Azot - podstawowy pierwiastek biogenny, występuje w przyrodzie w bardzo dużych ilościach. Azot cząsteczkowy /N₂/ jest głównym składnikiem atmosfery. W związkach organicznych azot dostaje się do gleby z resztkami roślin, obumarłymi ciałami zwierząt i odchodami. Źródłem azotowych związków w glebie są również nawozy mineralne. Różne grupy drobnoustrojów biorą udział w przemianach składających się na cykl krążenia azotu w przyrodzie. Olbrzymia większość roślin zielonych nie jest zdolna do odżywiania się azotem cząsteczkowym. Wiązanie azotu cząsteczkowego odbywa się przy udziale bakterii wolno żyjących i tworzących układy symbiotyczne z roślinami. W wyniku działalności tych drobnoustrojów N₂ zostaje wbudowany w organiczne składniki komórkowe.

1. Tlenowe drobnoustroje wolno żyjące wiążące azot cząsteczkowy

Tę grupę drobnoustrojów poznamy na przykładzie bakterii z rodzaju Azotobacter. W celu odizolowania przedstawicieli z rodzaju Azotobacter od innych drobnoustrojów glebowych i wyhodowania ich w czystej ku1turze (zawierającej tylko określony gatunek bakterii), bądź też w kulturze wzbogaconej (wybitna przewaga danego gatunku nad innymi), stosujemy pożywkę wybiórczą. Niemal wszystkie drobnoustroje glebowe pokrywają swoje zapotrzebowanie na azot kosztem związków azotowych. Azotobacter natomiast należy do drobnoustrojów mogących żyć i rozwijać się przy zupełnym braku azotu związanego, odżywiając się wyłącznie azotem cząsteczkowym. Ta zdolność określa podstawową właściwość pożywki wybiórczej, która może być zastosowana do wyizolowania Azotobactera: powinna to być pożywka bez związków azotu, a więc bezazotową. Dalsze elementy wchodzące w skład pożywki ustalamy również na podstawie znajomości fizjologii Azotobactera. Jest to drobnoustrój cudzożywny, wymagający w pożywce organicznego połączenia węgla (np. glukozy, mannitolu, octanu), wrażliwy na obecność dostatecznej ilości przyswajalnych związków fosforu i wapnia, nie znoszący środowiska zakwaszonego. W praktyce mikrobiologicznej stosuje się w hodowli Azotobactera pożywki o różnym składzie, uwzględniające jego wymagania.

Pożywka używana na ćwiczeniach zawiera roztwór soli mineralnych i glukozę jako źródło węgla i substrat energetyczny i jest to pożywka płynna. Aby uzyskać podłoże stałe, dodaje się do niej 1,5 - 2% agaru; pH gotowej pożywki powinno wynosić 7,0.

Wzrost Azotobactera jest na tyle charakterystyczny, że stosunkowo łatwo można go wyróżnić. Azotobacter wytwarza duże ilości śluzów. W glebach polskich bytuje głównie gatunek Azotobacter chroococcum, produkując melaninowy brunatny barwnik. Wzrost Azotobactera jest więc wyraźnie śluzowy i mniej lub więcej intensywnie brązowy (w starych hodowlach - czarny)

Identyfikacje Azotobactera nie nastręcza większych trudności. Są to przeważnie komórki duże, o charakterystycznym owalnym kształcie, występujące często w postaci dwoinek. W starszych hodowlach przeważają formy spoczynkowe Azotobactera - kuliste cysty. Mimo wybiórczości podłoża mogą się jednak rozwijać na nim również inne drobnoustroje wniesione wraz z glebą. Rozwój ich odbywa się kosztem ewantalnych azotowych zanieczyszczeń wniesionych z gleba, a przede wszystkim kosztem azotu związanego przez Azotobactera. Możemy też dostrzec przetrwalnikujece komórki Clostridium.

Część praktyczna

a). Zakładanie hodowli wzbogaconej Azotobactera w pożywce płynnej - każda para wysiewa grudkę gleby do kolbki z płynną pożywką bezazotową.

b). Zakładanie hodowli wzbogaconej Azotobactera na podłożu stałym - każda para wysiewa 12 małych grudek gleby na płytkę Petriego ze stałym podłożem bezazotowym. Płytki i kolbki wstawiamy do cieplarki o temp. 28^oC.

2. Beztlenowe drobnoustroje wolno żyjące wiążące azot cząsteczkowy.

W glebie znajdują się również bakterie wolno żyjące wiążące azot atmosferyczny w warunkach beztlenowych należące do gatunku Clostridium pasteurianum. Aby ujawniły się charakterystyczne produkty przemiany materii oraz aby było możliwe uzyskanie na wybiórczej pożywce bezazotowej wzrostu umożliwiającego obserwację mikroskopową trzeba doprowadzić do masowego rozwoju Clostridium pastsurianum w badanej glebie. Metodę, polegajacą na doprowadzeniu do masowego rozwoju określonej grupy drobnoustrojów w macierzystej glebie, pod wpływem uzupełniania tej gleby odpowiednimi składnikami pokarmowymi, nazywamy metodą hodowli naturalnych albo spontanicznych. Cloatridium pasteurienum ma wymagania pokarmowe zbliżone do wymagań Azotobactera. Wybiórczość pożywki polega więc i w tym wypadku na wyeliminowaniu związków azotu. Dodatkowym, bardzo istotnym elementem selekcjonującym jest uniemożliwienie dostępu tlenu gdyż Clostridium pasteurienum jest beztlenowcem bezwzględnym. Koniecznym składnikiem pożywki jest także organiczny związek węgla. O obecności w hodowli Clostridium świadczy wytwarzanie gazu i zapach kwasu masłowego (produkty fermentacji masłowej).

