Jakby ktoś chciał więcej o wektorach:
http://zguw.ibb.waw.pl/~knbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html
http://www.parasit.amp.edu.pl/seminars/22210.pdf
w pdfie co nieco o klonowaniu nawet fajnie napisane.
Pewnie powtarzam się z wykładami, ale szczerze... nie wiem co tam jest;D Zresztą same obrazki specjalnie do mnie nie przemawiają;p
PozdRawiam
W dniu 15 listopada 2009 15:58 użytkownik biotechnolog bioinformatyk <aeibiotech@gmail.com> napisał:
wektory plazmidowe:
- Wysokokopijne wektory plazmidowe (np. serii pUC), otrzymywane są z hodowli znajdującej się w póznej fazie logarytmicznej wzrostu
- nisko- i średniokopijne (np. pBR322) powinny być przed izolacją amplifikowane.
Tylko tyle znalazłam na temat.
Klonowanie krótko opisane :
Klonowanie DNA - polega na wyseparowaniu odcinków DNA przy pomocy wektorów, którymi mogą być plazmidy, wirusy czy sztuczne chromosomy. Muszą one mieć dodatkowo zdolność do samodzielnej replikacji w komórce bakteryjnej bądź eukariotycznej. Klonowanie DNA przebiega w kilku etapach. Pierwszym etapem jest dobranie odpowiedniego enzymu restrykcyjnego, który jest zdolny do cięcia fragmentu DNA na przeznaczone do klonowania odcinki a także przecinałby DNA plazmidów. Po dobraniu takiej restryktazy enzym ligaza musi złączyć ze sobą tak pocięte fragmenty. W wyniku tego powstają cząsteczki zrekombinowanego DNA, w których fragment klonowanego DNA jest włączony do plazmidu. Następnie tak zrekombinowany plazmid zostaje wprowadzony do bakterii na drodze transformacji. Bakterią tą jest zazwyczaj Escherichia coli. W kolejnych podziałach bakteria wytwarza klon komórek, z których każda zawiera zrekombinowane plazmidy z klonowanym DNA. Można klonować zarówno losowo pocięte fragmenty DNA jak i ściśle określone odcinki między innymi geny. Obecnie powiela się DNA stosując technikę łańcuchowej reakcji polimerazy.
Zasady izolacji plazmidów:
1. Zawieszenie komórek w roztworze, który obniża wytrzymałość ścian komórkowych bakterii, hamuje DNazy przez chelatację jonów biwalencyjnych; niektórzy wraz z roztworem GTA dodają lizozym, trawiący ściany bakteryjne;
2. Zniszczenie komórek bakteryjnych – plazmid oraz pozostała składniki komórki są uwalniane do roztworu. Jednocześnie zachodzi odwracalna denaturacja kwasów nukleinowych oraz nieodwracalna denaturacja białek.
3. Renaturacja plazmidowego DNA. Oddzielenie plazmidowego DNA od białek, resztek błon i chromosomu bakteryjnego.
Ad. 1
Komórki po zwirowaniu zostają zawieszone roztworze GTE (Glukoza/Tris/EDTA). Dodatkowo można stosować lizozym.
