TWÓJ BIOTECHNOLOG

https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

Laboratorium z inżynierii genetycznej

Sprawozdanie z ćw. nr 3

Cel ćwiczenia: Przygotowanie insertu EcRDBD do klonowania (generowanie miejsc restrykcyjnych BamHI) poprzez reakcję PCR. Przygotowanie plazmid pGEX-2T do klonowania, poprzez elektroforetyczną analizę plazmidowego DNA oczyszczonego po trawieniu i defosforylacji oraz szacowanie jego stężeń. Elektroforeza analityczna oraz izolacja produktu PCR (protokół Clean-up) (A&A Biotechnology).

PRZEBIEG ĆWICZENIA

1. Przygotowanie insertu EcRDBD do klonowania (generowanie miejsc restrykcyjnych BamHI) – reakcja PCR:

• sporządzono MIX reakcji PCR: 21 µl pBS-EcR/EcoRI, 28,7 µl WR5, 29,4 µl WR6, 56 µl dNTP, 14 µl MgCl₂, 35 µl buforu dla polimerazy Taq, 158,9 µl H₂O oraz kontrolę 4,1 µl WR5, 4,2 µl WR6, 8 µl dNTP, 2 µl MgCl₂, 5 µl buforu dla polimerazy Taq, 25,7 µl H₂O,

• do probówki dodano 50 µl MIXu,

• do reakcji użyto dwóch starterów : WR5 (forward) oraz WR6 (reverse) w ilości 50 pmoli, matrycy: wektor pBlueScript zlinearyzowany enzymem EcoRI ( stężenie = 5 ng/µl),polimerazy: 1U polimerazy DNA Taq (FERMENTAS),

• do probówki zawierającej mieszaninę reakcyjną nałożono na powierzchnię 50 µl oleju parafinowego, w celu zapobiegnięcia parowaniu,

• przeprowadzono reakcję PCR składającą się z 8 etapów:

• 1: 95°C, 180 s, denaturacja (tzw. gorący start, po którym następuje dodanie 1 µl roztworu termo stabilnej polimerazy DNA Taq (FERMENTAS), w celu osiągnięcia wysokiej specyficzności reakcji),

• 2: 95°C, 60 s, denaturacja,

• 3: 58°C, 30 s, stapianie, 5 x

• 4: 72°C, 30 s, polimeryzacja,

• 5: 95°C, 60 s, denaturacja,

• 6: 72°C, 60 s, stapianie i polimeryzacja 15 x

• 7: 72°C, 12 s, dokończenie polimeryzacji,

• 8: 4°C, pauza, zakończenie (schłodzenie mieszaniny reakcyjnej),

1. Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania - elektroforetyczna analiza plazmidowego DNA oczyszczonego po trawieniu i defosforylacji oraz szacowanie jego stężeń:

• przygotowano próbkę do elektroforezy: 3 µl roztworu plazmidowego DNA po oczyszczaniu, 7 µl TE, 2 µl 6x buforu do próbek,

• na żel naniesiono przygotowaną próbkę oraz 5 µl markera wagowego FastRuler^TM DNA Ladder, Middle Range (MBI Fermentas),

• próbkę DNA plazmidu pGEX-2T poddano horyzontalnej elektroforezie analitycznej w żelu agarozowym (81x56x3 mm), o stężeniu 0,8%, przygotowanym w 1xTBE, zawierającym bromek etydyny w stężeniu 0,4 µg/ml,

• elektroforezę prowadzono w aparacie BIO-RAD, w buforze 1xTBE, przy stałym napięciu 70 V, przez ok. 50 minut

• żel analizowano w świetle UV przy fali o długości 254 nm

3. Elektroforeza analityczna produktów PCR:

• po przeprowadzonej reakcji PCR, 1/10 objętości mieszaniny reakcyjnej poddano elektroforezie analitycznej w żelu agarozowym (81x56x3 mm) o stężeniu agarozy 2%, przygotowanym w 1xTBE, zawierającym bromek etydyny w stężeniu 0,4 µg/ml,

• przygotowano próbkę do elektroforezy: 5 µl próbki po PCR, 5 µl TE, 2 µl 6x SB, oraz kontrolę: 5 µl próbki po PCR, 5 µl TE, 2 µl 6x SB,

• na żel naniesiono przygotowaną próbkę oraz 5 µl markera wagowego FastRuler^TM DNA Ladder, Middle Range (MBI Fermentas),

• elektroforezę prowadzono w aparacie BIO-RAD, w buforze 1xTBE, przy stałym napięciu 70 V, przez ok. 40 minut,

• żel analizowano w świetle UV przy fali o długości 254 nm,

• pozostałą ilość mieszaniny reakcyjnej pobrano z probówki po PCR, spod warstwy oleju parafinowego, przeniesiono do czystej i opisanej probówki Eppendorfa i przechowano w temp. -20°C.