Część praktyczna

a). Zakładanie hodowli Clostridium pasteurianum na wzbogaconej pożywce płynnej - wysiewamy glebę (ok. 1cm³) do płynnej pożywki bezazotowej, a następnie w celu pasteryzacji pożywkę zaszczepioną glebą umieszcza się w łaźni wodnej o temp. ok. 75^oC na 10 minut. Probówki wstawiamy do cieplarki do temp 28^oC. Zabieg ten zwany pasteryzacją zmniejsza liczbę żywych wegetatywnych komórek różnych drobnoustrojów znajdujących się w glebie Clostridium jest bakterią przetrwalnikujacą. Przetrwalniki Clostridium wytrzymują ogrzewanie i po przeniesieniu szczelnie zakorkowanych probówek do cieplarki przekształcają się w postać wegetatywną, rozmnażającą się w warunkach bez dostępu tlenu, wytworzonych w wysokim słupie pożywki.

b). Zakładanie naturalnej hodowli Clostridium pasteurianum - w glebie wzbogaconej 2% roztworem sacharozy. Przygotowujemy hodowlę naturalną Clostridium pasteurianum. Studenci mieszają glebę z 2 % roztworem sacharozy aby otrzymać plastyczną masę. Mieszaninę gleby z cukrem wprowadzamy do probówek dobrze ubijając. Hodowle wstawiamy do cieplarki do temp. 28^oC

Drobnoustroje wolno żyjące wiążące azot cząsteczkowy.

1. Tlenowe drobnoustroje wolno żyjące wiążące azot cząsteczkowy:

Azotobacter - jest bakterią tlenową (gramujemną) wolno żyjącą wiążącą azot cząsteczkowy. W celu odizolowania przedstawicieli rodzaju Azotobacter od innych drobnoustrojów glebowych i wyhodowania ich w czystej kulturze, bądź też w kulturze wzbogaconej stosuje się pożywkę wybiórczą. Azotobacter jest drobnoustrojem mogącym żyć i rozwijać w warunkach braku azotu związanego, odżywiającyym się wyłącznie azotem cząsteczkowym. Pożywka wybiórcza dla Azotobactera jest pożywką bezazotową.  Azotobacter tworzy komórki duże, o charakterystycznym owalnym kształcie, występujące często w postaci dwoinek. W naszych glebach występuje powszechnie Azotobacter chroococcum. Są to ruchliwe pałeczki o wymiarach 2-5 µm, tlenowe, występujące często po dwie obok siebie. Starzejące się komórki tracą rzęski i przybierają bardziej zaokrąglone kształty. Często otaczają się śluzem obejmującym kilka komórek, tworząc tzw. zoogleje chroniące komórki bakteryjne przed niekorzystnym wpływem otoczenia, głównie przed wysychaniem. Stare komórki Azotobactera w niesprzyjających dla niego warunkach środowiskowych zmniejszają nieco swoje wymiary, otaczają się grubą błoną tworząc cysty. W starszych hodowlach przeważają formy spoczynkowe Azotobactera - kuliste cysty. W tej postaci mogą przetrwać bardzo długi czas. W przypadku zaistnienia sprzyjających warunków dla ich rozwoju, cysty kiełkują. Azotobacter chroococcum jest bakterią wymagającą w stosunku do warunków środowiska. Oprócz dobrych warunków tlenowych wymaga odpowiedniego zasobu substancji energetycznych. Odczyn środowiska nie może być kwaśny, gdyż Azotobacter chroococcum nie rozwija się przy pH niższym niż 6.W naszych glebach można znaleźć szczepy Azotobactera, które mogą rozwijać się także i przy niższych pH środowiska. Optymalną temperaturą dla rozwoju Azotobacter chroococcum jest 28-30°C, maksymalną +45°C, a minimalną +4°C.

Część praktyczna

a). obserwacja makroskopowa hodowli Azotobactera w pożywce płynnej i na podłożu stałym.

Obserwacja makroskopowa. Opisujemy charakter wzrostu Azotobactera na podłożu stałym i na pożywce płynnej (w postaci kożuszka typowego dla tlenowców), jego konsystencję i zabarwienie, obecność na podłożu stałym śluzów obecność lub brak w płynie hodowlanym pęcherzyków gazu. Występowanie pęcherzyków gazu świadczy o rozwoju drobnoustrojów beztlenowych, znajdujących warunki do wzrostu w głębszych warstwach pożywki wskutek zużywania tlenu przez Azotobactera i obecności kożuszka utrudniającego dostęp powietrza do głębszych warstw płynu.

b). obserwacja mikroskopowa Azotobactera

W celu przygotowania preparatu w kropli płaskiej z żywych komórek, z hodowli na pożywce płynnej pobieramy ezą odrobinę kożuszka pokrywającego pożywkę i rozprowadzamy ją w kropli wody umieszczonej na szkiełku przedmiotowym. Po nałożeniu szkiełka nakrywkowego oglądamy preparat pod pow. 500x. Obrazy z pod mikroskopu należy narysować.

Z hodowli na podłożu stałym przygotowujemy preparat barwiony negatywnie nigrozyną. Mikroskopujemy pod pow. 1250x. Szukamy przede wszystkim dwoinek Azotobactera w otoczkach śluzowych. Rysujemy.

2. Beztlenowe drobnoustroje wolno żyjące wiążące azot cząsteczkowy:

W glebie znajdują się również bakterie wolno żyjące, wiążące azot atmosferyczny w warunkach beztlenowych, należące do gatunku Clostridium. 

Bakterie z rodzaju Clostridium - gramdodatnie laseczki 0,3-1,9x2-10 µm, ruchliwe lub nieruchliwe, wytwarzające endospory. Bezwzględne beztlenowce, w niewielu przypadkach areotolerancyjne. Chemoorganoheterotrofy. Metabolizm fermentacyjny chociaż niektóre szczepy (np. C. perfringens) mogą przeprowadzać oddychanie azotanowe. Wśród laseczek Clostridium występują gatunki chorobotwórcze. 

