Katarzyna Zagórska

Aleksandra Ruszkowska

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Laboratorium Biochemia I

Ćwiczenie B

Kinetyka enzymatyczna II

1. Cel ćwiczenia:

Ustalenie typu hamowania oraz wyznaczenie stałej hamowania dla jonów fosforanowych – inhibitorów fosfatazy kwaśnej z ziemniaka.

2. Wstęp teoretyczny

Kinetyka reakcji katalizowanych enzymatycznie polega na badaniu zmian szybkości reakcji zależnych od specyficzności enzymu do substratu i stężenia reagentów. Opisując kinetykę takich reakcji używa się modelu, który składa się z szeregu reakcji następujących po sobie. Do tych reakcji zaliczamy: oddziaływanie enzymu z substratem, związanie się enzymu z substratem ( kompleks enzym-substrat), przekształcenie substratu w produkt oraz odszczepienie enzymu( może on wziąć udział w kolejnej reakcji) od substratu. Zakładając, że proces jest nieodwracalny ( tzn. ze z produktów nie powstają substraty) a stężenie początkowe enzym jest znacznie mniejsze od stężenia początkowego substratu oraz w czasie nie mamy do czynienia ze zmiana stężenia kompleks-substrat mamy spełnione równanie Michaelis’a-Menten:

gdzie:

V-szybkość reakcji

[S]- stężenie substratu

V max - szybkość maksymalna reakcji ( wszystkie dostępne cząsteczki enzymu związane są z substratem)

K_M - stała Michaelisa (jest to stężenie substratu przy którym reakcja osiąga polowe swojej szybkości maksymalnej)

Inhibitory są to substancje zmniejszające szybkość reakcji, ponieważ wiążą się one np. w miejscu aktywnym enzymu uniemożliwiając w ten sposób związanie się substratu z tym enzymem. Kiedy zwiąże się taki inhibitor na stale z substratem mówimy o inhibicji nieodwracalnej, gdy jednak manipulując warunkami reakcji inhibitor odłączy się od enzymu mówimy o inhibicji odwracalnej. Wyróżniamy także, inhibicje kom petycyjną, gdy inhibitor wiąże się w tym samym miejscu co substrat ( wówczas szybkość maksymalna nie ulega zmianie, ale rośnie stała Michaelis’a), oraz inhibicje niekompetycyjna, inhibitor wiąże się w innym miejscu enzymu niż substrat wówczas. Znaczna część enzymów wykazuje jednak cechy obu typów hamowania co określamy inhibicją mieszaną.

3. Materiały użyte w doświadczeniu:

Odczynniki:

- 0.25 M bufor octanowy

- 0.5 M wodorotlenek sodu

- 5 mM roztwór p-nitrofenylofosforanu w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0

- roztwór fosfatazy kwaśnej z ziemniaka w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0, C_E=0,08 mg/ml

- 5 mM roztwór Na₂HPO₄ (inhibitor) w 0.25 M buforze octanowym o pH 5.0

Szkło i aparatura:

- probówki chemiczne

- kolba miarowa ad 10 ml

- pipety automatyczne i tipsy

- kuwety

- Specol

- termostat nastawiony na 37ºC

4. Przebieg ćwiczenia

• Sprawdzenie aktualnej aktywności enzymu wykorzystanego w ćwiczeniu A. pomiar szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu

• Do 7 suchych probówek podpisanych zgodnie z tabela 1 wprowadziłyśmy poniżej wymienione roztwory

• 0,25 M bufor octanowy o pH= 5.0

• 5.0 mM p-nitrofenylofosforan- substrat

W ilościach zgodnych z tabela 1

• Roztwory inkubowałyśmy przez 5 min w 37°C

• Do probówek 12-18 dodałyśmy roztwór fosfatazy i inkubowałyśmy próbki przez 25 min w 37 °C

• Po upływie 25 minut inkubacji do wszystkich probówek dodaliśmy po 2 ml 0.5 M roztworu NaOH, który spowodował przerwanie reakcji katalizowanej przez enzym

• Zmierzyliśmy absorbancję roztworów przy długości fali 410nm względem próby 18 (odnośnik) a wyniki pomiarów zapisałyśmy w tabeli 1.