Tris jest roztworu buforowym ma za zadanie utrzymać stałe pH (lekko zasadowe). EDTA jest związkiem chelatującym jony biwalencyjne (np. Ca2+, Mg2+). Wynikiem tego procesu są dwa efekty:
– zmniejszona stabilność ściany komórkowej bakterii spowodowana wiązaniem jonów Ca2+ przez EDTA; ściana komórkowa bakterii gram ujemnych składa się z jednej warstwy mureiny i otaczającej ją warstwy lipopolisacharydów, lipidów i lipoprotein; jak się wydaje, jony wapnia są potrzebne do zachowania stabilności warstwy lipopolisacharydowej;
– zahamowanie działania DNaz, przez jony magnezowe; bowiem te enzymy, jeśli aktywne mogły by pociąć plazmidowe DNA;
Glukoza jest dodana w celu zachowania właściwego ciśnienia osmotycznego; jest to ważne szczególnie podczas stosowania lizozymu, który prowadzi do powstania protoplastów, komórek pozbawionych ściany, a przez to wrażliwych na zewnętrzne ciśnienie osmotyczne; zbyt niskie ciśnienie osmotyczne (czyli środowisko hipotoniczne) spowodowało by pobieranie wody przez komórki i ich pęknięcie; środowisko izoosmotyczne lub słabo hiperosmotyczne nie jest szkodliwe dla protoplastów;
Ad. 2
W tym etapie do zawiesiny komórek bakteryjnych dodaje się alkalicznego roztworu NaOH/SDS. W zasadowym środowisku, przy udziale SDS dochodzi do lizy komórek bakteryjnych. Uwolnione białka są denaturowane przez SDS i NaOH. Genomowy i plazmidowy DNA ulega denaturacji pod wpływem zasadowego pH.
Po dodaniu NaOH/SDS w probówce znajduje się mieszanina zniszczonych błon, zdenaturowanych plazmidów, bakteryjnych chromosomów i białek, wolnych cząsteczek SDS i innych związków.
Ad. 3
Do roztworu lizatu dodawany jest octan potasu (bufor octanowy), który powoduje zmianę obniżenie pH. W efekcie jego działania plazmidowe DNA renaturuje szybko, podczas gdy chromosomowe DNA pozostaje zdenaturowane. Odmienna zdolność do renaturacji po obniżeniu pH jest istotą metody lizy alkalicznej. Pozwala na późniejsze łatwe oddzielenie DNA chromosomowego od plazmidowego. DNA genomowy wraz z białkami i fragmentami błon, wytrąca się w postaci serowatego osadu. Następnym krokiem jest wirowanie roztworu, by oddzielić plazmidowe DNA, które pozostaje rozpuszczone w supernatancie.
Po tym etapie otrzymana próbka może być dodatkowo odbiałczana mieszaniną fenol/chloroform, lub oczyszczana na minikolumnach będących fragmentem zestawów sprzedawanych przez firmy biotechnologiczne. Te czynności nie są uwzględnione w przedstawionym niżej, przykładowym protokole.
Otrzymany, oczyszczony DNA plazmidowy można precypitować w etanolu lub izopropanolu. Poniższy protokół uwzględnia ten proces.
Albo też link : http://arete.ibb.waw.pl/docs/node1.html
Kolumny : Systemy te na ogół oparte są zdolności złóż
krzemionkowych do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych, takich jak chlorowodorek guanidyny lub izothiocjanian guanidyny. Sole chaotropowe, powodują również rozpad błon komórkowych i denaturację białek, co sprzyja izolacji kwasów nukleinowych. Chaotropy ang. chaotropes, czyli ,,czyniące chaos'' są to substancje, które w roztworach wodnych wprowadzają silne zaburzenia w sieci wiązań wodorowych.
W zależności od skali, w jakiej przeprowadza się oczyszczanie, mogą to być tzw. minikolumny (rys. 1), w których przepływ roztworu przez membranę zawierającą złoża krzemionkowe uzyskuje się w wyniku wirowania całej kolumny w mikrowirówce, lub większe kolumny, w których roztwór przepływa grawitacyjnie. Złoża, przez które przechodzi roztwór, wychwytują specyficzne dla nich kwasy nukleinowe, tzn. DNA lub RNA, a pozostałe składniki roztworu, stanowiące zanieczyszczenie dla badanych prób, zostają zebrane w probówce znajdującej się poniżej filtra.
wektory plazmidowe:
- Wysokokopijne wektory plazmidowe (np. serii pUC), otrzymywane są z hodowli znajdującej się w póznej fazie logarytmicznej wzrostu
- nisko- i średniokopijne (np. pBR322) powinny być przed izolacją amplifikowane.
Tylko tyle znalazłam na temat.
