Struktura pierwotna i wtórna białka
Pierwotna struktura- I rzędowa- (liniowa, jednowymiarowa): kolejność, sekwencja aminokwasow w łańcuchu polipeptydowym (skład i kolejność decydują o strukturze i funkcji enzymu). Aminokwasy połączone są wiązaniem peptydowym w ustalonej kolejności. Sekwencję aminokwasową odczytuje się zawsze od tzw. N-końca (wolna grupa aminowa) w kierunku C- końca (wolna grupa karboksylowa).
Struktura wtórna- II rzędowa- dotyczy ułożenia w przestrzeni poszczegolnych sąsiadujących ze sobą w sekwencji aminokwasow. Naturalnie skręcony lub rozciągnięty łańcuch białkowy tworzy regularne formy: helisy i b-struktury (struktury pofałdowanej kartki, b-arkusze), zwroty oraz nieregularne pętle. Struktura stabilizowana jest głownie przez wiązania wodorowe pomiędzy jednostkami tworzącymi wiązania peptydowe.
Struktura wtórna III rzędowa- określa przestrzenne powiązania między elementami struktury II-rzędowej (helisami, kartkami i innymi), jak wzajemne oddziaływania między domenami, sposoby fałdowania oraz oddziaływania stabilizujące takie ułożenie. stabilizowana jest przez rodzaje wiązań
niekowalencyjnych:• wiązania wodorowe – wytwarzane przez polarne reszty aa• oddziaływania hydrofobowe – występują pomiędzy niepolarnymi resztami aa• oddziaływania elektrostatyczne („mostki solne”) – tworzą się między przeciwnie naładowanymi grupami, np. końcami N i C peptydow bądź resztami polarnymi jonizującymi (np. Lys i Asp)• siły van der Waalsa – są bardzo słabe i działają jedynie na niewielkie odległości, rowne sumie promieni van der Waalsa atomow pomiędzy ktorymi występują; i kowalencyjnych: •wiązania disiarczkowe – tworzone między resztami siarki pochodzącymi z dwoch reszt cysteiny
struktura wtórna IV rzędowa- opisuje przestrzenne ułożenie podjednostek białkowych. Każda podjednostka jest odrębnym łańcuchem białkowym wchodzącym w skład funkcjonalnego białka. •ze względu na liczbę podjednostek wyróżniamy odpowiednio di-,tri-, tetramery itd. Homooligomery składają się z kilku identycznych
podjednostek, podczas gdy heterooligomery – z różnych
Oznaczanie N końcowego aminokwasu
Przeprowadza się reakcję znakowania polipeptydu specyficznym związkiem (np. 2,4-dinitro-1-fluorobenzenem lub chlorkiem dansylu czy też chlorkiem dabsylu), który tworzy stabilne wiązanie kowalencyjne z wolną grupą α-aminową aminokwasu. Użyć można 2,4-dinitro-1-fluorobenzenu (DNFB), który reagując w środowisku zasadowym (pH 8–9) z wolną grupą α-aminową podstawia swój rodnik 2,4-dinitrofenylowy (DNP) w miejsce jednego atomu wodoru grupy aminowej. W reakcji tej powstaje żółto zabarwiona N-DNP-pochodna aminokwasu N-końcowego, która po uwolnieniu w wyniku hydrolizy kwaśnej polipeptydu (6M HCl) może być łatwo zidentyfikowana chromatograficznie. Zastosowanie chlorku dansylu (DNS) do znakowania N-końcowego aminokwasu jest reakcją 100-krotnie czulszą od dinitrofenylowania. Dansylowe pochodne aminokwasów (sulfonoamidy) silnie fluoryzują w świetle nadfioletowym. Równie czuła jest reakcja kondensacji N-końcowych aminokwasów z chlorkiem dabsylu, dostarczająca intensywnie zabarwione pochodne dabsylowe aminokwasów N-końcowych, które po hydrolizie identyfikuje się na podstawie własności chromatograficznych. Mimo dużej czułości większości omówionych metod oznaczania aminokwasów N-końcowych, nie można ich stosować wielokrotnie do analizy tej samej próby polipeptydu, ponieważ podczas hydrolizy kwasowej polipeptyd ulega całkowitej degradacji do wolnych aminokwasów.
Metodyoczyszczania białek
wytrącanie białek roztworami soli (np. siarczanem amonu) – tzw. wysalanie
Wysalanie jest to proces niszczenia otoczki hydratacyjnej wokół białka, co powoduje wzmocnienie oddziaływań hydrofobowych pomiędzy makrocząsteczkami i tworzenie agregatów białkowych.
Najłatwiej wysolić białko w jego punkcie izoelektrycznym, czyli w takim pH, w którym ładunek wypadkowy na jego powierzchni jest równy 0.
wytrącanie białek rozpuszczalnikami organicznymi (np. etanolem, acetonem lub izopropanolem)
Ekstrakcja wiąże się z obniżeniem stałej dielektrycznej środowiska i ograniczeniem działania wody jako dobrego rozpuszczalnika dla cząstek polarnych.
Taki proces należy prowadzić w obniżonej temperaturze (O°C lub niższej), aby nie nastąpiła nieodwracalna denaturacja białek.
Metody chromatograficzne
Techniki chromatograficzne są wykorzystywane do separacji białek na podstawie takich parametrów, jak:
Wielkość i kształt
Hydrofobowość
Ładunek powierzchniowy
Powinowactwo (czyli zdolność do wiązania wybranych ligandów)
Chromatografia wykluczania: rozdziela się białka na podstawie wielkości i kształtu cząstek (filtracja żelowa). Ważne: dobór żelu, ułożenie złoża, szybkość elucji, ilość materiału. Chromatografia jonowymienna: Jest metodą analizy oraz rozdziału substancji rozpuszczalnych, posiadających ładunek elektryczny. najczęściej stosowana technika do rozdziału i oczyszczania. wyróżniamy dwa typy nośników: anonit i kationit. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych: hydrofobowych rozdziela białka na podstawie różnic w sile oddziaływań obszarów hydrofobowych białka z jeszcze bardziej hydrofobowymi grupami ligandów, umocowanymi na powierzchni nośnika pozbawionego ładunku elektrycznego. Chromatografia powinowactwa: wykorzystuje powinowactwo dwóch substancji biologicznie czynnych, zdolnych do tworzenia kompleksów ES, E-Inhibitor.
Proenzym- enzym wydzielany w organizmie w postaci nieczynnej, aktywowany do katalizowania określonej przemiany dopiero w określonym miejscu, przy odpowiednich warunkach i pod wpływem odpowiedniego czynnika chem. Zwanego aktywatorem. Katalaza- enzym z grupy oksydoreduktaz katalizujący proces rozkładu nadtlenku wodoru do wody i O2. Celuloza- nierozgałęziony polisacharyd zbudowany liniowo z 300-1400 cząsteczek glukozy połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi.