalistyce do identyfikacji przestępców na podstawie pozostawionych przez nich śladów biologicznych.
RFLP
(ang. Restriction Fragments Lenght Polymorphism )
Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych
oznacza odmienność fragmentów kodu genetycznego pochodzącego od różnych osobników, pociętych specyficznymi enzymami restrykcyjnymi. Odmienność ta polega na różnicach w długości fragmentów DNA, które powstają w wyniku mutacji, powodowanych przez tworzenie lub usuwanie miejsc rozpoznanych przez określone enzymy.
DNA genomu badanej osoby przecinane jest przez enzym restrykcyjny z grupy endonukleaz w określonych miejscach o charakterystycznej sekwencji nukleotydów, precyzyjnie rozpoznawanej przez ów enzym. W zależności od liczby miejsc restrykcyjnych w DNA i odległości pomiędzy nimi, otrzymujemy określoną liczbę fragmentów restrykcyjnych o specyficznej długości. Zastosowanie techniki RFLP polega właśnie na analizie różnic badanych fragmentów DNA.
Analizę metodą RFLP można podzielić na następujące etapy:
pobranie i izolacja DNA
trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi
rozdzielenie elektroforetyczne
przygotowanie hybrydyzacji Southerna
hybrydyzacja DNA z radioaktywną sondą
Pierwszym etapem jest izolacja DNA z próbki krwi.
Następnie DNA jest cięte enzymami restrykcyjnymi rozpoznającymi specyficzną sekwencję o długości kilku nukleotydów. W sprawach kryminalnych najczęściej używa się enzymu HaeIII, który przecina DNA w miejscu wystąpienia sekwencji 5’-GGCC-3’. W wyniku takiej reakcji otrzymuje się mieszaninę cząsteczek DNA różnej długości. Następnie przeprowadza się elektroforezę, czyli rozdziela się tę mieszaninę na żelu (większe fragmenty wędrują wolniej, a mniejsze szybciej), a potem przenosi się DNA na membranę. Następnie wykonuje się hybrydyzację (Southern blot) ze znakowanym (np. radioaktywnie) fragmentem DNA.
Taka sonda wiąże się do znajdujących się na membranie komplementarnych do niej sekwencji. Potem w sposób odpowiedni do metody znakowania sondy odczytuje się wzór prążków, do których przyłączyła się sonda. Ten wzór to właśnie genetyczny odcisk palca. Metoda RFLP jest jednak czasochłonna, kosztowna i wymaga sporo materiału wyjściowego, toteż obecnie jest stosowana coraz rzadziej.
AFLP
(ang. Amplification Fragment Lenght Polymorphism)
Jej zaletą jest możliwość identyfikacji dużej liczby markerów w stosunkowo krótkim czasie i wysoka powtarzalność (Bednarek i Chwedorzewska 2001).
Metoda ta wymaga małej ilości materiału wyjściowego i polega na badaniu obecności lub braku amplifikacji specyficznych fragmentów restrykcyjnych (Łojkowska 2005).
Jest to w pewnym sensie połączenie zalet PCR i RFLP (Masojć 2005).
W technice tej wykorzystuje się dwa enzymy restrykcyjne, z których jeden charakteryzuje się wyższą, a drugi niższą częstotliwością cięcia.
Do fragmentów restrykcyjnych dołączane są adaptory składające się z sekwencji rdzeniowej, oraz sekwencji specyficznej dla miejsca restrykcyjnego. W drugim etapie następuje amplifikacja fragmentów restrykcyjnych i ich rozdział na żelu poliakrylamidowym (Masojć 2005).
Pierwszy etap AFLP polega na trawieniu oczyszczonego DNA dwoma enzymami restrykcyjnymi.
Jeden z enzymów, rozpoznający sekwencje sześcionukleotydowe (np. EcoRI) przecina dwuniciowy DNA znacznie rzadziej niż drugi enzym (np, MseI) właściwy dla sekwencji czteronukleotydowych.
Do tak otrzymanych fragmentów restrykcyjnych przyłączane są z obu stron krótkie adaptory.
Dwa startery służące do preamplifikacji mają sekwencję komplementarną do części adaptorowej i miejsca restrykcyjnego oraz jeden selekcyjny nukleotyd na końcu 3'.
Zadaniem nukleotydów selekcyjnych jest ograniczenie liczby amplifikowanych fragmentów. Po wstępnej amplifikacji, w mieszaninie reakcyjnej znajdują się liczne fragmenty DNA, które po rozcieńczeniu będą stanowić materiał matrycowy dla właściwej, selektywnej amplifikacji. Jest ona prowadzona z użyciem starterów, różniących się od tych z pierwszej fazy obecnością dwóch dodatkowych nukleotydów selekcyjnych na końcach 3'. Starter wiążący się z miejscem EcoRI jest wyznakowany izotopem 33P
RAPD (ang. Randomly Amplified Polymorphic DNA)
Wykorzystuje ona reakcję PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) do generowania markerów RAPD. Markery te wykazują dominujący charakter dziedziczenia, przez co niemożliwe jest odróżnienie homozygot od heterozygot. Do reakcji PCR używa się startera o długości 9-11 pz. Każdy taki starter zapoczątkowuje amplifikację w wielu rejonach genomu jednocześnie. Produkty reakcji amplifikacji rozdziela się na żelu agarozowym. Detekcja prążków odbywa się z użyciem znaczników fluoroscencyjnych lub srebra. Metoda ta jest szybsza, wydajniejsza i mniej pracochłonna od RFLP. Potrzeba również znacznie mniejszych ilości DNA, ponieważ jest on powielany w kolejnych rundach amplifikacji. DNA ten może pochodzić z surowego ekstraktu.