3. Izolacja produktu PCR (protokół Clean-up) (A&A Biotechnology):

• do roztworu zawierającego produkt PCR dodano pięciokrotny nadmiar (ok. 200 µl) roztworu G, zawartość probówki dokładnie wymieszano, wystąpiły komplikacje w trakcie przenoszenia produktu PCR do probówki, dlatego założono ilość produktu PCR – 40 µg,

• mieszaninę krótko odwirowano w celu usunięcia resztek roztworu z wieczka i ścianek probówki,

• otrzymaną mieszaninę naniesiono na kolumnę do oczyszczania DNA i wirowano ok. 30 s przy ok. 10 000 x g,

• kolumnę wyciągnięto z probówki, przesącz przeniesiono do czystej probówki Eppendorfa, a kolumnę ponownie włożono do probówki,

• na złoże w kolumnie nałożono 600 µl roztworu A1 do płukania i wirowano ok. 2 min przy ok. 10 000 x g,

• kolumnę wyciągnięto z probówki, przesącz odrzucono, a kolumnę ponownie włożono do probówki; w celu osuszeniu złoża, probówkę z kolumną inkubowano ok. 3 minut w temp. pokojowej,

• osuszoną kolumnę umieszczono w nowej probówce Eppendorfa i na złoże w kolumnie nawarstwiono 15 µl buforu TE (tak, aby płyn całkowicie pokrył złoże),

• pozostawiono roztwór w temperaturze pokojowej na 1 min, a następnie wirowano 1 min przy ok. 10 000 x g,

• ponownie kolumnę wyciągnięto z probówki, przesącz odrzucono, kolumnę ponownie włożono do probówki, a na złoże w kolumnie nawarstwiono 15 µl buforu TE,

• probówkę pozostawiono na ok. 3 minuty w temp. pokojowej, następnie wirowano 1 min przy ok. 10 000 x g,

• przesącz znajdujący się na dnie probówki, zawierający docelowe DNA przeniesiono do czystej i opisanej probówki Eppendorfa oraz zanotowano zmierzoną objętość roztworu V=22 µl,

• oczyszczony produkt PCR, zawieszony w buforze TE, przechowano w temp. – 20 °C.

OMÓWIENIE WYNIKÓW I WNIOSKI

MARKER 1 2 3 4 5 6

5000 pz 4948 pz

Rys. 1. Wynik elektroforezy analitycznej w żelu agarozowym plazmidowego DNA oczyszczonego po trawieniu i defosforylacji. 1,2,3,4,5,6 - numery grup zajęciowych.

Na podstawie porównania z użytym markerem FastRuler DNA Ladder, Middle Range, stwierdzamy, że nasz wektor został dokładnie oczyszczony po trawieniu i defosforylacji. Wykazał on ślad na poziomie pasma 5000pz wektora, co zgadza się z jego dokładną długością, która wynosi 4948pz. Nasz zlinearylizowany wektor jest gotowy do ligacji z insertem.

MARKER KONTROLA 1 2 3 4 5 6

Rys. 2. Wynik elektroforezy analitycznej produktów PCR. 1,2,3,4,5,6 - numery grup zajęciowych.

Na podstawie porównania z użytym markerem FastRuler DNA Ladder, Middle Range można zauważyć, że ślad naszego produktu PCR pojawił się tuż poniżej pasma o długości 400pz markera. Ze względu na zasady ruchliwości elektroforetycznej cząsteczek DNA ( krótsze cząsteczki mają większą ruchliwość), stwierdzamy że nasz produkt PCR jest cząsteczką krótszą niż 400pz, a jego dokładna długość to 321pz. Próbka kontrolna nie wykazała żadnego śladu ze względu na brak matrycy w mieszaninie, co uniemożliwiło zajście reakcji PCR – nie powstał żaden produkt DNA.