Klonowanie krótko opisane :
Klonowanie DNA - polega na wyseparowaniu odcinków DNA przy pomocy wektorów, którymi mogą być plazmidy, wirusy czy sztuczne chromosomy. Muszą one mieć dodatkowo zdolność do samodzielnej replikacji w komórce bakteryjnej bądź eukariotycznej. Klonowanie DNA przebiega w kilku etapach. Pierwszym etapem jest dobranie odpowiedniego enzymu restrykcyjnego, który jest zdolny do cięcia fragmentu DNA na przeznaczone do klonowania odcinki a także przecinałby DNA plazmidów. Po dobraniu takiej restryktazy enzym ligaza musi złączyć ze sobą tak pocięte fragmenty. W wyniku tego powstają cząsteczki zrekombinowanego DNA, w których fragment klonowanego DNA jest włączony do plazmidu. Następnie tak zrekombinowany plazmid zostaje wprowadzony do bakterii na drodze transformacji. Bakterią tą jest zazwyczaj Escherichia coli. W kolejnych podziałach bakteria wytwarza klon komórek, z których każda zawiera zrekombinowane plazmidy z klonowanym DNA. Można klonować zarówno losowo pocięte fragmenty DNA jak i ściśle określone odcinki między innymi geny. Obecnie powiela się DNA stosując technikę łańcuchowej reakcji polimerazy.
Zasady izolacji plazmidów:
1. Zawieszenie komórek w roztworze, który obniża wytrzymałość ścian komórkowych bakterii, hamuje DNazy przez chelatację jonów biwalencyjnych; niektórzy wraz z roztworem GTA dodają lizozym, trawiący ściany bakteryjne;
2. Zniszczenie komórek bakteryjnych – plazmid oraz pozostała składniki komórki są uwalniane do roztworu. Jednocześnie zachodzi odwracalna denaturacja kwasów nukleinowych oraz nieodwracalna denaturacja białek.
3. Renaturacja plazmidowego DNA. Oddzielenie plazmidowego DNA od białek, resztek błon i chromosomu bakteryjnego.
Ad. 1
Komórki po zwirowaniu zostają zawieszone roztworze GTE (Glukoza/Tris/EDTA). Dodatkowo można stosować lizozym.
Tris jest roztworu buforowym ma za zadanie utrzymać stałe pH (lekko zasadowe). EDTA jest związkiem chelatującym jony biwalencyjne (np. Ca2+, Mg2+). Wynikiem tego procesu są dwa efekty:
– zmniejszona stabilność ściany komórkowej bakterii spowodowana wiązaniem jonów Ca2+ przez EDTA; ściana komórkowa bakterii gram ujemnych składa się z jednej warstwy mureiny i otaczającej ją warstwy lipopolisacharydów, lipidów i lipoprotein; jak się wydaje, jony wapnia są potrzebne do zachowania stabilności warstwy lipopolisacharydowej;
– zahamowanie działania DNaz, przez jony magnezowe; bowiem te enzymy, jeśli aktywne mogły by pociąć plazmidowe DNA;
Glukoza jest dodana w celu zachowania właściwego ciśnienia osmotycznego; jest to ważne szczególnie podczas stosowania lizozymu, który prowadzi do powstania protoplastów, komórek pozbawionych ściany, a przez to wrażliwych na zewnętrzne ciśnienie osmotyczne; zbyt niskie ciśnienie osmotyczne (czyli środowisko hipotoniczne) spowodowało by pobieranie wody przez komórki i ich pęknięcie; środowisko izoosmotyczne lub słabo hiperosmotyczne nie jest szkodliwe dla protoplastów;
Ad. 2
W tym etapie do zawiesiny komórek bakteryjnych dodaje się alkalicznego roztworu NaOH/SDS. W zasadowym środowisku, przy udziale SDS dochodzi do lizy komórek bakteryjnych. Uwolnione białka są denaturowane przez SDS i NaOH. Genomowy i plazmidowy DNA ulega denaturacji pod wpływem zasadowego pH.
Po dodaniu NaOH/SDS w probówce znajduje się mieszanina zniszczonych błon, zdenaturowanych plazmidów, bakteryjnych chromosomów i białek, wolnych cząsteczek SDS i innych związków.
