1mm*1mm*0,1mm = 0,1 yl

Liczymy tylko z 2 boków [Burkera]

(a1+a2)* Rozcieńczenie

2 = X [kom/yl]

0,1 –--- X

1000 – Z [kom/ml]

(V*d) / Z = YYY [ml]

V – YYY = ……

ZAMRAŻANIE:
1. Obejrzeć hodowlę pod mikrosk.

2. Usunąć podłoże hodowlane

3. Hod.przpełukać 3ml r-ru PBS bez Ca/Mg2+

4. Usunąć PBS i +2ml r-r trypsyny z EDTA.

5. Przepłukać Hod.i usunąć całość r-r enz.

6. inkubować w 37*Cw termostacie ok.1-3 min.

7. Kom.zawiesić w podł.do zamarzania

(70% MEM, 20% surow.płodow., 10% DMSO)

8. Zawiesinę kom.do ampułki.

9. Schładzać z V= 1*/1min do -70*C. Potem

na 12h do par ciekłego N2 (-80) i do ciekł.(-196).

ROZMRAŻANIE:
1. Wyjąć ampułkę i niech odparuje z niej azot.

2. Umieścić w łaźni wodnej [bez zakrętek]

do zniknięcia kryształków lodu.

3. Przenieść zawartość A. do nacz.hodowl.

i +5ml płynu odżywczego.

4. Umieść w inkubatorze (37*C i 5% CO2)

5. Po 24h zmienić podłoże na świeże i [4.pkt.]

Barwienie:
Błękitem trypanu (żywotność kom)
Wnika przez uszkodz.bł.kom.

Czerwień oboj.NR – (żywe kom.) gromadzona

w lizosomach. Ilość NR = ilość żywych kom.

DAPI – barwi Jądra/chromos. W UV świe.NIEB.

* Eozyna – CYTOPL.na różowo

* Fluorestencyjne: OranżAkrydyny:

-Ziel.świec.-Jądra kom.apopt.

-Czerw. RNA

Bromek Etydyny: Czerw/pomar. JĄDRO

Hoechst33342 – NIEB.świec. J.K.żywych

Jodek Propidyny IP – czerw.fluor. J.K.apop.

*Hematoxylina – (ocena ST.kondens.

chromatyny i obserw.ciałek apoptycz)

…NIEBIESKIE białka jądra

May-Grunwalda-Giemsy – J.KOM [fiolet]

[Giemsy wiąże się do DNA]

- CYTOPL. [nieb-róż] [M-G]

- Bazofile: ciemnonieb.granule w cytopl.

- Eozynofile: jasno-pomarańcz.

- Erytrocyty: różowe

Red CMXRos – mitoch.kom.żywy.CZERW.

Test z rysą (porównanie liczby kom.

migrujących bez substr./z odp.stęż.subst.)

Określenie zdolności do hamowania przez

subst.procesów przemieszczania się kom.

APOPTOZA: (*)

Pofałdowania bł.kom./ ↓obj./ -H20/

/ konsens.chromatyny/ obkurcz J.

i fragmentacja Jądr./ fragment.DNA

na 180-200pz / ciałka apoptyczne

NEKROZA:

Przypadkow. degradacja DNA/ ↑V,

pęcznienie organelli/ -ATP/ cytopl.ulega

wakuolizacji/ pękanie bł kom./ stan zapalny/

/tworzenie skupisk martwych kom.

TEST:

● Prolifer.i żywotność - MTT

Dehyd.Burszt (wew.bł.mitoch)

przekształca rozp.w H20 zółtą sól MTT

do NIErozp.fiolet.kryształ.FUMARANu.

+SDS rozpusza się i mierzymy absorb.

= wprostproporc.do ilości ŻYWYCH.KOM.

24h inkub. cytotoxyczność

96h wpływ na proliferację

● St.uszkodz.bł.kom. – LDH

Ocenia cytotox.zw. Bada aktywność

LDH uwalnianej do środ.z bł.kom.

Przez badaną subst. [telefon]

●Neutral RED – NR

Pobierany barwnik przez żywe kom.

[telefon] – Cytotoxyczność

● BrdU – wykrywanie przez przeciwciała

monoklonalne znakowane enz. (test ELISA)

analogu tyminy, która wbudowuje się

do nowopowstałych nici DNA. [telefon]