• Pomiar aktywności enzymatycznej fosfatazy w obecności inhibitora

• Do 11 suchych probówek podpisanych zgodnie z tabela 2 dodałyśmy:

• 0.25 M bufor octanowy o pH= 5.0

• 5.0 mM p-nitrofenylofosforan – substrat

• 5mM roztwór HPO₄ ^2-

W ilościach zgodnych z tabela 2.

• Roztwory inkubowałyśmy przez 5 minut w 37 °C

• Do probówek 1-11 dodałyśmy roztwór fosfatazy

• Próby inkubowałyśmy 25 min w 37 °C

• Po upływie czasu inkubacji do wszystkich probówek dodałyśmy po 2 ml 0.5 M roztworu NaOH, który spowodował przerwanie reakcji katalizowanej przez enzym

• Zmierzyłyśmy absorbancję roztworów przy długości fali 410 nm względem próby 11 (odnośnika )

5. Opracowanie wyników:

Obliczenie masy fosfatazy w mieszaninie reakcyjnej m_E [mg]. Objętość mieszaniny reakcyjnej V_r= 1.90 ml.

C_E^o = 0.08 mg/ml

V_E = 0.10 [ml]

V_r =1.90 [ml]

C _{E =} C_E^o · V _E / V_r

C _E = (0.08mg/ml · 0.10 ml) / 1.90 ml = 4.21·10^-3 mg/ml

m_E= 0.10 ml ·0.08 mg/ml = 0.008 mg

Sprawdzenie aktualnej aktywności enzymu wykorzystywanego w ćwiczeniu A. Pomiar szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu.

Tabela 1.

Nr próbki	V buforu [ml]	V substratu [ml]	V enzymu [ml]	V NaOH [ml]	A410	∆ A410/kor/ z ćw. A*
12	1.70	0.10	0.10	2.0	0.128	0,122
13	1.60	0.20	0.10	2.0	0.185	0,178
14	1.35	0.45	0.10	2.0	0.306	0,291
15	1.05	0.75	0.10	2.0	0.321	0,294
16	0.80	1.00	0.10	2.0	0.404	0,363
17	0.50	1.30	0.10	2.0	0.416	0,367
18	1.80	-	0.10	2.0	odnośnik	-

* z ćw. A „Kinetyka enzymatyczna I” bierzemy odpowiednie wartości A’₄₁₀

∆ A_410/kor/ = A₄₁₀ – A’₄₁₀

Przykładowe obliczenia:

Nr próbki:

12. ∆ A_410/kor/ = 0.128 – 0.06 = 0.122

13. ∆ A_410/kor/ = 0.185 – 0.07 = 0.178

Analogicznie wykonano obliczenia do pozostałych próbek i zamieszczono je w tabeli 1.

Pomiar aktywności enzymatycznej fosfatazy w obecności inhibitora

Tabela 2.

Nr próbki	V buforu [ml]	V p-nitrofenylofosforanu [ml]	V HPO4^2- [ml]	V enzymu [ml]	V NaOH [ml]	A410	∆ A410/kor/ z ćw. A
1	1.65	0.05	0.10	0.10	2.0	0.061	0.059
2	1.60	0.10	0.10	0.10	2.0	0.096	0.090
3	1.55	0.15	0.10	0.10	2.0	0.126	0.120
4	1.50	0.20	0.10	0.10	2.0	0.190	0.183
5	1.40	0.30	0.10	0.10	2.0	0.224	0.214
6	1.25	0.45	0.10	0.10	2.0	0.288	0.273
7	1.10	0.60	0.10	0.10	2.0	0.325	0.303
8	0.95	0.75	0.10	0.10	2.0	0.378	0.351
9	0.70	1.00	0.10	0.10	2.0	0.428	0.387
10	0.40	1.30	0.10	0.10	2.0	0.480	0.431
11	1.70	-	0.10	0.10	2.0	odnośnik	-

Przykładowe obliczenia:

Nr próbki:

1. ∆ A_410/kor/ = 0.061 – 0.002 = 0.059

2. ∆ A_410/kor/ = 0.096 – 0.006 = 0.090

Analogicznie wykonano obliczenia do pozostałych próbek i zamieszczono je w tabeli 2.

