Charakterystyka wirusów wg Burneta
Wirusy są mikroorganizmami które w swej najmniejszej zakaznej postaci maja najdluzsza srednice nie przekraczajaca 400nm. Namnażaja się tylko wewnątrz żywych kom, ulegaja przemiane w forme niezakazna(faze eklipsy), cpo jest koniecznym stadium ich namnazania się. Faza eklipsy odroznia wew kom namnazanie wirusow od wew kom namnazania bakterii.
Wady i zalety zarodkow.
Zalety:
- metoda prosta i tania
- nie wymaga klatek, pomieszczen, pozywienia
- bezpieczne dla personelu
- zarodek zakazony jednym wirusem może lezec bezpośrednio obok zakazonego innym- skorupka to naturalny izolator
- 3 listki zarodkowe- tropizm wirusa
- można ja stosowac nawet w terenie
- uzyskujemy duze ilości wirusa
- kom dobrze odzywcze o wysokim tempie namnazania
Wady:
- w zarodkach mogą być inne wirusy i to może prowadzic do omylek diagnostycznych ( np. interferencja)
- nie jest to podloze uniwersalne
- może zmieniac właściwości wirusa (utrata zjadliwości, np. wirus grupy)
Odczyn HA hemaglutynacji
Wiele wirusow wykazuje dzialanie hem aglutynacyjne. Reakacja nast. Na skutek dzialania wirusa na odp receptory na pow krwinki czerwonej. Zjawisko polega na zlepianiu się krwinek, za pomocą mostkow , w widoczne golym okiem grudki. Dzieje się tak na skutek aktywności wirusowego bialka hemaglutyniny. Zjawisko to wykorzystywane jest w Bad diagn jako szybka metoda wykrywania pewnych wirusow.
Przebieg:
Na szkielko dajemy krople krwi i dodajemy badanego wirusa. Jeśli ma właściwości hemaglutynacyjne zobaczymy grudki.
Odczyn HI hamowania hemaglutynacji
Odczyn wykonujemy dla wirusow o właściwościach hemaglutynacyjnych. Wynik badania podajemy w postaci miana surowicy. Musimy wiedziec jaka dawke wirusa wykorzystac wiec najpierw okreslamy miano hemaglutynacyjne wirusa. W tym celu rozcieńczamy wirusa do kolejnych probowek 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 i nastepnie dodajemy krwinki czerwone. Inkubujemy 30 min i odczytujemy miano (najwyższe rozcieńczenie w którym wyst hemaglutynacja). Do odczynu hamowania hemaglutynacji wykorzystujemy 4 krotnie mniejsze rozcienczenie wirus niż wynosi jego miano hemaglutynacji.
Rozcienczamy surowice do kolejnych probowek 1:10 20 40 80 160 320 640, dajemy dawke wirusa. Dodatkowo robimy kontrole krwinek i kontrole surowicy ( krwinki musza opasc na dno). Inkubujemy 15 min i dodajemy krwinki czerwone. Inkubujemy 30 min i odczytujemy miano HI (Najwyzsze stezenie w którym nie wyst hemaglutynacja)
Budowa chemiczna wirusów
Biorac pod uwage bud chemiczna I procentowy udzial skladnikow bialka, kw nukleinowych, weglowodanow I lipidow stwierdza sie znaczne roznice miedzy poszczegolnymi wirusami. Każdy wirus wyst w 2 postaciach: wegetatywnej- wirus wew kom i winiona- wirus poza kom, spoczynkowy. Dane o skladzie chem dotycza postaci winiona. Male wirusy- czyste nukleoproteiny. Średnie- dodatkowo węglowodany i tluszcze. Duze- sklad bardzo zlozony. Wirusowe nukleoproteiny maja wiele char właściwości: ustalony kształt oraz ilościowy stosunek kwasu do bialka. Struktura zapewnia odizolowanie kwasu od środowiska zewnętrznego(niskodrobinowe zw jak formaldehyd i azotyny mogą przenikac przez plaszcz bialkowy.
Bialka wirusow- sklad aminokwasowy zbilzony do bialek gospodarza, nie stwierdzono D- aminokwasow, przeważają aminokwasy kwasne. Charakterystyczna cecha lancucha bialka- maskowanie koncowych aminokwasow- przystosowanie utrudniające zniszczenie bialka wirusa przez proteaze gospodarza. Bialka wirosow duzych wykazuja niejednorodność, posiadanie specjalnych tworow oraz enzymow. Rozna się funkcja wrażliwością na proteolize i roznia się antygenowo.
Kwasy nukleinowe wirusow- w sklad winion a wchodzi albo Dna (podwojny, tylko u parwowirusow pojedynczy) albo RNA (glownie pojedynczy, tylko u reoviridaeo i birnaviridae podwojny). Struktura lancucha polinukleotydowego zamknieta pierścieniowo. Genom wirusow RNa może być segmentowany. Masa czasteczkow kwasow zalezna od rodzajow wirusa. Procentowa zawartość w winionie również (1-50%)
Tłuszczowce wirusow- procentowa zaw wacha się od 0,4- 64%. Obecnosc ich w wirionie decyduje o wrazliwosci ich na dzialanie org rozp tluszczowych, detergentow i enzymow. Mocno zw z czast wirusowa jako lipoproteidy w otoczce lub w postaci luzno związanej.