Clostridium  wiąże niewiele bo około 2-3 mg azotu na 1 g zużytego źródła energii. Gdy usuwa się w doświadczeniu laboratoryjnym tworzący się w wyniku fermentacji masłowej wodór, bakterie te są w stanie związać około 6 mg azotu na 1 g cukru. Clostridium pasteurianum ma wymagania pokarmowe zbliżone do wymagań Azotobactera. Wybiórczość pożywki polega na wyeliminowaniu związków azotu. Bardzo istotnym elementem jest uniemożliwienie dostępu tlenu, gdyż Clostridium jest beztlenowcem bezwzględnym. O obecności w hodowli Clostridium świadczy wytwarzanie gazu i zapach kwasu masłowego (produkty fermentacji masłowej). 

Część praktyczna

a). obserwacja makroskopowa hodowli wzbogaconej i naturalnej Clostridium pasteurianum

Obserwujemy rozerwanie jednolitego słupa gleby w hodowli spontanicznej (naturalnej) przez powstające w procesie fermentacji gazy. Probówki z hodowlą wzbogaconą lekko wstrząsamy. Zwracamy uwagę na wydzielanie się pęcherzyków gazu i zapach kwasu masłowego.

- Wydzielanie się gazu (H₂) świadczy o przeprowadzonej fermentacji (w hodowli spontanicznej wydzielanie gazu jest tak silnie, że powoduje ono wypychanie gleby z probówki).

- Ostry zapach kwasu masłowego z hodowli wzbogaconej świadczy o przeprowadzonej fermentacji masłowej przez Clostridium pasteurianum.

b) obserwacja mikroskopowa Clostridium pasteurianum w kropli płaskiej z dodatkiem płynu Lugola (preparat przygotowany z hodowli wzbogaconej) - pow. 500x

Pobieramy pipetą pasterowską kroplę z hodowli lub ezą osad ze ścianki probówki (znad powierzchni gleby) i przenosimy na szkiełko przedmiotowe, następnie dodajemy kroplę płynu Lugola. Materiałem zapasowym w komórkach Clostridium pasteurianum jest granuloza (cukier), która z płynem Lugola daje zabarwienie granatowo - fioletowe.

Przy obserwacji (pow. 500x) zwracamy uwagę na charakterystyczne kształty komórek, obecność przetrwalników oraz ruch. Wykonujemy rysunek spod mikroskopu . 

II. Mikrobiologiczne przemiany związków azotu w glebie - założenie doświadczeń.

Dostające się do gleby resztki obumarłych roślin i zwierząt zawierają azot związany w białkach, kwasach nukleinowych, lipoproteidach i innych związkach wchodzących w skład komórek. Te organiczne połączenia azotu mogą być wykorzystywane przez drobnoustroje jako źródło węgla, azotu, a także jako substrat energetyczny. Im wszechstronniej drobnoustroje wykorzystują daną substancję, tym proces minera1izacji przebiega intensywniej. W procesie rozkładu organicznych związków azotu uwalniany jest, amoniak - forma przyswajana przez rośliny i zbiałczana przez mikroflorę. Rozkład białek - proteo1iza - zachodzi zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Drobnoustroje zwane proteolitycznymi syntezują zewnętrzkomórkowo enzymy hydrolityczne - proteazy, rozkładające białka do peptonów i polipeptydów. Pod wpływem różnego typu peptydaz polipeptydy i peptydy ulegają rozkładowi do aminokwasów. Końcowe produkty proteolizy - aminokwasy, podlegają dalszym przemianom mikrobiologicznym. Dezaminację aminokwasów, prowadzącą do uwalniania amononiaku, nazywamy amonifikacją. Amonifikacja przebiega w różny sposób w zależności od warunków środowiska i właściwości amonifikatorów, drobnoustrojów przeprowadzających ten proces: Poza głównym produktem - amoniakiem, mogę powstawać różne kwasy organiczne oraz alkohole, aldehydy, węglowodory, CO₂. W czasie rozkładu aminokwasów zawierających siarkę mogą powstawać merkaptany i siarkowodór. Drobnoustroje proteolityczne powszechnie występują w przyrodzie. Należą do nich bakterie tlenowe z rodzajów Bacillus, Pseudomonas, Proteus, bakterie beztlenowe, np Clostridium putrificum, C. sporogenes; promieniowce z rodzaju Streptomyces, Mycobacterium oraz grzyby z rodzajów Aspergillus, Mucor, Oidium, Rhizopus.

Jak już wspomniano, drobnoustroje rozkładające białko nazywa się proteolitycznymi. Nie wszystkie jednak drobnoustroje proteolityczne potrafią rozkładać białko aż do amoniaku. Z kolei te drobnoustroje, które w wyniku rozkładu organicznej substancji azotowej wydzielają amoniak nazywa się amonifikatorami. Tak więc nie wszystkie mikroorganizmy proteolityczne są amonifikatorami, jak również nie wszystkie amonifikatory można zaliczyć do organizmów proteolitycznych, chociaż i takie spotyka się wśród nich. Często jest to swoiste współdziałanie. Bakterie proteolityczne np. rozkładają białko do aminokwasów, które z kolei są dezaminowane przez właściwe amonifikatory.