Ad. 3
Do roztworu lizatu dodawany jest octan potasu (bufor octanowy), który powoduje zmianę obniżenie pH. W efekcie jego działania plazmidowe DNA renaturuje szybko, podczas gdy chromosomowe DNA pozostaje zdenaturowane. Odmienna zdolność do renaturacji po obniżeniu pH jest istotą metody lizy alkalicznej. Pozwala na późniejsze łatwe oddzielenie DNA chromosomowego od plazmidowego. DNA genomowy wraz z białkami i fragmentami błon, wytrąca się w postaci serowatego osadu. Następnym krokiem jest wirowanie roztworu, by oddzielić plazmidowe DNA, które pozostaje rozpuszczone w supernatancie.
Po tym etapie otrzymana próbka może być dodatkowo odbiałczana mieszaniną fenol/chloroform, lub oczyszczana na minikolumnach będących fragmentem zestawów sprzedawanych przez firmy biotechnologiczne. Te czynności nie są uwzględnione w przedstawionym niżej, przykładowym protokole.
Otrzymany, oczyszczony DNA plazmidowy można precypitować w etanolu lub izopropanolu. Poniższy protokół uwzględnia ten proces.
Albo też link : http://arete.ibb.waw.pl/docs/node1.html
Kolumny : Systemy te na ogół oparte są zdolności złóż
krzemionkowych do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych, takich jak chlorowodorek guanidyny lub izothiocjanian guanidyny. Sole chaotropowe, powodują również rozpad błon komórkowych i denaturację białek, co sprzyja izolacji kwasów nukleinowych. Chaotropy ang. chaotropes, czyli ,,czyniące chaos'' są to substancje, które w roztworach wodnych wprowadzają silne zaburzenia w sieci wiązań wodorowych.
W zależności od skali, w jakiej przeprowadza się oczyszczanie, mogą to być tzw. minikolumny (rys. 1), w których przepływ roztworu przez membranę zawierającą złoża krzemionkowe uzyskuje się w wyniku wirowania całej kolumny w mikrowirówce, lub większe kolumny, w których roztwór przepływa grawitacyjnie. Złoża, przez które przechodzi roztwór, wychwytują specyficzne dla nich kwasy nukleinowe, tzn. DNA lub RNA, a pozostałe składniki roztworu, stanowiące zanieczyszczenie dla badanych prób, zostają zebrane w probówce znajdującej się poniżej filtra.
A, co tam, podzielę się z Wami ;DD W załączniku jest mniej więcej odpowiedź na pytanie co to jest transformacja bakterii i jakie są jej rodzaje.
Pytania, które mogą pojawić się we wtorek na laborkach z BKiIG:
- opisać wektory plazmidowe
- jakie są enzymy wykorzystywane w klonowaniu
- etapy klonowania
- rodzaje transformacji bakterii
- jakie są zadania kolumny przy izolacji DNA plazmidowego
- zasady izolacji DNA plazmidowego
Jeśli ktoś zna odpowiedzi na powyższe pytania (większość jest w wykładach prof. Rzeszowskiej, oprócz dwóch ostatnich) to fajnie byłoby, gdyby się podzielił ;]
http://zguw.ibb.waw.pl/~knbm/bmwi/podrek/biotech/biotech3.html
http://www.parasit.amp.edu.pl/seminars/22210.pdf
wektory plazmidowe:
- Wysokokopijne wektory plazmidowe (np. serii pUC), otrzymywane są z hodowli znajdującej się w póznej fazie logarytmicznej wzrostu
- nisko- i średniokopijne (np. pBR322) powinny być przed izolacją amplifikowane.
