Numer ćwiczenia F	Temat ćwiczenia Elektrochemiczne utlenianie kwasu szczawiowego	Data wykonania ćwiczenia: 27.02.2014
		Data oddania sprawozdania: 07.03.2014
Grupa A1	Tomasz Berniak Zbigniew Chałupka Piotr Chmielowski	Nazwisko sprawdzającego: dr Janusz
Uwagi:	Ocena:

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia było badanie zjawiska wygaszania fluorescencji związków biologicznie czynnych, rejestrowanie widm absorpcyjnych i emisyjnych wyżej wymienionych związków oraz badanie wpływu metali na właściwości związków tetrapirolowych.

1. Wstęp teoretyczny

Oddziaływanie fotonów z biologicznie czynnymi cząsteczkami powoduje wzbudzenie tej cząsteczki i przejście na wyższy poziom energetyczny. Wzbudzona cząsteczka może powrócić do stanu podstawowego na kilka różnych sposobów. Są nimi przejścia promieniste, związane z emisją kwantu promieniwoania: fluorescencja (10⁶-10⁹ s^-1), fosforescencja
(10^-2-10⁴ s^-1), przejścia bez promieniste: konwersja wewnętrzna (10¹¹-10¹³ s^-1) oraz przejście interkombinacyjne. Porównując przedstawione czasy trwania, fosforescencja trwa zdecydowanie dłużej od fluorescencji oraz konwersji wewnętrznej , która związana jest z rozpraszaniem energii w postaci ciepła. Fluorescencja jest procesem emitowania energii, który przebiega bez zmiany multipletowości, natomiast proces fosforescencji zachodzi zgodnie z zmianą multipletowości.

Fluorescencja jest to proces fizyczny powrotu cząsteczki ze stanu wzbudzonego do stanu podstawowego na skutek emisji kwantu energii w postaci światła w zakresie ultrafioletu lub promieniowania Roentgen’owskiego. Zjawisko fluorescencji może być badane za pomocą spektrofluorymetru, którego schemat blokowy umieszczono poniżej (rys.1):

rys.1a Schemat blokowy spekrofluorymetru

Czynnikiem decydującym o występowaniu fluorescencji w związku organicznym jest posiadanie struktur aromatycznych. Przykładowymi związkami, w których istnieje możliwość zaobserwowania fluorescencji, są: aminokwasy (tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina), barwniki roślinnie (β-karoten, chlorofil a- struktura przedstawiona poniżej), oraz witaminy ( ryboflawina). Każdy ze związków fotochemicznie aktywnych charakteryzowany jest za pomocą kilku istotnych parametrów: położenia maksimów absorbcji i emisji oraz wydajności kwantowej. Wydajność kwantowa to stosunek liczby kwantów wyemitowanych do zaabsorbowanych przez daną cząsteczkę. Przykładowo dla tryptofanu maksimum absorpcji przypada na 280 nm a emisji na 340 nm. Wydajność kwantowa tryptofanu wynosi 0,14. Zjawisko fluorescencji tryptofanu związane jest z obecnością grupy indolowej w cząsteczce związku.

rys. 1b. Struktura chlorofilu a.
http://pl.wikipedia.org/wiki/Plik:Chlorophyll_a_structure.svg

Fluorescencja może być wygaszana na kilka sposobów. Jednym z nich jest dodatek wygaszacza, który posiada dużą zdolność pochłaniania energii lecz nie może jej wyemitować. Wygaszanie może odbywać się na dwa sposoby: poprzez przeniesienie elektronu (mechanizm Dextera), bądź przekazanie energii (mechanizm Föstera). Typowym przedstawicielem wygaszaczy jest jodek potasu.

Zjawisko fluorescencji może mieć praktyczne zastosowanie w leczeniu nowotworów, a dokładnie w metodzie PDT. Metoda PDT polega na podaniu pacjentowi fotosensybilizatora, który lokuje się we wszystkich komórkach ciała. Poprzez precyzyjne naświetlanie komórek rakowych, fotosensybilizator generuje tlen singletowy, który bezpośrednio niszczy chore komórki. Zakres długości światła absorbowany przez fotosensybilizator powinien znajdować się w przedziale promieniowania podczerwonego.

W medycynie zastosowanie znalazł również bardzo popularny chemoterapeutyk
cis-platyna. Wprowadzenie związku do organizmu, z zwłaszcza metalu powoduje zajście sprzężenia w rezultacie czego następuje utworzenie reaktywnych postaci tlenu, które przyczyniają się do dezaktywowania komórek np. rakowych.

Wykonanie ćwiczenia

Część I- Pomiar widm wzbudzenia i fluorescencji albuminy i tryptofanu.

Odczynniki: albumina i tryptofan

1. Przygotowano roztwory tryptofanu o albuminy w PBS.

2. Wzbudzono wiązką promieniowania o długości 280 nm.

3. Dodawano porcjami dla odpowiedniej próbki roztwory: KI i CuSO_4.

Część II- Pomiar widm absorpcji, emisji i wzbudzenia związków biologicznie czynnych.

Odczynniki: Witamina B12, protoporfiryna IX, hemoglobina, MnTDCPP, TPP, etanol, PBS

Aparatura: Spektrofotometr- PerkinElmer,

1. Przygotowano roztwory: witaminy B12 w PBS; protoporfiryny IX w etanolu, hemoglobiny w PBS, MnTDCPP w etanolu i TPP w etanolu z dodatkiem kropli DMSO.