Do amonifikatorów można zaliczyć wiele różnych drobnoustrojów, a wśród nich bakterie, grzyby i promieniowce. Wydaje się, że do najbardziej energicznych amonifikatorów należą bakterie tlenowe, beztlenowe oraz tzw. względnie beztlenowe. Do beztlenowców można zaliczyć laseczki takich gatunków jak: Clostridium sporogenes (dawna nazwa Bacillus sporogenes), Clostridium putrificum (Bacillus putrifrcus) i wiele innych. Z grupy bakterii względnie beztlenowych jako silne amonifikatory znane są pałeczki z grupy: coli-aerogenes, a więc przede wszystkim gatunek Escherichia coli i Aerobacter aerogenes - zaliczany obecnie do innego rodzaju - Klebsiella. Prawdopodobnie najsilniejszym amonifikatorem jest jednakże względnie beztlenowa pałeczka Proteus vulgaris. Wśród bakterii tlenowych do amonifikatorów zalicza się zarówno laseczki, jak i pałeczki, a nawet niektóre ziarniaki. Do najbardziej znanych tlenowych amonifikatorów należą: Bacillus subtilis, Bacillus cereus var. mycoides, Bacillus megaterium oraz pałeczki takie jak: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens i Halobacterium salinarium.

Do silnych amonifikatorów należą również bakterie mocznikowe. Rozkładają one mocznik dzięki zawartej w ich komórkach ureazie. Do tej bardzo specyficznej grupy bakterii należą: Bacillus pasteurii (Urobacillus pasteuri), Bacillus freudenreichii (Urobacillus freudenreichii), Sporosarcina ureae i wiele innych. Przy rozkładzie mocznika uwolnionego z cyjanamidu jest czynny Bacillus pasteurii a przy amonifikacji chityny - Pseudomonas chitinovora .

Uwalniany w czasie mineralizacji substancji organicznej oraz wprowadzany do gleby z nawozami nieorganicznymi, amoniak jest formą azotu przyswajaną przez rośliny i drobnoustroje. Intensywność mikrobiologicznego uwsteczniania jonów amonowych - zbiałczania zależy od warunków środowiska, decydujących o aktywności mikroflory (stosunku C:N, temperatury, wilgotności, odczynu).

W glebie o dobrych stosunkach wodno-powietrznych jony amonowe są utleniane do azotanów przez bakterie nitryfikacyjne. Proces ten zwany nitryfikacją jest dwufazowy. Pierwsza faza - nitrosofikacja - polega na utlenieniu jonu amonowego do azotynów przez bakterie należące głównie do rodzaju Nitrosomonas, Nirtosococcus:

NH₄⁺ + 1,5O₂   ---->  NO₂^¯ + 2H⁺ + H₂O + 275,88 · 10³ J (66 kcal)

W drugie, fazie azotyny są utleniane do azotanów przez bakterie głównie z rodzaju Nitrobacter, Nirtosococcus,

NO₂¯ + 0,5O₂   ---->   NO₃^¯ + 75,24  · 10³ J (18 kcal)

Bakterie nitryfikacyjne są chemolitrofami. Uwolnioną w nitryfikacji energię wykorzystują do redukcji CO₂. Są to tlenowce, wrażliwe na zakwaszenie środowiska.

Azotany, wykorzystywane przez rośliny jako źródło azotu, są również zbiałczane przez niektóre drobnoustroje glebowe. W glebie w warunkach beztlenowych azotany mogą ulegać denitryfikacij. Jest to proces redukcji przeprowadzany przez bakterie względnie beztlenowe. Bakterie te wykorzystują jon azotanowy jako końcowy akceptor wodoru w procesie utleniania związków organicznych lub nieorganicznych. Produkty denitryfikacji całkowitej (N₂O, N₂) to formy azotu nieprzyswajalnego dla roślin i często ulatniające się z gleby. Jest to proces rolniczo szkodliwy, który może prowadzić do strat azotu w glebie.

Zdolność do denitryfikacji wykazują liczne gatunki bakterii:

- heterotrofy z rodzaju Pseudomonas, np. P. stutzeri, P. aeruginosa, P. fluorescens;

- bezwzględny autotrof - Thiobacillus denitrificans, wykorzystujący tiosiarczany, siarczki i siarkę jako substrat energetyczny

- autotrof względny - Paracoccus denitrificans utleniajacy wodór cząsteczkowy do wody.

Część praktyczna

1. Założenie hodowli naturalnej drobnoustrojów hydrolizujących mocznik.

Każda para dodaje 2 cm³ 1% roztworu mocznika (2% w stosunku do masy gleby) do probówki z 10 g powietrznie suchej gleby. W celu dokładnego zwilżenia gleby, uzupełnić mieszaninę gleby i mocznika wodą. Następnie włożyć do probówek papierek lakmusowy, umieszczając jeden jego koniec pod korkiem probówki. Hodowle inkubować przez 7 dni w temp. 28^o C

2. Założenie hodowli drobnoustrojów amonifikacyjnych w pożywkach płynnych z asparaginą i z asparaginą i glukozą

a). pożywka z asparaginą (0,2 g/1l pożywki) jako jedynym związkiem organicznym (źródło C i N) 

b). pożywka z asparaginą i glukozą (10 g/1l pożywki) w stężeniu 1 % (dodatkowe, łatwo przyswajalne źródło węgla)

Każda para wysiewa po małej grudce gleby do 2 probówek z pożywkami (a i b) dla amonifikatorów.

3. Założenie hodowli autotroficznych bakterii nitryfikacyjnych (I fazy) w pożywce płynnej .

W celu stwierdzenia obecności nitryfikatorów w glebie, otrzymaną płynną pożywkę wybiórczą dla bakterii przeprowadzających I fazę nitryfikacji szczepimy grudki gleby. Jako kontrolę pozostawiamy pożywkę jałową (nie szczepiona glebą). Pożywkę stanowi roztwór soli mineralnych, zawierający siarczan amonu jako substrat energetyczny i źródło azotu. O wybiórczości pożywki decyduje brak związków organicznych. Pożywkę rozlano do probówek po 5 cm³ w celu zapewnienia warunków tlenowych. Aby utrzymać odczyn optymalny dla bakterii z rodzaju Nitrosomonas (pH 7,5-8,0), po jałowieniu dodano do pożywki ok. 1% węglanu wapnia węglan wapnia wyjałowiono oddzielnie. O obecności bakterii nitrosofikacyjnych w badanej glebie wnioskujemy pośrednio na podstawie pojawienia się produktów ich działania - azotynów.