CAPS (ang. Clevaed Amplified Polymorphic Sequence)
Technika oparta na połączeniu dwóch reakcji: reakcji PCR z trawieniem restrykcyjnym. Pierwszym etap to klasyczna reakcja PCR. Startery do reakcji konstruowane są na podstawie znanych sekwencji. Amplifikowany produkt jest następnie trawiony enzymem lub enzymami restrykcyjnymi i rozdzielany na żelu agarozowym.
SSR (ang. Simple Sequence Repeat)
Coraz częściej do analiz wykorzystuje się markery SSR, zwane również markerami mikrosatelitarnymi.
Markery te wykorzystują obecność w genomie tzw. DNA mikrosatelitarnego. Jest to DNA, w którym motyw powtarzalny ma długość 1-4 nukleotydów. Różne allele tego samego locus mogą mieć zmienną liczbę powtórzeń elementu podstawowego. Liczba powtórzeń waha się w przedziale 10-50 a łączna długość odcinka mikrosatelity wynosi 100-400 pz.
Sekwencje te zlokalizowane są częściej w euchromatynie, występują też w centromerach i telomerach.
Elementem podstawowym może być dwunukleotyd [(AG)n; (AC)n; (AT)n; (CA)n; (CG)n i in.], trójnukleotyd [(TCT)n; (TTG)n; (ATT)n; (TAA)n i in.] lub czteronukleotyd [(TATG)n; (AGTG)n; (GACA)n i in.]. Dla genomu roślinnego najbardziej charakterystycznym powtórzeniem jest dwunukleotyd (AT)n oraz trójnukleotyd (TAT)n. Wysoki polimorfizm pozwala na rozróżnienie osobników blisko spokrewnionych.
Wysoki koszt analiz oraz trudności w znalezieniu odpowiedniego markera SSR są tutaj wysoce niekorzystne.
SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism)
System ten pozwala na wykrycie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w obrębie sekwencji DNA. Technika polega na amplifikacji fragmentu genomu za pomocą reakcji PCR a następnie sekwencjonowaniu powstałego produktu. Po sekwencjonowaniu fragmentów należących do różnych osobników porównuje się ich sekwencję nukleotydową w celu identyfikacji SNP.
Analiza ta jest dość trudna i wymaga pewnej wprawy. Dodatkowym utrudnieniem jest dość wysoki koszt analiz. Za stosowaniem tej analizy przemawia ogromny polimorfizm obserwowany w analizowanej sekwencji.
SAMPL (ang. Selectively Amplified Microsatelite Polimorphic Loci)
Znacznie tańszą i prostszą metodą poszukiwania markerów molekularnych, a tym samym identyfikacji alleli jest, SAMPL. Metoda ta narodziła się z połączenia dwóch technik: SSR i AFLP. Polega ona na trawieniu DNA genomowego jednym enzymem restrykcyjnym, przeważnie rzadko tnącym nić DNA. Do miejsca tego przyłączony jest adaptor przez T4 DNA ligazę. Miejsce to będzie miejscem hybrydyzacji startera AFLP. Drugi starter jest komplementarny do sekwencji mikrosatelitarnej. Amplifikowany fragment zawiera się pomiędzy miejscem restrykcyjnym a sekwencją mikrosatelitarną. Metoda ta ma szansę wyprzeć klasyczny AFLP, ponieważ generuje prążki o bardzo wysokim polimorfizmie i pozwala na wykrycie alleli kodominujących.
Prawdopodobnie następne lata przyniosą dalszy rozwój nowych, nieznanych dotąd technik pozwalających na jeszcze głębszą analizę struktury i funkcji DNA.
Badanie ojcostwa
W Polsce badania nad ojcostwem kontynuuje się do
uzyskania prawdopodobieństwa nie mniejszego niż
99,9999%. Z pomocą oznaczania tradycyjnych grup krwi
osiągnięcie tego stopnia prawdopodobieństwa w zasadzie
też było możliwe, ale zdarzało się to raz na kilkaset badań,
a nie w każdym badaniu, jak obecnie. Do ustalania
spornego ojcostwa można zastosować:
1. Badanie DNA restrykcyjno - hybrydyzacyjne (bardzo skuteczne ale kosztowne, pracochłonne i długotrwałe, obecnie w wyraźnym zaniku)
2. Badanie DNA mikrosatelitarne zwane także badaniem PCR względnie multipleksowym (prawie tak skuteczne jak poprzednie, obecnie dominujące)
3. Badanie DNA sekwencyjne (bardzo skuteczne badanie przyszłościowe, obecnie znajduje się we wstępnym stadium rozwojowym, nie wiadomo, czy rozwinie się w kierunku sekwencjonowania DNA, czy raczej stwierdzania punktowych zmian typu SNP przy użyciu technologii mikrochipowej)