Ostatni kolos IPTG i wektory

IPTG [3] jest wysoce stabilnym,

syntetycznym analogiem laktozy.

Inaktywuje represor lac i jako sztuczny

substrat indukuje syntezę B-galaktozydazy,

enzymu, który wspiera utylizację laktozy.

Zastosowanie

1. Różnicowanie koloni zrekombinowanych

(białe) i nierekombinowanych (niebieskie

2. Indukcja ekspresji genów

pod kontrolą promotora lac.

X-gal sztuczny indukator B-galktozydazy

(bezinteresowny) stosowany

w celu detekcji aktywności galaktozydazy.

MCS – miejsce wielokrotnego

klonowania = polilinker. Pozwala

na swobodny dobór odpowied.

do klonowania enzymu.

SANGLER [12]

1. Aby uzyskać cz.DNA zakończoną

określonym nukleotydem stosuje

się syntezę nowej nici DNA

2. Materiał wyjściowy to ssDNA.

3. Polimeraza DNA posiada możliwość

wbudowania w syntetyzowaną nić ddNTP,

które hamuje wydłużanie nici.

Polimeraza do sekwencjonow. musi mieć:

A/ wysoką procesywność (syntetyzuje

odcinek aż do przyłączenia ddNTP)

B/ brak aktywności egzonukleazy 5’-3’

(usunięcie końca 5’ nowego łańcucha

uniemożliwi prawidłowy odczyt prążków)

C/ brak aktyw.egz.3’-5’(nieusuwanie

wbudowanych ddNTP, kończących łańcuchy)

Sekwentaza - ↑procesywność, brak aktyw.

egzo-olitycznej., duża szybkość reakcji.

Sekwencj.cykliczne

Zasada ta sama (z ddNTP)

Wykorzystuje zmodyfikowaną polimerazę Taq.

+ potrzeba mało DNA do reakcji

+ dsDNA można traktować jako matrycę

Zrekombinowane DNA [6]

1. Przygotowanie fragm.DNA

i wektora do klonowania

2. Ligacja wektora i wstawki

3. Wprowadzenie DNA do gospodarza

4. Analiza transformantów

Transformacja [6]– pobranie nagiego DNA

z podłoża do komórek. Naturalnie potrafią

to G+ bakt. Najłatwiej pobrać liniowy

natywny dsDNA. Zdolność trasf.u bakt.

określa stan kompetencji (warunk genetycz)

1. Metodą chemiczną

Najwyższa wydajność jest gdy: szczep

biorcy jest bezplazmidowy, ma

nieaktywny system restrykcyjny,

plazmid jest stosunkowo mały i ma

formę cccDNA. DNA powinien być

maxymalnie oczyszczony. Nadmiar DNA

NIE wpływa na zmianę wydajności.

2. Elektrotransofm. (krótki puls prądu

o b.↑ natęż., przez zawiesinę kom

= przejściowe pory do 2nm).
(+) wprowadzanie b.dużych cz.DNA

(+) b.↑wydajność transofmacji

(-) możliwość zabicia kom.bakt.

Opisz transformacja u bakterii:

wyminić u bakt ze plazmid wchodzi do kom.bakt.-met.chemiczna

I czynniki

Opisz metodę SANGERA

chodzi o to ze w klasycznej masz 4 probowki

przylacza sie starter

dobudowuje do matrycy komplementarna nic polimeraza

gdy zamiast nukeotydu wstai ddNTP to zostanie zahamowane

reakcja

powstaje nam jakiejs dlugosci fragment

potem wrzucamy to na elektrofereza

i mamy klisze,

ktora sobie analizujemy

:P

no mozesz wnikac w temat jaka powinna byc temperatura prawidlowa reakcji itd

ze mozesz jeszcze wyznakowac te fragmenty w celu lepszego uwidocznienia

Hybrydyzacja [7] – powstawanie stabilnych

struktur 2niciowych z cząsteczek 1nić.

o komplementarnych sekwencjach

nukleotydów (min. 17 nt). Należy jednak

dysponować: sondą molekularną (odp.

przygotow.,wyznakowany fragm.DNA/RNA)

i umieścić docelowy kw.nukl. na filtrze.