4. Założenie hodowli heterotroficznych bakterii denitryfikacyjnych w pożywce płynnej

Do hodowli bakterii cudzożywnych, przeprowadzających denitryfikację, stosujemy pożywkę zawierającą roztwór soli mineralnych, KNO₃ jako akceptor wodoru i octan sodu jako źródło węgla i substrat energetyczny. pH pożywki doprowadzamy do 6. Pożywkę rozlewa się do probówek z rurkami Durhama Otrzymaną jałową pożywkę szczepimy glebą. Jako kontrola pozostaje pożywka nie szczepiona. Inkubujemy 7 dni w temp. 28°C.

Bakterie odpowiedzialne za tworzenie brodawek korzeniowych u roślin motylkowych należą do rodzaju Rhizobium. Występują one w glebie jako wolno żyjące, ściśle tlenowe, gramujemne pałeczki wykorzystujące do wzrostu związki organiczne. Niektóre szczepy (Bradyrhizobium) są zdolne do wzrostu autotroficznego wykorzystując H₂. Na podstawie swoistości gospodarza oraz charakteru wzrostu można wyróżnić trzy podgrupy którym nadano nazwy rodzajowe. Do grupy Rhizobium zalicza się najszybciej rosnące bakterie brodawkowe wielu pospolitych roślin hodowlanych. Grupa Bradyrhizobium japonicum obejmuje rosnące bardzo wolno symbionty soi. Do trzeciej grupy należy Azorhizobium caudinodans, bakteria wytwarzająca brodawki łodygowe. Bakterie symbiotyczne są drobnymi i na ogół ruchliwymi pałeczkami o wymiarach 0,5 - 0,9 x 1,2 - 3,0 µm. Będąc organizmami zdecydowanie tlenowymi, mogą się jednak rozwijać przy znacznym nawet zmniejszeniu ciśnienia atmosferycznego tlenu. Bakterie te mogą całymi latami przebywać w glebie bez jakiegokolwiek kontaktu z rośliną. Oczywiście w tych warunkach nie potrafią wiązać azotu atmosferycznego i muszą mieć do swojej dyspozycji gotowe już związki tego pierwiastka, podobnie jak ogromna większość pozostałych drobnoustrojów. Prawie wszystkie rośliny motylkowe mogą wytwarzać brodawki przy współudziale ryzobiów, a dany gatunek Rhizobium zwykle może wchodzić w układ symbiotyczny z różnymi roślinami motylkowymi. Brodawki korzeniowe u poszczególnych roślin motylkowatych powstają w różnych miejscach, tworząc na korzeniach specyficzne ugrupowania. Jak już wspomniano, bakterie tej grupy zaliczono do rodzaju

- Rhizobium lub Bradyrhizobium, w którym występują podstawowe gatunki, a mianowicie:

- Rhizobium leguminosarum var. trifolii współżyjące z koniczynami

- Rhizobium leguminosarum var: viceae współżyjące z grochem, groszkiem, soczewicą, wyką

- Rhizobium leguminosarum var. phaseoli współżyjące z fasolami 

- Rhizobium meliloti współżyjące z lucerną, nostrzykiem

- Rhizobium loti współżyjące z komonicą

- Bradyrhizobium japonicum współżyjące z soją

- Bradyrhizobium sp. współżyjące z łubinami i niektórymi innymi roślinami motylkowatymi.

Oprócz wymienionych gatunków bakterii brodawkowych, w przyrodzie licznie występują także inne, współżyjące z różnymi roślinami motylkowatymi, nawet z dziko rosnącymi. Należy nadmienić, ze niektóre szczepy Rhizobium mogą współżyć nie tylko z jednym, ale z wieloma gatunkami roślin motylkowatych. Mają one wtedy zdolność tzw. krzyżowego zakażania roślin.

Tworzenie się brodawki korzeniowej.

Bakterie wnikają z gleby do młodych włosków korzeniowych. Rośliny motylkowe zawierają lektyny. Są to glikoproteiny, które wiążą się ze swoistymi wielocukrami. Lektyny występują powszechnie w przyrodzie i prawdopodobnie spełniają szerokie funkcje rozpoznawcze. Interakcje między lektynami na zewnętrznej powierzchni włosków korzeniowych i wielocukrami na zewnątrz ściany komórkowej ryzobiów zbadano u R. trifolii zakażającego kończynę białą. Wiązanie następuje jedynie między zgodnymi partnerami; nie każdy gatunek Rhizobium może się wiązać z jakąkolwiek rośliną motylkową i odwrotnie. Jeśli połączenie jest możliwe, czubek włoska zagina się i penetrujące bakterie wyrastają w postaci tzw. nici zakaźnej otoczonej komórkami korzenia. Wyrastając w kierunku podstawy (do góry) zakażają one kolejne komórki epidermalne korzenia. Zwykłe komórki diploidalne ulegają zniszczeniu, lecz ryzobia namnżają się w często obecnych komórkach tetraploidalnych. Po wytworzeniu hormonów wzrostowych komórki epidermalne korzenia namnażają się. W wyniku rozrostu tkanki, wywołanego przez ryzobia oraz promotory wzrostu, najprawdopodobniej cytokiny, powstaje brodawka korzeniowa.

Rozmieszczenie brodawek na korzeniach roślin motylkowych:

Szybko rosnące bakterie przekształcają się w zdeformowane komórki; zwane bakteroidami. 