Klonowanie krótko opisane :
Klonowanie DNA - polega na wyseparowaniu odcinków DNA przy pomocy wektorów, którymi mogą być plazmidy, wirusy czy sztuczne chromosomy. Muszą one mieć dodatkowo zdolność do samodzielnej replikacji w komórce bakteryjnej bądź eukariotycznej. Klonowanie DNA przebiega w kilku etapach. Pierwszym etapem jest dobranie odpowiedniego enzymu restrykcyjnego, który jest zdolny do cięcia fragmentu DNA na przeznaczone do klonowania odcinki a także przecinałby DNA plazmidów. Po dobraniu takiej restryktazy enzym ligaza musi złączyć ze sobą tak pocięte fragmenty. W wyniku tego powstają cząsteczki zrekombinowanego DNA, w których fragment klonowanego DNA jest włączony do plazmidu. Następnie tak zrekombinowany plazmid zostaje wprowadzony do bakterii na drodze transformacji. Bakterią tą jest zazwyczaj Escherichia coli. W kolejnych podziałach bakteria wytwarza klon komórek, z których każda zawiera zrekombinowane plazmidy z klonowanym DNA. Można klonować zarówno losowo pocięte fragmenty DNA jak i ściśle określone odcinki między innymi geny. Obecnie powiela się DNA stosując technikę łańcuchowej reakcji polimerazy.
Zasady izolacji plazmidów:
1. Zawieszenie komórek w roztworze, który obniża wytrzymałość ścian komórkowych bakterii, hamuje DNazy przez chelatację jonów biwalencyjnych; niektórzy wraz z roztworem GTA dodają lizozym, trawiący ściany bakteryjne;
2. Zniszczenie komórek bakteryjnych – plazmid oraz pozostała składniki komórki są uwalniane do roztworu. Jednocześnie zachodzi odwracalna denaturacja kwasów nukleinowych oraz nieodwracalna denaturacja białek.
3. Renaturacja plazmidowego DNA. Oddzielenie plazmidowego DNA od białek, resztek błon i chromosomu bakteryjnego.
Ad. 1
Komórki po zwirowaniu zostają zawieszone roztworze GTE (Glukoza/Tris/EDTA). Dodatkowo można stosować lizozym.
Tris jest roztworu buforowym ma za zadanie utrzymać stałe pH (lekko zasadowe). EDTA jest związkiem chelatującym jony biwalencyjne (np. Ca2+, Mg2+). Wynikiem tego procesu są dwa efekty:
– zmniejszona stabilność ściany komórkowej bakterii spowodowana wiązaniem jonów Ca2+ przez EDTA; ściana komórkowa bakterii gram ujemnych składa się z jednej warstwy mureiny i otaczającej ją warstwy lipopolisacharydów, lipidów i lipoprotein; jak się wydaje, jony wapnia są potrzebne do zachowania stabilności warstwy lipopolisacharydowej;
– zahamowanie działania DNaz, przez jony magnezowe; bowiem te enzymy, jeśli aktywne mogły by pociąć plazmidowe DNA;
Glukoza jest dodana w celu zachowania właściwego ciśnienia osmotycznego; jest to ważne szczególnie podczas stosowania lizozymu, który prowadzi do powstania protoplastów, komórek pozbawionych ściany, a przez to wrażliwych na zewnętrzne ciśnienie osmotyczne; zbyt niskie ciśnienie osmotyczne (czyli środowisko hipotoniczne) spowodowało by pobieranie wody przez komórki i ich pęknięcie; środowisko izoosmotyczne lub słabo hiperosmotyczne nie jest szkodliwe dla protoplastów;
Ad. 2
W tym etapie do zawiesiny komórek bakteryjnych dodaje się alkalicznego roztworu NaOH/SDS. W zasadowym środowisku, przy udziale SDS dochodzi do lizy komórek bakteryjnych. Uwolnione białka są denaturowane przez SDS i NaOH. Genomowy i plazmidowy DNA ulega denaturacji pod wpływem zasadowego pH.
Po dodaniu NaOH/SDS w probówce znajduje się mieszanina zniszczonych błon, zdenaturowanych plazmidów, bakteryjnych chromosomów i białek, wolnych cząsteczek SDS i innych związków.
