IPTG [3] jest wysoce stabilnym,
syntetycznym analogiem laktozy.
Inaktywuje represor lac i jako sztuczny
substrat indukuje syntezę B-galaktozydazy,
enzymu, który wspiera utylizację laktozy.
Zastosowanie
1. Różnicowanie koloni zrekombinowanych
(białe) i nierekombinowanych (niebieskie
2. Indukcja ekspresji genów
pod kontrolą promotora lac.
X-gal – sztuczny indukator B-galktozydazy
(bezinteresowny) stosowany
w celu detekcji aktywności galaktozydazy.
MCS – miejsce wielokrotnego
klonowania = polilinker. Pozwala
na swobodny dobór odpowied.
do klonowania enzymu.
SANGLER [12]
1. Aby uzyskać cz.DNA zakończoną
określonym nukleotydem stosuje
się syntezę nowej nici DNA
2. Materiał wyjściowy to ssDNA.
3. Polimeraza DNA posiada możliwość
wbudowania w syntetyzowaną nić ddNTP,
które hamuje wydłużanie nici.
Polimeraza do sekwencjonow. musi mieć:
A/ wysoką procesywność (syntetyzuje
odcinek aż do przyłączenia ddNTP)
B/ brak aktywności egzonukleazy 5’-3’
(usunięcie końca 5’ nowego łańcucha
uniemożliwi prawidłowy odczyt prążków)
C/ brak aktyw.egz.3’-5’(nieusuwanie
wbudowanych ddNTP, kończących łańcuchy)
Sekwentaza - ↑procesywność, brak aktyw.
egzo-olitycznej., duża szybkość reakcji.
Sekwencj.cykliczne
Zasada ta sama (z ddNTP)
Wykorzystuje zmodyfikowaną polimerazę Taq.
+ potrzeba mało DNA do reakcji
+ dsDNA można traktować jako matrycę
Zrekombinowane DNA [6]
1. Przygotowanie fragm.DNA
i wektora do klonowania
2. Ligacja wektora i wstawki
3. Wprowadzenie DNA do gospodarza
4. Analiza transformantów
Transformacja [6]– pobranie nagiego DNA
z podłoża do komórek. Naturalnie potrafią
to G+ bakt. Najłatwiej pobrać liniowy
natywny dsDNA. Zdolność trasf.u bakt.
określa stan kompetencji (warunk genetycz)
1. Metodą chemiczną
Najwyższa wydajność jest gdy: szczep
biorcy jest bezplazmidowy, ma
nieaktywny system restrykcyjny,
plazmid jest stosunkowo mały i ma
formę cccDNA. DNA powinien być
maxymalnie oczyszczony. Nadmiar DNA
NIE wpływa na zmianę wydajności.
2. Elektrotransofm. (krótki puls prądu
o b.↑ natęż., przez zawiesinę kom
= przejściowe pory do 2nm).
(+) wprowadzanie b.dużych cz.DNA
(+) b.↑wydajność transofmacji
(-) możliwość zabicia kom.bakt.
Opisz transformacja u bakterii:
wyminić u bakt ze plazmid wchodzi do kom.bakt.-met.chemiczna
I czynniki
Opisz metodę SANGERA
chodzi o to ze w klasycznej masz 4 probowki
przylacza sie starter
dobudowuje do matrycy komplementarna nic polimeraza
gdy zamiast nukeotydu wstai ddNTP to zostanie zahamowane
reakcja
powstaje nam jakiejs dlugosci fragment
potem wrzucamy to na elektrofereza
i mamy klisze,
ktora sobie analizujemy
:P
no mozesz wnikac w temat jaka powinna byc temperatura prawidlowa reakcji itd
ze mozesz jeszcze wyznakowac te fragmenty w celu lepszego uwidocznienia
Hybrydyzacja [7] – powstawanie stabilnych
struktur 2niciowych z cząsteczek 1nić.
o komplementarnych sekwencjach
nukleotydów (min. 17 nt). Należy jednak
dysponować: sondą molekularną (odp.
przygotow.,wyznakowany fragm.DNA/RNA)
i umieścić docelowy kw.nukl. na filtrze.
Znakowanie: radioaktywne izotopami (detekcja:
autoradiografia z filmem wrażliw.na pormieni.)
Nieradioakt.: zw.fluorescencyj.(det.:odpowied.
przyrządy opty.)/immunochemiczne/cyto-
(detekc:przeciwciała specyf.dla danego haptenu)
WARUNKI: min.10yg materiału związanego
z filtrem// stęż sondy max 100ng/ml
//r-r o wysokim stęż soli // 65-68*C dla
1M NaCl lub 42*C dla 1M NaCl+50%formanid
// 15h w r-r H20 / 24h w rr z formamidem.
BLOTTING – proces przenoszenia DNA
z żelu na membranę
[zdenaturowany kw.nukl i sonda molek.!!!]
Selekcja [3] zrekombinowanych wekt. może
zachodzić przez zahamowanie namnażania
się kom.z niezrekombinowanym plazmidem.
Taki wektor posiada GEN LETALNY dla kom.
gosp. Insercja klonowanego DNA
dezaktywuje ekspresję letalnego genu
pozwalając na wzrost rekombinantów.