Bakteroidy to formy zmienione - inwolucyjne - nie rozmnażające się, ale wciąż aktywne. Zazwyczaj bakteroidy są nie tylko znacznie większe od komórek macierzystych (10-12-krotnie), ale mają zdeformowane kształty, niekiedy bardzo charakterystyczne dla poszczególnych gatunków. 

Bakteroidy np. występujące w koniczynie tworzą często formy gruszkowate - rozdęte, a bakteroidy grochu przyjmują zazwyczaj postać rozwidloną w kształcie litery y. Nie wszystkie jednak bakteroidy odbiegają swoimi kształtami i wymiarami od komórek, z których powstały. Bakteroidy Rhizobium japonicum (nowa nazwa: Bradyrhizobium japonicum) prawie nie różnią się wyglądem zewnętrznym od form wegetatywnych. Bakteroidy, żyjąc w cytoplazmie komórek roślinnych pojedynczo lub w grupach, otaczają się błoną perybakteroidalną. Tkanka zawierająca bakteroidy jest czerwona, ponieważ zawiera barwnik leghemobinę. W miarę starzenia się brodawki następuje degradacja leghemoglobiny do zielonych barwników żółciowych (biliwerdyn) i brodawka również przyjmuje zieloną barwę. Samo wiązanie azotu atmosferycznego zachodzi najsilniej tuż przed kwitnieniem i podczas kwitnienia zakażonych bakteriami roślin motylkowatych. Po okwitnięciu, wobec zmniejszającej się asymilacji dwutlenku węgla przez rośliny i zwolnieniu tempa wzrostu, brodawki korzeniowe ulegają rozpadowi. Formy bakteroidalne zamierają i są trawione przez enzymy roślinne lub, jak twierdzą niektórzy uczeni, pewna ich część może rozpadać się na drobne ziarenkowate twory, z których wykiełkowują nowe formy wegetatywne. Natomiast bakterie, które nie uległy w brodawkach przekształceniu w bakteroidy przenikają do gleby, skąd mogą ponownie zakażać inne rośliny motylkowate, skoro tylko znajdą się w zasięgu ich korzeni.

Współżycie bakterii brodawkowych z rośliną polega na obustronnym świadczeniu usług. Tak, więc zarówno proces wiązania azotu atmosferycznego, jak i normalny rozwój bakterii symbiotycznych wymagają dopływu węglowodanów będących dla nich źródłem energii oraz materiałem budulcowym. Tych właśnie związków, soli mineralnych oraz prawdopodobnie niektórych ciał wzrostowych dostarcza bakteriom roślina. W zamianę za to bakterie zaopatrują rośliny w wytworzoną przez siebie witaminę B₁₂ i przede wszystkim związany azot.

Jak się okazuje, nie zawsze dochodzi do współżycia roślin motylkowatych z bakteriami. A. Hiltner rozróżnia ze względu na różną odporność roślin na zakażenie bakteriami oraz różne zdolności samych bakterii do zakażania roślin sześć możliwych stosunków pomiędzy rośliną motylkowatą a bakteriami:

- Roślina jest bardzo odporna i bakterie w ogóle nie potrafią wniknąć do jej systemu korzeniowego.

- Roślina nie jest tak odporna, aby uniemożliwić wniknięcie bakterii, lecz jest na tyle silna, że niszczy wnikające komórki bakterii. W tej sytuacji nie dochodzi do tworzenia się brodawek korzeniowych.

- Roślina tworzy brodawki po wniknięciu bakterii, które jednak słabo asymilują azot atmosferyczny i ich komórki są stopniowo niszczone przez roślinę.

- Właściwa symbioza polega na rozwoju bakterii w brodawkach i wiązaniu wolnego azotu z powietrza.

- Nadmierna wirulencja (zjadliwości bakterii powoduje niszczenie tkanki roślinnej. Jest to już przejaw pasożytnictwa bakterii w stosunku do roślinnego gospodarza.

- Całkowite pasożytnictwo bakterii w roślinie powoduje jej stopniowe zamieranie. 

Rozróżnia się ponadto trzy stadia współżycia bakterii z roślinami motylkowatymi. 

Stadium pierwsze to atakowanie rośliny przez wnikające do jej systemu korzeniowego bakterie, podczas którego roślina broni się. Okres ten trwa aż do momentu wytworzenia naczyń przewodzących asymilaty z systemu naczyniowego rośliny do utworzonej brodawki. 

Następnie zaczyna się okres drugi - stadium właściwego współżycia. Okres trzeci pojawia się z początkiem starzenia się rośliny. Zmniejszony dopływ asymilatów do brodawek stopniowo zamienia symbiozę w pasożytnictwo. 

Ten trzeci okres - stadium pasożytnictwa - można wywołać sztucznie, np. przez zaciemnienie roślin lub prowadzenie ich hodowli w środowisku bez takich mikroelementów jak bor. Jak wiadomo zaciemnienie rośliny uniemożliwia proces asymilacji CO₂ przez roślinę, a brak boru powoduje zahamowanie tworzenia się wiązek naczyniowych prowadzących asymilaty do brodawki.

Część praktyczna

a). Obserwacja korzeni roślin motylkowych (opis i rysunek dwóch typów brodawkowania).

b). Obserwacja mikroskopowa bakterii z rodzaju Rhizobium z hodowli laboratoryjnej w preparatach barwionych metodą Grama (pow. 1250x). Wykonanie rysunków bakterii z rodzaju Rhizobium.

c). Obserwacja mikroskopowa bakteroidów kończyny i peluszki w preparatach barwionych metodą negatywną (pow 1250x). Wykonanie rysunków bakteroidów.

Wykorzystania bakterii z rodz. Rhizobium w praktyce rolniczej.

