Karolina Szczęśniak Katowice, 16.03.2015r.
Sonia Szewczenko
SPRAWOZDANIE
Cel ćwiczenia : Izolacja plazmidowego DNA metodą lizy alkalicznej.
Materiały i odczynniki :
Szczep E.coli pUC19
Bufor L1 (50 mM glukozy, 25 mM TRIS-HCl, 10 mM EDTA)
Bufor L2 (0,2 M NaOH, 1% SDS)
Bufor L3 (3 M octan potasu, pH 4,8)
Mieszanina chloroform – alkohol izoamylowy 24:1
Etanol 70 %
Plazmidy są pozachromosomowym materiałem genetycznym bakterii, występują one w formie koliście zamkniętej. Znajdująca się w nich informacja genetyczna koduje cechy charakterystyczne dla danego szczepu np. produkcja toksyn, oporność na antybiotyki. Po procesie denaturacji plazmid ma zdolność do renaturacji, co jest wykorzystywane w metodzie lizy alkalicznej.
Izolacja plazmidowego DNA metodą lizy alkalicznej jest możliwa również dzięki ważnym różnicom między DNA chromosomowyym, a DNA pozachromosomowym. Przede wszystkim chodzi o różnicę wielkości – DNA chromosomowe jest dużo większe i ma inną strukturę przestrzenną, dzięki czemu podczas procesu izolacji ulega trwałemu zniszczeniu, a DNA plazmidowe zachowuje formę CCC (ang. covalently closed circle).
PRZEBIEG ĆWICZEŃ
Izolacja plazmidowego DNA uwzględniała następujące etapy :
Hodowla bakterii – (najczęściej przeprowadzana na podłożu płynnym).
Wirowanie 24-godzinnej hodowli w probówkach typu Eppendorf przy 13 000 obrotów na minutę, w celu otrzymania osadu bakteryjnego.
Zamieszczenie osadu w buforze L1. Poszczególne składniki tego buforu mają swoją określoną funkcję.
Glukoza zapewnia odpowiednie ciśnienie osmotyczne,
Bufor TRIS-HCl odpowiada za utrzymanie stałego pH roztworu,
EDTA powoduje destabilizację ściany komórkowej (ze względu na właściwości chelatujące – wiąże dwuwartościowe jony metali, takie jak Mg2+ i Ca2+). Wiązanie jonów magnezu powoduje również inhibicję działania deoksyrybonukleaz, co uniemożliwia pocięcie interesującego nas DNA.
Liza komórek bakteryjnych – dodanie buforu L2, zawierającego NaOH i SDS oraz inkubacja w temperaturze pokojowej.
SDS (siarczan dodecylu) jest detergentem jonowym, przez zmianę napięcia powierzchniowego osłon komórkowych, doprowadza do rozpuszczenia fosfolipidów i denaturacji białkowych struktur błon komórkowych, co prowadzi do lizy komórek i uwolnienia zawartości do roztworu.
NaOH alkalizuje środowisko, co prowadzi do denaturacji kwasów nukleinowych, zarówno DNA chromosomalnego jak i plazmidowego.
Dodanie do lizatu buforu L3 – bufor ten zawiera octan potasu, który zapewnia kwasowe środowisko (pH 4,8), dzięki czemu kolisty plazmidowy DNA przechodzi renaturację. DNA genomowy cały czas pozostaje w formie zdenaturowanej. DNA pozachromosomalny znajduje się w roztworze, zaś DNA genomowy oraz białka i inne zanieczyszczenia znajdują się w osadzie, dlatego też należy przeprowadzić wirowanie, aby oddzielić wcześniej wymienione składniki.
Dodanie PHENOLGELU i ponowne wirowanie, oddzielenie faz.
Do supernatantu dodano taką samą objętość mieszaniny chloroform – alkohol izoamylowy 24:1 – proces odbiałczania - oddzieleniu DNA od związanych z nim białek.
Do klarownego roztworu dodano izopropanol w obecności octanu potasu, który powoduje wytrącanie kwasu nukleinowego. Następnie przeprowadzono inkubację w temperaturze pokojowej i wirowanie.
Otrzymany osad przemyto w 70% etanolu i ponownie wirowano, usunięto supernatant i oczyszczono z resztek alkoholu. Otrzymany osad umieszczono w roztworze TE (TRIS-HCl + EDTA).
ELEKTROFOREZA W ŻELU AGAROZOWYM
1% żel agarozowy :
0,4 g agarozy
39,6 ml buforu TAE (rozcieńczonego w stosunku 1:49)
1μl bromku etydyny o stężeniu 0,4μg/ml
Oczyszczony DNA plazmidowy rozpuszczony w buforze TE z 2 μl barwnika obciążającego (0,25% błękit bromofenylowy rozpuszczony w 40% sacharozie) wprowadzamy do kieszonek w żelu agarozowym. Podłączamy komorę do elektroforezy do stabilizatora prądowego, tak aby napięcie wynosiło 41mA. Gdy marker migracji dojdzie do około ¼ długości żelu, należy zwiększyć napięcie do 46mA.
Przeprowadzono rozwijanie elektroforogramu i ostrożnie wyjęto żel agarozowy, a następnie oglądano go w transluminatorze w promieniach lampy UV.
Żel nr 1
Szybkość migracji cząsteczek DNA w żelu zależy od : pH, wielkości i znaku ładunku (ujemnie naładowane kwasy nukleinowe wędrują od katody do anody), rozmiaru i kształtu cząsteczki, wielkości przyłożonego napięcia, temperatury, stężenia agarozy.
Plazmid pUC19
(p-plazmid, UC- Uniwersytet California)
wysokokopijny,
otrzymywane z hodowli znajdującej się w później fazie wzrostu logarytmicznego,
koliste, dwuniciowe DNA,
2686 par zasad – mały plazmid,
Zawiera gen oporności na ampicylinę – plazmid opornościowy
Najbardziej rozpowszechniony wektor rekombinantów,
Plazmid wprowadza się w czasie „tranformacji”, gdzie może się zwielokrotnić i poddać ekspresji,
Szerokie zastosowanie jako wektor klonowania w badaniach i przemyśle,
Plazmid modelowy
WNIOSKI :
DNA genomowy jest wielokrotnie większy od DNA plazmidowego.
W czasie procesu otrzymywania DNA plazmidowego, DNA genomowy zostaje trwale
zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje na ogół w postaci kowalentnie
zamkniętych cząsteczek (tzw. forma CCC).
wpływ na szybkość wędrówki DNA w żelu agarozowym ma wielkość cząsteczki, cząsteczki większe wędrują wolniej
szybkość wędrówki zależy także od kształtu cząsteczki, cząsteczki mające formę CCC wędrują szybciej, liniowe wolniej, a najwolniej migrują cząsteczki mające formę OC
RNA którego nie usunęliśmy, zgromadzone jest najniżej, ponieważ jest najlżejsze i porusza się z tą samą prędkością w każdej kieszonce.
Plazmid pUC19 należący do szczepu Escherichia coli jest plazmidem małym przez co na elektroforogramie porusza się szybciej niż większe plazmidy.