Zasada działania mikroskopu elektronowego skaningowego.

Źródłem elektronów jest tu także katoda wolframowa. Przyspieszone elektrony przechodzą przez otwór w anodzie, a następnie biegną przez pierwszą soczewkę redukcyjną, służącą do skupiania linii sił pola. W odróżnieniu od TEM pierwsza soczewka, zamiast tworzyć powiększony obraz redukuje wymiary źródła elektronów. Kolejne soczewki magnetyczne powodują jeszcze większą redukcję źródła (do 5000 razy). Dodatkowo biegnąca między soczewkami wiązka elektronowa poddawana jest działaniu pola magnetycznego, które powoduje jej odchylenie, w wyniku czego wiązka dokonuje analizy liniowej powierzchni badanego preparatu powodując wybicie elektronów wtórnych. Elektrony wtórne przyspieszane i wzmocnione przez kolektor są wykorzystywane jako sygnał dający informacje o danym punkcie preparatu. Sygnał ten trafia na siatkę sterującą lampy obrazowej monitora. SEM daje w porównaniu do TEM większą głębię ostrości, co pozwala na badanie preparatów o nierównej powierzchni. Jednak należy też zauważyć, iż mimo wszystko ma on gorsze zdolności rozdzielcze (około 10 nm).

Przygotowanie materiału biologicznego.

Materiał biologiczny przed analizą jego ultrastruktury w mikroskopie elektronowym wymaga odpowiedniej preparatyki. Małe obiekty, takie jak wirusy czy też cząsteczki chemiczne można badać po zastosowaniu cieniowania lub barwienia negatywowego, natomiast duże struktury wymagają zastosowania bardziej skomplikowanej techniki ultraskrawania, ewentualnie wykonania repliki powierzchniowej.

Przygotowanie małych obiektów biologicznych:

• Cieniowanie - technika wykorzystująca metal ciężki, który zazwyczaj wyparowuje z punktowego źródła i pada skośnie na powierzchnię pokrytą fragmentami badanej próby.

• Wybarwianie negatywne - polega na uwidacznianiu obrysów cząstek przez ich zatapianie w materiale gęstym elektronowo (np. kwas fosforowolframowy). Badane cząstki są wtedy widoczne jako obszary jasne na względnie ciemnym tle.

Przygotowanie dużych obiektów biologicznych:

• Replika powierzchni - wykonywana jest przez napylenie na powierzchnię obiektu w warunkach próżni cienkiej warstwy łatwo przylegającego materiału o niskiej masie cząsteczkowej, np. węgla. Powstały w ten sposób bardzo cienki odcisk zdejmuje się, a następnie nakłada na zwykłą siateczkę mikroskopową.

• Ultraskrawanie - jest to najbardziej użyteczna i najczęściej stosowana metoda. Polega ona na wykonaniu ultracienkich skrawków po uprzednim utrwaleniu materiału. Skrawki te poddaje się następnie kontrastowaniu.

W przypadku mikroskopu elektronowego skaningowego sposób przygotowywania preparatów jest różny w zależności od rodzaju badanego materiału. Wymagane jest aby powierzchnia preparatu przewodziła ładunek elektryczny, co uzyskuje się poprzez napylenie na nią cienkiej warstwy (ok. 20 nm) metalu ciężkiego (złota, palladu, srebra, chromu lub miedzi). Dodatkowo w przypadku materiału miękkiego należy go najpierw utrwalić i odwodnić, przy czym stosuje się tu te same techniki, co przy utrwalaniu preparatów do obserwacji w mikroskopie elektronowym transmisyjnym. Bardzo ważnym aspektem mikroskopii elektronowej skaningowej jest odporność materiału biologicznego na bombardowanie elektronami i warunki próżni, ponieważ dla prawidłowej obserwacji nie może ulec zniszczeniu struktura powierzchniowa obiektu.