Najczęściej stosowaną w praktyce rolniczej szczepionką bakteryjną jest Nitragina, przeznaczona dla roślin motylkowych. Zawiera ona efektywny, tj. wirulentny (łatwo zakażający rośliny) i aktywny (wiążący duże ilości N₂) szczep Rhizobium. Nitraginę sporządza się z najaktywniejszych szczepów przystosowanych do odpowiednich roślin, namnażając bakterie na specjalnych pożywkach. Następnie przenosi się je na sterylne podłoże, np. na glebę, lub też namnaża się bezpośrednio na odpowiednio wyjałowionym podłożu wzbogaconym w źródła energii i pokarm dla tych bakterii. Gotowe szczepionki przechowuje się w plastykowych torebkach lub w szklanych słoikach zaopatrzonych w odpowiednią instrukcję użycia. Umiejętnie i racjonalnie użyta szczepionka może przynieść duże korzyści gospodarcze, nie tylko na skutek znacznego zwiększenia plonów zielonej masy, ale i wydatnego zwiększenia zawartości w niej azotu. Należy pamiętać, że stosowanie nitraginy jako szczepionki nie zawsze jest uzasadnione, gdyż w glebie, którą zamierzamy wzbogacić aktywnymi szczepami mogą znajdować się już nie mniej aktywne szczepy rodzime Rhizobium lub Bradyrhizobium). Należy więc stosować szczepionkę tylko wtedy, gdy na określonym polu nie była uprawiana co najmniej przez kilka lat roślina motylkowata lub nastąpił wyraźny spadek jej plonów. Jak wiadomo katastrofalne zmniejszenie się plonowania tych roślin, czyli tzw. wykoniczynienie lub wylucernienie, może być spowodowane m. in. przez bakteriofagi, które wyniszczyły współżyjące z roślinami motylkowatymi bakterie. W tych warunkach użycie nitraginy jest jak najbardziej celowe. Polska Nitragina jest wytwarzana przez Wytwórnię Szczepionek Rolniczych w Wałczu. Zawiera ona jako nośnik bakterii jałową glebę z dodatkiem pożywki.

Cykl krążenia azotu w przyrodzie składa się z kilku wzajemnie ze sobą powiązanych ogniw

Ogniwo pierwsze to symbiotyczne i niesymbiotyczne wiązanie azotu atmosferycznego przez drobnoustroje, w wyniku którego tworzy się białko. Substancja białkowa i inne organiczne połączenia azotu ulegają rozkładowi mikrobiologicznemu tak, że w procesie amonifikacji uwalnia się amoniak. Związek ten jest z kolei pobierany przez drobnoustroje i rośliny jako pokarm azotowy. W tym przypadku azot zostaje ponownie wbudowany w białko. Nie zużyty przez żywe organizmy amoniak powstały w wyniku rozkładu organicznej substancji azotowej ulega nitryfikacji. Poprzez azotyny tworzą się azotany, które podobnie jak amoniak są wyśmienitym pokarmem dla roślin wyższych. Mogą one też w pewnych okolicznościach być pobierane jako pokarm przez niektóre drobnoustroje. W tym przypadku dochodzi do tzw. zbiałczania azotanów przez mikroorganizmy. W warunkach beztlenowych mogą one ulegać częściowej lub całkowitej redukcji, czyli denitryfikacji. W wyniku częściowej denitryfikacji powstają azotyny, lub amoniak, w przypadku denitryfikacji całkowitej uwalnia się azot cząsteczkowy. Jak z tego wynika, drobnoustroje odgrywają tu decydującą rolą, czynnie uczestnicząc w krążeniu azotu w przyrodzie.

Rozkład mocznika 

Hydroliza mocznika jest uważana za przykład deaminacji hydrolitycznej. Wiele bakterii  tzw. mocznikowych przy udziale enzymu ureazy ma zdolność wykorzystania mocznika jako źródła azotu. Bakterie te hydrolizują cały dostępny mocznik do amoniaku, podwyższając przy tym pH do wartości 9-10, do jakiej są przystosowane. 

NH₂ - CO - NH₂ + 2H₂O ----> 2NH₃ + CO₂ + H₂O

Bakterie rozszczepiające mocznik - Bacillus pasteurii, Sporosarcina ureae, Proteus vulgaris.

Część praktyczna

a). obserwacja hodowli naturalnej drobnoustrojów hydrolizujących mocznik.

Obserwujemy zmianę zabarwienia papierka lakmusowego i wyciągamy wnioski.

b). obserwacja hodowli drobnoustrojów proteolitycznych - rozkład kazeiny mleka.

Gotowe hodowle organizmów proteolitycznych na podłożu stałym, do których dodano mleko (mleko spowodowało zmętnienie podłoża). Wokół wyrosłych na płytkach kolonii zaobserwowano strefy przejaśnień, które świadczą o rozłożeniu w tych miejscach kazeiny - białka zawartego w mleku; a to z kolei świadczy o tym, że kolonie wyrosłe na płytkach są koloniami drobnoustrojów proteolitycznych.

Studenci obserwują kolonie wyrosłe na podłożu stałym z mlekiem oraz oceniają kolonie drobnoustrojów proteolitycznych na podstawie obecności strefy przejaśnienia spowodowanej rozkładem kazeiny.

c). amonifikacja - wykonanie reakcji barwnej z odczynnikiem Nesslera na obecność jonów NH₄⁺ w hodowli z asparaginą oraz z asparaginą i glukozą

W celu uzyskania hodowli drobnoustrojów amonifikacyjnych stosuje się pożywkę zawierającą roztwór soli mineralnych (bez związków azotu) i asparaginę, która stanowi jedyne źródło węgla, azotu i substrat energetyczny.