Ad. 3
Do roztworu lizatu dodawany jest octan potasu (bufor octanowy), który powoduje zmianę obniżenie pH. W efekcie jego działania plazmidowe DNA renaturuje szybko, podczas gdy chromosomowe DNA pozostaje zdenaturowane. Odmienna zdolność do renaturacji po obniżeniu pH jest istotą metody lizy alkalicznej. Pozwala na późniejsze łatwe oddzielenie DNA chromosomowego od plazmidowego. DNA genomowy wraz z białkami i fragmentami błon, wytrąca się w postaci serowatego osadu. Następnym krokiem jest wirowanie roztworu, by oddzielić plazmidowe DNA, które pozostaje rozpuszczone w supernatancie.
Po tym etapie otrzymana próbka może być dodatkowo odbiałczana mieszaniną fenol/chloroform, lub oczyszczana na minikolumnach będących fragmentem zestawów sprzedawanych przez firmy biotechnologiczne. Te czynności nie są uwzględnione w przedstawionym niżej, przykładowym protokole.
Otrzymany, oczyszczony DNA plazmidowy można precypitować w etanolu lub izopropanolu. Poniższy protokół uwzględnia ten proces.
Albo też link : http://arete.ibb.waw.pl/docs/node1.html
Kolumny : Systemy te na ogół oparte są zdolności złóż
krzemionkowych do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych, takich jak chlorowodorek guanidyny lub izothiocjanian guanidyny. Sole chaotropowe, powodują również rozpad błon komórkowych i denaturację białek, co sprzyja izolacji kwasów nukleinowych. Chaotropy ang. chaotropes, czyli ,,czyniące chaos'' są to substancje, które w roztworach wodnych wprowadzają silne zaburzenia w sieci wiązań wodorowych.
W zależności od skali, w jakiej przeprowadza się oczyszczanie, mogą to być tzw. minikolumny (rys. 1), w których przepływ roztworu przez membranę zawierającą złoża krzemionkowe uzyskuje się w wyniku wirowania całej kolumny w mikrowirówce, lub większe kolumny, w których roztwór przepływa grawitacyjnie. Złoża, przez które przechodzi roztwór, wychwytują specyficzne dla nich kwasy nukleinowe, tzn. DNA lub RNA, a pozostałe składniki roztworu, stanowiące zanieczyszczenie dla badanych prób, zostają zebrane w probówce znajdującej się poniżej filtra.
Zasady izolacji plazmidów:
1. Zawieszenie komórek w roztworze, który obniża wytrzymałość ścian komórkowych bakterii, hamuje DNazy przez chelatację jonów biwalencyjnych; niektórzy wraz z roztworem GTA dodają lizozym, trawiący ściany bakteryjne;
2. Zniszczenie komórek bakteryjnych – plazmid oraz pozostała składniki komórki są uwalniane do roztworu. Jednocześnie zachodzi odwracalna denaturacja kwasów nukleinowych oraz nieodwracalna denaturacja białek.
3. Renaturacja plazmidowego DNA. Oddzielenie plazmidowego DNA od białek, resztek błon i chromosomu bakteryjnego.
Ad. 1
Komórki po zwirowaniu zostają zawieszone roztworze GTE (Glukoza/Tris/EDTA). Dodatkowo można stosować lizozym.
