sprawko elektroforeza

Karolina Szczęśniak Katowice, 16.03.2015r.

Sonia Szewczenko

SPRAWOZDANIE

Cel ćwiczenia : Izolacja plazmidowego DNA metodą lizy alkalicznej.

Materiały i odczynniki :

Plazmidy są pozachromosomowym materiałem genetycznym bakterii, występują one w formie koliście zamkniętej. Znajdująca się w nich informacja genetyczna koduje cechy charakterystyczne dla danego szczepu np. produkcja toksyn, oporność na antybiotyki. Po procesie denaturacji plazmid ma zdolność do renaturacji, co jest wykorzystywane w metodzie lizy alkalicznej.

Izolacja plazmidowego DNA metodą lizy alkalicznej jest możliwa również dzięki ważnym różnicom między DNA chromosomowyym, a DNA pozachromosomowym. Przede wszystkim chodzi o różnicę wielkości – DNA chromosomowe jest dużo większe i ma inną strukturę przestrzenną, dzięki czemu podczas procesu izolacji ulega trwałemu zniszczeniu, a DNA plazmidowe zachowuje formę CCC (ang. covalently closed circle).

PRZEBIEG ĆWICZEŃ

Izolacja plazmidowego DNA uwzględniała następujące etapy :

  1. Hodowla bakterii – (najczęściej przeprowadzana na podłożu płynnym).

  2. Wirowanie 24-godzinnej hodowli w probówkach typu Eppendorf przy 13 000 obrotów na minutę, w celu otrzymania osadu bakteryjnego.

  3. Zamieszczenie osadu w buforze L1. Poszczególne składniki tego buforu mają swoją określoną funkcję.

  1. Liza komórek bakteryjnych – dodanie buforu L2, zawierającego NaOH i SDS oraz inkubacja w temperaturze pokojowej.

  1. Dodanie do lizatu buforu L3 – bufor ten zawiera octan potasu, który zapewnia kwasowe środowisko (pH 4,8), dzięki czemu kolisty plazmidowy DNA przechodzi renaturację. DNA genomowy cały czas pozostaje w formie zdenaturowanej. DNA pozachromosomalny znajduje się w roztworze, zaś DNA genomowy oraz białka i inne zanieczyszczenia znajdują się w osadzie, dlatego też należy przeprowadzić wirowanie, aby oddzielić wcześniej wymienione składniki.

  2. Dodanie PHENOLGELU i ponowne wirowanie, oddzielenie faz.

    Do supernatantu dodano taką samą objętość mieszaniny chloroform – alkohol izoamylowy 24:1 – proces odbiałczania - oddzieleniu DNA od związanych z nim białek.

  3. Do klarownego roztworu dodano izopropanol w obecności octanu potasu, który powoduje wytrącanie kwasu nukleinowego. Następnie przeprowadzono inkubację w temperaturze pokojowej i wirowanie.

  4. Otrzymany osad przemyto w 70% etanolu i ponownie wirowano, usunięto supernatant i oczyszczono z resztek alkoholu. Otrzymany osad umieszczono w roztworze TE (TRIS-HCl + EDTA).

ELEKTROFOREZA W ŻELU AGAROZOWYM

1% żel agarozowy :

Oczyszczony DNA plazmidowy rozpuszczony w buforze TE z 2 μl barwnika obciążającego (0,25% błękit bromofenylowy rozpuszczony w 40% sacharozie) wprowadzamy do kieszonek w żelu agarozowym. Podłączamy komorę do elektroforezy do stabilizatora prądowego, tak aby napięcie wynosiło 41mA. Gdy marker migracji dojdzie do około ¼ długości żelu, należy zwiększyć napięcie do 46mA.

Przeprowadzono rozwijanie elektroforogramu i ostrożnie wyjęto żel agarozowy, a następnie oglądano go w transluminatorze w promieniach lampy UV.

Żel nr 1

Szybkość migracji cząsteczek DNA w żelu zależy od : pH, wielkości i znaku ładunku (ujemnie naładowane kwasy nukleinowe wędrują od katody do anody), rozmiaru i kształtu cząsteczki, wielkości przyłożonego napięcia, temperatury, stężenia agarozy.

Plazmid pUC19

(p-plazmid, UC- Uniwersytet California)

WNIOSKI :


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
sprawko elektroforeza
Sprawko Elektronika Wzmacniacz
matrialy, PWR [w9], W9, 5 semestr, Podstawy elektrotechniki Lab, MATERIAŁY, podst ele lab - swistak,
Sprawozdanie M6 B-7, AGH, MiBM - I rok, Elektrotechnika, Sprawka - elektro, M6
M5 Charakterystyki podstawowych elementów elektronicznych, AGH, MiBM - I rok, Elektrotechnika, Spraw
201 półprzewodniki i przewodniki, Politechnika Poznańska (PP), Fizyka, Labolatoria, fiza sprawka, el
Sprawko elektrotechnika 1
SprawkoZalewska, Elektronika i telekomunikacja-studia, rok III, sem V, tbez
sprawko 9 elektronika sem4, Sprawozdanie z przeprowadzonego ćwiczenia nr 9 -
sprawko 9 elektronika sem4, Sprawozdanie z przeprowadzonego ćwiczenia nr 9 -
123, Politechnika Poznańska (PP), Fizyka, Labolatoria, fiza sprawka, elektromagnetyzm
sprawko elektronika7
sprwko, Uczelnia PWR Technologia Chemiczna, Semestr 2, Elektronika, elektronika lab, sprawka elektro
Sprawozdanie nr I, PWR [w9], W9, 5 semestr, Podstawy elektrotechniki Lab, MATERIAŁY, podst ele lab -
sprawko elektra nr 1, UTP-ATR, Elektrotechnika i elektronika dr. Piotr Kolber, sprawozdania, elektra
sprawkoTUDY, Elektronika WAT, sem4, Techniki i urządzenia dostępowe - Tud, laborki, lab1
sprzężenia - sprawko, Elektrotechnika AGH, Semestr III zimowy 2013-2014, semestr III, semestr III, T
sprawozdanie nr 5 (ćw3)(2), Uczelnia PWR Technologia Chemiczna, Semestr 2, Elektronika, elektronika
diody-sprawko, elektra, sprawka uel
Liczniki - sprawko, Elektrotechnika AGH, Semestr IV letni 2013-2014, Podstawy Elektroniki, Laborator

więcej podobnych podstron