Pożywka z asparginą zawiera: 

36,36 % C (węgla) i 21,2 % N (azotu)

0,2 g asparginy zawiera: 0,0727 g C i 0,0424 g N

C:N = 0,0727:0,0424 czyli stosunek węgla do azotu w pożywce z asparginą wynosi 1,71: 1

 Pożywka z asparginą i glukozą zawiera: 

0,2 g asparginy zawiera: 0,0727 g C i 0,0424 g N

10 g glukozy zawiera 40 % C co równa się 4 g C

suma C w pożywce z asparginą i glukozą równa się 4,0727

stosunek C:N = 4,0272:0,0424 czyli 96,7:1

- opisać wygląd hodowli amonifikatorów (zwrócić uwagę na zmętnienie, kożuszek, osad)

- ocenić przebieg amonifikacji w obu wariantach hodowli (efekt amoniakalny ujemny lub dodatni), studenci wykonują reakcję barwną na obecność amoniaku w płynach pohodowlanych.

W celu stwierdzenia amonifikacji przeprowadzamy reakcję barwną na amoniak z odczynnikiem Nesslera. Do obu probówek dodaje się po kilka kropli odczynnika Nesslera. 

Odczynnik Nesslera jest to alkaliczny roztwór zespolonego związku - jodków rtęciowego i potasowego - K₂HgJ. Związek ten tworzy amoniakiem połączenie NH₄Hg₂J₃, dające zabarwienie żółte lub pomarańczowe.

W probówce z asparaginą pojawia się zabarwienie (mamy do czynienia z dodatnim efektem amonifikalnym związanym z wydzielaniem NH₃ do środowiska (z wodą daje jony NH₄⁺) - jest to wywołane zbyt małym stosunkiem węgla do azotu), natomiast hodowla w probówce z asparaginą i glukozą nie zmienia barwy (wydzielanie amoniaku nie nastąpiło - ujemny efekt amoniakalny. Przy odpowiednim stosunku C do N azot zostanie wbudowany w komórki bakteryjne). O obecności jonów amonowych świadczy pojawienie się zabarwienia od żółtego do pomarańczowego.

d). nitryfikacja - wykonanie reakcji barwnej z odczynnikiem Griessa na obecność jonów NO₂ w hodowlach autotroficznych bakterii nitryfikacyjnych.

Po 14 dniach inkubacji z hodowli przenosimy do probówek niewielką ilość płynu i dodajemy kilka kropli odczynnika Griessa. Probówki wstrząsamy. Odczynnik Griessa powoduje zabarwienie roztworów zawierających azotyny na kolor od różowego do czerwonego. Na podstawie dokonanych obserwacji studenci wyciągają wnioski.

W przypadku zmiany barwy w reakcji z odczynnikiem Griessa możemy stwierdzić, że w glebie występują nitryfikatory, które w czasie inkubacji namnażają się w pożywce i utleniają jony amonowe do azotynów.

e). denitryfikacja - opis hodowli (gaz, odczyn, zmętnienie) i reakcja barwna na obecność NO3¯.

Po okresie inkubacji hodowli zwracamy uwagę na obecność lub brak gazu w rurkach Durchama. Mierzymy za pomocą papierka wskaźnikowego odczyn pożywki. Następnie należy przeprowadzić reakcję barwną na obecność azotanów. 

W celu wykonania reakcji do małej probówki odlewamy trochę zaszczepionej pożywki i dodaje się mocznik w substancji (dodatek mocznika eliminuje azotyny, które również dają reakcję barwną z dwufenyloaminą). Następnie dodajemy po kilka kropli stężonego H₂SO₄ i roztworu dwufenyloaminy w kwasie siarkowym. W obecności azotanów występuje niebieskie zabarwienie. 

Obecność gazu (N₂) w rurkach Durhama, alkalizacja i brak reakcji barwnej (zanik jonów NO₃) w pożywce szczepionej glebą świadczą o rozwoju denitryfikatorów wprowadzonych do pożywki z glebą.

f). obserwacja hodowli denitryfikatorów autotroficznych.

W celu otrzymania hodowli denitryfikatorów autotroficznych należących do gatunku Thiobacillus denitrificans stosuje się mineralną pożywkę wybiórczą, zawierającą jako substrat energetyczny siarkę i KNO₃ jako akceptor wodoru. Do pożywki dodaje się CaCO₃ dla zobojętnienia powstającego kwasu siarkowego. Pożywkę szczepi się glebą i inkubuje w temp. 28^oC przez kilka tygodni. Po inkubacji możemy zaobserwujemy gromadzące się wokół kryształków siarki pęcherzyki gazu (N₂).

g). zbiałczanie azotanów 

Do kolbek (jedna z KNO₃, druga z KNO₃ i glukozą) dodajemy ³/₄ objętości wody i całość po 5 minutowym wytrząsaniu przesączamy. Przesącz poddajemy reakcji barwnej na wykrycie jonów NO₃¯ (kilka kryształków mocznika + H₂SO₄ + fenyloamina) . 

W przypadku występowania NO₃¯ zachodzi reakcja barwna. W przypadku braku reakcji możemy stwierdzić że zaszedł proces zbiałczania (w probówce z KNO₃ i glukozą zachodzi proces zbiałczania ). Przy wysokim stosunku węgla do azotu, azot zostaje pobierany przez drobnoustroje ze środowiska i wbudowany w ich ciało w postaci aminokwasów.

Reakcje barwne:

1. Amonifikacja - odczynnik Nesslera (jony amonowe barwią się na kolor od pomarańczowego do czerwonego)

2. Nitryfikacja - odczynnik Griessa (jony azotowe barwią się na kolor od czerwonego do różowego)

3. Denitryfikacja - obecność gazu w rurce Durhama, odczyn pH 7-8 == wynik pozytywny = obecność denitryfikatorów

brak reakcji barwnej (reakcja obrączkowa - mocznik - kilka kryształków + dwufenyloamina + stęż. H2SO4)

---