Tris jest roztworu buforowym ma za zadanie utrzymać stałe pH (lekko zasadowe). EDTA jest związkiem chelatującym jony biwalencyjne (np. Ca2+, Mg2+). Wynikiem tego procesu są dwa efekty:
– zmniejszona stabilność ściany komórkowej bakterii spowodowana wiązaniem jonów Ca2+ przez EDTA; ściana komórkowa bakterii gram ujemnych składa się z jednej warstwy mureiny i otaczającej ją warstwy lipopolisacharydów, lipidów i lipoprotein; jak się wydaje, jony wapnia są potrzebne do zachowania stabilności warstwy lipopolisacharydowej;
– zahamowanie działania DNaz, przez jony magnezowe; bowiem te enzymy, jeśli aktywne mogły by pociąć plazmidowe DNA;
Glukoza jest dodana w celu zachowania właściwego ciśnienia osmotycznego; jest to ważne szczególnie podczas stosowania lizozymu, który prowadzi do powstania protoplastów, komórek pozbawionych ściany, a przez to wrażliwych na zewnętrzne ciśnienie osmotyczne; zbyt niskie ciśnienie osmotyczne (czyli środowisko hipotoniczne) spowodowało by pobieranie wody przez komórki i ich pęknięcie; środowisko izoosmotyczne lub słabo hiperosmotyczne nie jest szkodliwe dla protoplastów;
Ad. 2
W tym etapie do zawiesiny komórek bakteryjnych dodaje się alkalicznego roztworu NaOH/SDS. W zasadowym środowisku, przy udziale SDS dochodzi do lizy komórek bakteryjnych. Uwolnione białka są denaturowane przez SDS i NaOH. Genomowy i plazmidowy DNA ulega denaturacji pod wpływem zasadowego pH.
Po dodaniu NaOH/SDS w probówce znajduje się mieszanina zniszczonych błon, zdenaturowanych plazmidów, bakteryjnych chromosomów i białek, wolnych cząsteczek SDS i innych związków.
Ad. 3
Do roztworu lizatu dodawany jest octan potasu (bufor octanowy), który powoduje zmianę obniżenie pH. W efekcie jego działania plazmidowe DNA renaturuje szybko, podczas gdy chromosomowe DNA pozostaje zdenaturowane. Odmienna zdolność do renaturacji po obniżeniu pH jest istotą metody lizy alkalicznej. Pozwala na późniejsze łatwe oddzielenie DNA chromosomowego od plazmidowego. DNA genomowy wraz z białkami i fragmentami błon, wytrąca się w postaci serowatego osadu. Następnym krokiem jest wirowanie roztworu, by oddzielić plazmidowe DNA, które pozostaje rozpuszczone w supernatancie.
Po tym etapie otrzymana próbka może być dodatkowo odbiałczana mieszaniną fenol/chloroform, lub oczyszczana na minikolumnach będących fragmentem zestawów sprzedawanych przez firmy biotechnologiczne. Te czynności nie są uwzględnione w przedstawionym niżej, przykładowym protokole.
Otrzymany, oczyszczony DNA plazmidowy można precypitować w etanolu lub izopropanolu. Poniższy protokół uwzględnia ten proces.
Albo też link : http://arete.ibb.waw.pl/docs/node1.html
Kolumny : Systemy te na ogół oparte są zdolności złóż
krzemionkowych do wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych, takich jak chlorowodorek guanidyny lub izothiocjanian guanidyny. Sole chaotropowe, powodują również rozpad błon komórkowych i denaturację białek, co sprzyja izolacji kwasów nukleinowych. Chaotropy ang. chaotropes, czyli ,,czyniące chaos'' są to substancje, które w roztworach wodnych wprowadzają silne zaburzenia w sieci wiązań wodorowych.
W zależności od skali, w jakiej przeprowadza się oczyszczanie, mogą to być tzw. minikolumny (rys. 1), w których przepływ roztworu przez membranę zawierającą złoża krzemionkowe uzyskuje się w wyniku wirowania całej kolumny w mikrowirówce, lub większe kolumny, w których roztwór przepływa grawitacyjnie. Złoża, przez które przechodzi roztwór, wychwytują specyficzne dla nich kwasy nukleinowe, tzn. DNA lub RNA, a pozostałe składniki roztworu, stanowiące zanieczyszczenie dla badanych prób, zostają zebrane w probówce znajdującej się poniżej filtra.
Pytania, które mogą pojawić się we wtorek na laborkach z BKiIG:
- opisać wektory plazmidowe
- jakie są enzymy wykorzystywane w klonowaniu
- etapy klonowania
- rodzaje transformacji bakterii
- jakie są zadania kolumny przy izolacji DNA plazmidowego
- zasady izolacji DNA plazmidowego