Transformacja [6]– pobranie nagiego DNA z
podłoża do komórek. Naturalnie potrafią
to G+ bakt. Najłatwiej pobrać liniowy
natywny dsDNA.
1. Metodą chemiczną
2. Elektrotransofm. (krótki puls prądu
o b.↑ natęż., przez zawiesinę kom
= przejściowe pory do 2nm)
3. Mikrowstrzeliwanie
4. Lipofekcja (zwykle z DNA bezwektor.)
5. Mikroiniekcja dojądrowa
(DNA bezwektorowe)
- wstrzykiw. DNA do j.kom.
za pomocą szklanych mikroigieł
6. Transfekcja (użycie
zrekombinowanych wekt.wirus)
Wektory DNA: [3]
- plazmidy
- bakteriofagi
- kombinacje plazmidowo-fagowe: kosmity…
Dobry wektor: [3] 1. Posiada oriV
(autonomiczna replik.)
2. Marker selekcyjny (gen kodujący B.
odpowiedzialne za wyróżnialne cechy fenot.)
3. MCS – msc wielok.klonow.
4. Niezdolny do przezycia poza kom.gosp.
5. Namnaża się w niewielu szczepach
6. Brak zdoności koniugacyjnych
7. Niewielki (<10kpz)
Wektory plazmidowe: [najważ.są sekw.
odpowiedz. za inicjację replik.=oriV]
a/ ogólnego przeznaczenia (proste
powielanie wybranego genu)
b/ do zadań specjalnych (produkcja B.
/badanie włąsciw.odcinka DNA
/ stabilne powiel.dużych fragm.)
B1/ do transkrypcji in vitro(z promotorami
bateriof T3/37/SP6 przed msc.wstaw.DNA)
Do wydajnej produkcji RNA w in vitro.
B2/ ekspresyjne (z silnym regulowanym
promotorem rozpoznawanym przez polimer.
RNA gosp.=inicjacja transkr.wiele X/min)
B3/ do badania właściw.sklonow.genu
/odc.DNA(np.promot)(DNA wprowadzane
w wekt. Przy genie reporterowym)
B4/ do rekombinacji nietyp.frgm.DNA
(np. po amplifikacji w rekcji PCR)
Wekt.FAGOWE: [4]
a/ bakteriofag lambda – ma 1nić lepkie końce
COS o 12pz, odpowiedzialne za łączenie
B.DNA faga. Takie DNA bd zapakowane
płaszcz B.faga. Środkowa cz.15pz można zastąp.
obcym DNA po czym zapakowana do główki.
b/ bakeriof P1 (delecyjny genom faga P1.
Środek do 125 pz = konstrukcja biblio.genom.)
c/ bak-f M13 (w kom. syntetyzow.jest
2ga nić DNA, w dsDNA ulega replik.
Powst. ssDNA pakowane w osłonki i uwalniane)
KOMBINACJE [4]: Fagemidy (po wprowadzeniu
do wekt.plazm. fragm. ORI z 1nićowego
bak-f.M13/f1)
Służą do otrzymywania 1nić.kopii DNA.
1nić matryce stosowane do sekwencj.DNA
/synt.znakowanego radioakt.1nić DNA.
Kosmidy (wekt.plazm. z sekw. COS faga sigma)
Do konstrukcji bibliotek genom.
Fosmidy (mają msc startu repl.z plazmidu
F i sekw.COS z f.sigma.)
Mniejsza ilość kopii/kom = ↑stabilność.
Wekt.DROŻDŻOWE – wekt.wahadłowe! [4]
O strukturach typowych dla eukar.,
ale są 1kom.//B.mogą podlegać modyfik.
potranslacyjnym.//klonowane geny
mogą mieć sekwencje intronowe.
W.wahadł: 2 odrębne msc stratu repl.
//2 typy markerów selekcyjnych.
YAC: cz.procar: (plazmidowe ori i marker selekcyj)
Cz. Euk: (odc. Ori ARS, telomery, centromer CEN,
geny selekc.-NIE na antybiotyk!, komlex expresyjny)
Min.1 unikalne msc re stryk.do klonowania obcego DNA.
Wekt.retrowirusowe [4]: lentivirusy
(HIV; zakażają kom dzielące i nie-)
Wekt. adenowirusowe (bez otoczki.
Idelane do terapii genowej NISZCZĄCEJ kom.)
AAV (towarzysz Adenowir)– nie powoduje
ludzkich chorob; duża pojemność;
dostarcz.DNA do wszystkich kom.;
wbudowują geny do chrom.gosp.
Wiązania glikozydowe w etylowanych nukleotydach purynowych łatwo ulegają zerwaniu w:
Obojętnym pH
W niskiej sile jonowej kwasy nukleinowe hybrydyzują:
Bardzo powoli
Autoligację – czyli proces łączenia lepkich końców, prowadzący do zamknięcia się wektora bez integracji fragmentu obcego DNA, można zahamować stosując traktowanie DNA wektora enzymem:
Fosfatazą alkaliczną
W mieszaninie ligacyjnej, która zawiera tylko 1 rodzaj DNA, najbardziej prawdopodobne jest:
Połączeni końców należących do tej samej cząsteczki DNA (recyrkularyzacja)
Insercja odcinka obcego DNA … B-galaktozydazy …
Białe
Ilość kopii plazmidów pUC na kom.bakt. wynosi:
500 – 700