Obliczenie stężenia substratu (p-nitrofenylofosforanu) ([S] liczone w μM) w mieszaninie reakcyjnej oraz jego odwrotność 1/ [S].

V_r =1.90 [ml]

Stężenie p-nitrofenylofosforanu: C^o_s= 5.0 mM

Obliczenia wykonane dla odpowiednich objętości p-nitrofenylofosforanu (substratu).

Dla V_s1= 0.05 ml

[S]₁= C^o_s ·V_s / V_r = 5 mM · 0.05 ml / 1.90 ml = 0.13158 mM = 131.58 μM

1/ [S]₁ = 7,59 · 10^-3 = 0.00759

Dla V_s2 = 0.10 ml [dm³/μmol]

[S]₂ = 5 mM · 0.10 ml / 1.90 ml = 0.26316 mM = 263.16 μM

1/ [S]₂ = 3.79 · 10^-3 = 0.00379 [dm³/μmol]

Analogicznie wykonano pozostałe obliczenia [S] i [1/S] dla reszty prób. Wyniki zostały zamieszczone w tabeli 3.

Obliczenie stężenia inhibitora (jonów fosforanowych), [I] liczone w μM.

V_r =1.90 [ml]

Stężenie inhibitora Cº_i = 5 mM

Objętość inhibitora użyta w doświadczeniu dla prób 1-11 V_i= 0.10 ml

Stężenie inhibitora w mieszaninie reakcyjnej:

C_i = n_i/ V_r = Cº_i ·V_i / V_r = 5 mM · 0.10 ml / 1.90 ml = 0.2632 mM = 263.2 μM

Obliczenie liczności p-nitrofenolu powstałej w reakcji enzymatycznej n^t_p na podstawie krzywej standardowej wykonanej w ćwiczeniu A.

Równanie naszej krzywej : y = 4.0089x

y – absorbancja ΔA₄₁₀/kor/

x- ilość powstałego p-nitrofenolu n^t_p

czyli A=4.0089· n, n = A / 4.0089,

Nr probówki:

1. n = A/4.0089 = 0.059/4,0089= 0.014717 μmol

Analogiczne obliczenia dla pozostałych probówek. Wyniki zamieszczono w tabeli 3.

Obliczenie szybkości powstawania p-nitrofenolu w reakcji enzymatycznej V_c. Czas reakcji t = 25 min.

V_c = n^t_p / t [μmol / min.]

Nr próbki:

1. V_c = 0.014717 μmol / 25 min. = 0.000589 [μmol / min.]

Analogiczne obliczenia dla pozostałych probówek. Wyniki zamieszczono w tabeli 3.

Obliczenie odwrotności szybkości powstawania p-nitrofenolu w reakcji enzymatycznej (1/V_c)

(1/V_c)=1/0,000589= 1698,686 [min/µmol]

Tabela 3

Nr próbki	∆ A410 /kor/	[S] [μM]	1/S [dm^3/μmol]	n^tp [μmol]	Vc [μmol/min.]	1/Vc [min/ μmol]
1	0.059	131.58	0.00759	0,014717	0,000589	1698,686
2	0.090	263.16	0.00379	0,02245	0,000898	1113,583
3	0.120	394.73	0.00253	0,029933	0,001197	835,1875
4	0.183	526.32	0.00189	0,045648	0,001826	547,6639
5	0.214	789.47	0.00126	0,053381	0,002135	468,3294
6	0.273	1184.2	0.00084	0,068098	0,002724	367,1154
7	0.303	1578.9	0.00063	0,075582	0,003023	330,7673
8	0.351	1973.6	0.00051	0,087555	0,003502	285,5342
9	0.387	2631.57	0.00038	0,096535	0,003861	258,9729
10	0.431	3421.05	0.00029	0,107511	0,0043	232,5348
12	0,122	263.15	0.0038	0,030432	0,001217	821,4959
13	0,178	526.32	0.00189	0,044401	0,001776	563,0478
14	0,291	1184.21	0.00084	0,072588	0,002904	344,4072
15	0,294	1973.6	0.00051	0,073337	0,002933	340,8929
16	0,363	2631.5	0.00038	0,090549	0,003622	276,095
17	0,367	3421.05	0.00029	0,091546	0,003662	273,0858

Wykresy na podstawie danych z tabeli 3.