Znakowanie: radioaktywne izotopami (detekcja:

autoradiografia z filmem wrażliw.na pormieni.)

Nieradioakt.: zw.fluorescencyj.(det.:odpowied.

przyrządy opty.)/immunochemiczne/cyto-

(detekc:przeciwciała specyf.dla danego haptenu)

WARUNKI: min.10yg materiału związanego

z filtrem// stęż sondy max 100ng/ml

//r-r o wysokim stęż soli // 65-68*C dla

1M NaCl lub 42*C dla 1M NaCl+50%formanid

// 15h w r-r H20 / 24h w rr z formamidem.

BLOTTING – proces przenoszenia DNA

z żelu na membranę

[zdenaturowany kw.nukl i sonda molek.!!!]

Selekcja [3] zrekombinowanych wekt. może

zachodzić przez zahamowanie namnażania

się kom.z niezrekombinowanym plazmidem.

Taki wektor posiada GEN LETALNY dla kom.

gosp. Insercja klonowanego DNA

dezaktywuje ekspresję letalnego genu

pozwalając na wzrost rekombinantów.

Transformacja [6]– pobranie nagiego DNA z

podłoża do komórek. Naturalnie potrafią

to G+ bakt. Najłatwiej pobrać liniowy

natywny dsDNA.

1. Metodą chemiczną

2. Elektrotransofm. (krótki puls prądu

o b.↑ natęż., przez zawiesinę kom

= przejściowe pory do 2nm)

3. Mikrowstrzeliwanie

4. Lipofekcja (zwykle z DNA bezwektor.)

5. Mikroiniekcja dojądrowa

(DNA bezwektorowe)

- wstrzykiw. DNA do j.kom.

za pomocą szklanych mikroigieł

6. Transfekcja (użycie

zrekombinowanych wekt.wirus)

Wektory DNA: [3]

- plazmidy

- bakteriofagi

- kombinacje plazmidowo-fagowe: kosmity…

Dobry wektor: [3] 1. Posiada oriV

(autonomiczna replik.)

2. Marker selekcyjny (gen kodujący B.

odpowiedzialne za wyróżnialne cechy fenot.)

3. MCS – msc wielok.klonow.

4. Niezdolny do przezycia poza kom.gosp.

5. Namnaża się w niewielu szczepach

6. Brak zdoności koniugacyjnych

7. Niewielki (<10kpz)

Wektory plazmidowe: [najważ.są sekw.

odpowiedz. za inicjację replik.=oriV]

a/ ogólnego przeznaczenia (proste

powielanie wybranego genu)

b/ do zadań specjalnych (produkcja B.

/badanie włąsciw.odcinka DNA

/ stabilne powiel.dużych fragm.)

B1/ do transkrypcji in vitro(z promotorami

bateriof T3/37/SP6 przed msc.wstaw.DNA)

Do wydajnej produkcji RNA w in vitro.

B2/ ekspresyjne (z silnym regulowanym

promotorem rozpoznawanym przez polimer.

RNA gosp.=inicjacja transkr.wiele X/min)

B3/ do badania właściw.sklonow.genu

/odc.DNA(np.promot)(DNA wprowadzane

w wekt. Przy genie reporterowym)

B4/ do rekombinacji nietyp.frgm.DNA

(np. po amplifikacji w rekcji PCR)

Wekt.FAGOWE: [4]

a/ bakteriofag lambda – ma 1nić lepkie końce

COS o 12pz, odpowiedzialne za łączenie

B.DNA faga. Takie DNA bd zapakowane

płaszcz B.faga. Środkowa cz.15pz można zastąp.

obcym DNA po czym zapakowana do główki.

b/ bakeriof P1 (delecyjny genom faga P1.