2. Zmierzono absorbancje przygotowanych roztworów.

3. Rozcieńczono roztwory do uzyskania maksimum absorbancji pasma Soreta wynoszącego około 0,15.

4. Za pomocą spektrofluorymetru zarejestrowano widma dla rozcieńczonych roztworów protoporfiryny IX, hemoglobiny.

Część III- Badanie wpływu metali na właściwości związków tetrapirolowych.

Odczynniki: chlorofil a, Zn chlorofil, Pt chlorofil

1. Zmierzono widma absorpcyjne przygotowanych roztworów chlorofilu

1. Opracowanie wyników

Część I- Pomiar widm wzbudzenia i fluorescencji albuminy i tryptofanu.

rys 2.a Widmo spektrofotometryczne dla albuminy i tryptofanu.

rys 2.b Widomo spektrofotometryczne wygaszenia widma albuminy związkiem CuSO

rys 2.c Widomo spektrofotometryczne wygaszenia widma albuminy związkiem KI

Część II- Pomiar widm absorpcji, emisji i wzbudzenia związków biologicznie czynnych.

Rys3a. Widmo absorpcyjne witaminy B12

Rys3b. Widmo absorpcyjne protoporfiryny IX

Rys3c. Widmo absorpcyjne MnTDCPP

Rys3d. Widmo absorpcyjne hemoglobiny

Rys4a. Nałożone widma absorpcyjne i fluorescencyjne witaminy B12

Rys4b. Nałożone widma absorpcyjne i fluorescencyjne hemoglobiny

Rys4c. Nałożone widma fluorescencyjne i absorpcyjne hemoglobiny

Część III- Badanie wpływu metali na właściwości związków tetrapirolowych.

Rys5. Widmo spektrofotometryczne zebranych związków

1. Wnioski

Celem doświadczenia było zbadanie fluorescencji związków biologicznie czynnych rejestrowanie widm absorpcyjnych i emisyjnych wyżej wymienionych związków oraz badanie wpływu metali na właściwości związków tetrapirolowych; cel został osiągnięty.

Część I

Badanie związków biologicznie czynnych za pomocą spektrofotometru pokazało że położenie pasma Soreta jest różne. Dla witaminy B12 maksimum pasma Soreta znajdowało się przy 361nm, natomiast dla związków tetrapirolowych pasmo Soreta znajduje się przy dłuższych falach, np. protoporfiryna IX ma maksimum przy 403 nm. Występowanie maksimum dla witaminy B12 przy wyżej wymienionej wartości może być spowodowane występowaniem dodatkowych struktur aromatycznych- pochodnych benzoimidazolu.

Maksima pasma Soreta dla protoporfiryny IX oraz dla hemoglobiny położone są przy zbliżonych wartościach (kolejno 403nm i 407nm) może to nasuwać stwierdzenie, iż wbudowanie metalu, w tym przypadku żelaza na II stopniu utlenienia, w strukturę protoporfiryny IX powoduje nieznaczną zmianę położenia pasma Soreta.

Jednakże zwracając uwagę na występowanie a zarazem intensywność pasm Q możemy dostrzec różnicę pomiędzy tymi strukturami. W przypadku protoporfiryny IX występują cztery maksima dla pasma Q natomiast dla hemoglobiny są one niewidoczne. Występowanie żelaza w strukturze hemoglobiny przyczynia się do wygaszania pasma Q. Związki charakteryzujące się występowanie pasma Q o dostatecznej intensywności mogą być wykorzystywane w terapii PDT jako fotosensybilizator, ponieważ absorbują długie fale światła wykazujące się głęboką penetracją tkanek ludzkich. Obecność intensywnego pasma Soreta, przy minimalnej intensywności pasm Q może klasyfikować związek jako użyteczny w diagnostyce w PDT.

Wbudowanie manganu do „free base” – protoporfiryny IX powoduję przesunięcie pasma Soreta o ok. 70 nm w kierunku fal światła czerwonego; zmniejsza także ilość maksimów pasma Q do jednego.

Analizując nałożone widma absorpcyjne i fluorescencyjne dla pierwszego przypadku – witamina B12 (rys.4a) , można stwierdzić brak intensywnej fluorescencji danego związku – występuję ona na poziomie szumów aparatury; związana jest ona z obecnością atomu kobaltu, który jest ferromagnetykiem.

Analogicznie do witaminy B12, hemoglobina ma słaba właściwości fluorescencyjne co przedstawia rys.4b. i tak samo jak dla witaminy B12 są one w zakresie szumu, co w tym przypadku spowodowanie jest obecności atomu ferromagnetycznego żelaza.

Protoporfiryna IX w przeciwieństwie do wyżej wymienionych- witaminy B12 i hemoglobiny, wykazuje fluorescencje z lokalnym maksimum przy 630 nm co jest spowodowane brakiem atomu metalu w centrum struktury tetrapirolowej.

Na rys.8 który przedstawia zestawienie widm chlorofilu a, Zn chlorofilu, Pt chlorofilu, protoporfiryny IX oraz witaminy B12 można zaobserwować, iż widmo witaminy B12 oraz protoporfiryny IX w zakresie 600- 700 nm wyraźnie odbiega od pozostałych.

Zmiana metalu z Mg dla chlorofilu a na Zn powoduję nieznaczna zmianę w pasm absorpcji i emisji, natomiast wbudowanie platyny w chlorofil powoduję przesuniecie maksimów w kierunku krótszych fal.