1. zależności: V_c = f [S]

2. Lineweavera – Burka: 1/V_c = f (1/[S])

Obliczenie stałych Michaelisa K_M I K_M’ oraz szybkości maksymalnych V_max i V_max’ na podstawie wykresu b).

$$V = \frac{Vmax*\lbrack S\rbrack}{K_{M}*\lbrack S\rbrack}$$

$$\frac{1}{V} = \frac{K_{M} + \lbrack S\rbrack}{Vmax*\lbrack S\rbrack}$$

$$\frac{1}{V_{0}} = \frac{K_{M}}{\text{Vmax}}*\frac{1}{\lbrack S\rbrack} + \frac{1}{\text{Vmax}}$$

Dla reakcji z inhibitorem:

y=ax+b

y=207061x+ 205,68

b=1/Vmax= 205,68

V’_max=1/b=1/205,68=0,00486[$\frac{\text{μmol}}{\min}\rbrack$

K’_M= a* V’_max= 207061* 0,00486 = 1006,32 µM

Dla reakcji bez inhibitora:

y = 128832x + 166

b= 1/Vmax= 166

V_max= 1/b= 1/166= 0,00602[$\frac{\text{μmol}}{\min}\rbrack$

K_M= a*V_max= 128832* 0,00602= 775,56 µM

Na podstawie otrzymanych K_M, K_M', V_max, V_max' można stwierdzić, iż jest to hamowanie konkurencyjne , gdyż stała K_M została zwiększona pod wpływem inhibitora, a wartości V_max, V_max' są do siebie bardzo zbliżone. Różnice w wartościach V mogą wynikać z niedokładnych pomiarów podczas wykonywania ćwiczenia.

Obliczenie stałej hamowania:

K_I = [I] / [(K_M’ / K_M ) – 1]

K_I = 263.2 μM / [(1006,32 μM /775,56 μM) -1] = 883,81 μM

Tabela 4.

Vmax [μmol/min]	0.00602
Vmax’ [μmol/min]	0.00486
KM [μM]	775,56
KM’ [μM]	1006,32
KI [μM]	883,81

Wnioski:

Cel ćwiczenia został osiągnięty – wyznaczyłyśmy stałą hamowania dla jonów fosforanowych K_I wyniosła ona 883,81 μM. Ponadto określiłyśmy typ hamowania – według naszych wyników jest to hamowanie konkurencyjne, ponieważ stała K_M została znacznie zwiększona pod wpływem inhibitora a V_max zmieniła się nieznacznie (wyniki w powyższej tabelce). Roztwór Na₂HPO₄, który dodałyśmy do roztworu, a dokładniej jony HPO₄ ^2- hamowały nasz enzym w sposób odwracalny poprzez rywalizację z p-nitrofenylofosforanem o miejsce aktywne. Wyniki te są zgodne z naszymi oczekiwaniami, ponieważ wartość K_M dla reakcji z inhibitorem jest wyższa, ze względu na to, że potrzeba większej ilości substratu do osiągnięcia połowy szybkości maksymalnej prowadzonej reakcji.

Aby określić typ hamowania reakcji enzymatycznej musimy wyznaczyć wykres Lineweaver’a-Burka i obserwując jego zachowanie możemy stwierdzić typ inhibicji. Dzieje się tak dlatego, że przecięcia wykresów funkcji z osiami X i Y charakteryzują konkretny typ inhibicji. Porównując nasz wykres z wykresem modelowym możemy stwierdzić podobieństwo do wykresu dla inhibicji kompetycyjnej.