Środek do 125 pz = konstrukcja biblio.genom.)

c/ bak-f M13 (w kom. syntetyzow.jest

2ga nić DNA, w dsDNA ulega replik.

Powst. ssDNA pakowane w osłonki i uwalniane)

KOMBINACJE [4]: Fagemidy (po wprowadzeniu

do wekt.plazm. fragm. ORI z 1nićowego

bak-f.M13/f1)

Służą do otrzymywania 1nić.kopii DNA.

1nić matryce stosowane do sekwencj.DNA

/synt.znakowanego radioakt.1nić DNA.

Kosmidy (wekt.plazm. z sekw. COS faga sigma)

Do konstrukcji bibliotek genom.

Fosmidy (mają msc startu repl.z plazmidu

F i sekw.COS z f.sigma.)

Mniejsza ilość kopii/kom = ↑stabilność.

Wekt.DROŻDŻOWE – wekt.wahadłowe! [4]

O strukturach typowych dla eukar.,

ale są 1kom.//B.mogą podlegać modyfik.

potranslacyjnym.//klonowane geny

mogą mieć sekwencje intronowe.

W.wahadł: 2 odrębne msc stratu repl.

//2 typy markerów selekcyjnych.

YAC: cz.procar: (plazmidowe ori i marker selekcyj)

Cz. Euk: (odc. Ori ARS, telomery, centromer CEN,

geny selekc.-NIE na antybiotyk!, komlex expresyjny)

Min.1 unikalne msc re stryk.do klonowania obcego DNA.

Wekt.retrowirusowe [4]: lentivirusy

(HIV; zakażają kom dzielące i nie-)

Wekt. adenowirusowe (bez otoczki.

Idelane do terapii genowej NISZCZĄCEJ kom.)

AAV (towarzysz Adenowir)– nie powoduje

ludzkich chorob; duża pojemność;

dostarcz.DNA do wszystkich kom.;

wbudowują geny do chrom.gosp.

  1. Wiązania glikozydowe w etylowanych nukleotydach purynowych łatwo ulegają zerwaniu w:

Obojętnym pH

  1. W niskiej sile jonowej kwasy nukleinowe hybrydyzują:

Bardzo powoli

  1. Autoligację – czyli proces łączenia lepkich końców, prowadzący do zamknięcia się wektora bez integracji fragmentu obcego DNA, można zahamować stosując traktowanie DNA wektora enzymem:

Fosfatazą alkaliczną

  1. W mieszaninie ligacyjnej, która zawiera tylko 1 rodzaj DNA, najbardziej prawdopodobne jest:

Połączeni końców należących do tej samej cząsteczki DNA (recyrkularyzacja)

  1. Insercja odcinka obcego DNA … B-galaktozydazy …

Białe

  1. Ilość kopii plazmidów pUC na kom.bakt. wynosi:

500 – 700


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
ostatni kolos, Ogrodnictwo, Ogrodnictwo UP Wro, ROK II, semestr IV, Ochrona roślin (z Fitopatopogia)
ostatni kolos podsumowanie
ostatni kolos podsumowanie
ostatni kolos Kolasinski
technika - ostatni kolos (3), Maszyny i urządzenia do zaopatrzenia gospodarstw w wodę
mikro - ostatni kolos, Azot - podstawowy pierwiastek biogenny, występuje w przyrodzie w bardzo dużyc
biologia roślin ostatni kolos
metro ostatni kolos
notatki ostatni kolos
kolos ostatni, far, III rok IV sem, biologia molekularna, kolokwia 2015 pytania
FRANCZYZA W POLSCE ostatnia wersja
ruch wektorowy
9,10 Modele rastrowych i wektorowych danych w SIP,Mozliwosci wykorzystania SIP w architekturze krajo
ostatni
przemyslowe kolos 1 id 405455 Nieznany

więcej podobnych podstron