Weglowodany wirusow- 3-16% oprocz rybozy i deoksyrybozy inne zw z pentoz, heksoz i glikozydow
Wiroidy
Wiroid czyli wirusopodobny. Wiroidy to bezkomórkowe czynniki zakaźne. Zbudowane są jedynie z materiału genetycznego, który stanowi pojedyncza, kolista cząsteczka RNA. W odróżnieniu od wirusów, wiroidy nie posiadają kapsyd, jak również nie mają zdolności syntezy białek, gdyż ich genom nie koduje żadnego polipeptydu. Sam wiroid ulega replikacji jedynie dzięki enzymom gospodarza. Kolistosc RNA uniemozliwia wykazanie grup koncowych czasteczki, prawdopodobnie dzieki temu wiroid zachowuje aktywność biologiczna w środowisku. Istota chorobotworcza dzialania nie znana. Po dostaniu do kom wedruje do jadra i tam ulega namnożeniu. Czynnik zakazny roslin
Pobieranie i przesyłąnie prób do badan wirusologicznych.
Proby pobieramy przyżyciowo lub material sekcyjny. Przyzyciowo pobieramy od zwierzat w fazie ostrej choroby. Pobieramy krew, kal, mocz, wymazy z blon sluzowych, popłuczyny, zawartość pęcherzy, fragmenty tkanek. Posmiertnie pobieramy bardzo szybko, trakcie śmierci klinicznej ale nie biologicznej ponieważ wirus namnaża się tylko w żywych Komorkach i szybko dochodzi do autosterylizacji (zmienia się pH i wirusy Gina). Proby pobieramy z narządów chorobowo zmienionych. Pobrane proby umieszczamy w jalowych naczyniach. Jeśli SA to fragmenty tkanek to dodajemy do 50% glicerolu( dzialanie przeciwbakt i przeciwgrzybiczne). Proby musza być schłodzone.Najlepiej przesłać w termosie z lodem lub zamrozone ( jeśli wirus dobrze znosi proces rozmrazania). Proby musza być dobrze zabezpieczone. Przy pobieraniu prob Dorze jest pobrac surowice 1 raz i po 2 tygodniach w celu potwierdzenia rozpoznania wirusa.
Priony- charakterystyka
Priony- białkowe czastki zakazne, wykazujące zdolność namnazania się mimo brku obecności kwasow nukleinowych. Powoduja choroby zwierzat, np. trzesawke owciec i u ludzi creutzfeldta-jacoba. Polimery czasteczek bialka polaczone SA z czescia cukrowcowi prawdopodobnie kwasem sjalowym. Jedna z hipotez zaklada ze genom kom ssakow zawiera zablokowany gen informacji dla bialka prionu, aprion wykazuje zdolność odblokowania tego genu.
Bezposrednie badania wirusologiczne z prób przesyłanych do
laboratorium.
Badanie mikroskopowe- w przypadku duzych wirusow odpowiednio zabarwione preparaty ogladamy w mikroskopie świetlnym, szukamy cialek wtrętowych
Mikroskopia elektronowa
Immunomikroskopia elektronowa- do proby daje się przeciwciała które lacza się z wirusami i tworza się skupiska
Wykrywanie wirusa przez wykrywanie kwasow nukleinowych wirusa: hybrydyzacja, sondy genetyczne
Metody z zastosowaniem surowic diagnostycznych
Odczyn immunofluorescencji
Immunoperoksydazowy
ELISA
Immunodyfuzji w zelu OWD
Zmiany w zarodku kurzym i w hodowli komórek- po zakazeniu wirusem (z notatek riczi)
Zmiany w zarodkach:
- jeśli padna po 24h to jest to najczęściej powodem uszkodzenia mechanicznegu lub zakazenia bakteryjnego, bo wirusy potrzebuja do namnazania około 48h
-śmierć
wybroczyny – tkanka podskórna, brodawki piór, okolica potyliczna
przekrwienie – skrzydła, nogi lub całe ciało
zahamowanie rozwoju
skręcenie zarodka
zmniejszenie lub zwiększenie ilości płynu omoczniowego
zgrubienie i obrzęk błony kosmówkowo-onoczniowej
ogniska nekrotyczne lub strefy nacieków leukocytarnych często z centralną martwicą
zmiany histopatologiczne, np. ciałka wtrętowe
Zmiany w hodowli Komorek:
- dysfunkcja – zaburzenie metabolizmu – zmiana pH
- destrukcja – efekt cytopatyczny CPE – uszkodzenie komórek widoczne pod mikroskopem, wirus cytopatogenny, tzn ze zaburza metabolizm kom, co manifestuje się zmianami. Degradacja jest wynikiem hamowania metabolizmu, degradacja kwasow nukleinowych i bialek, zatrzymanie podziałów kom, uszkodzenie lizosomow i wakuolizacja cytoplazmy, dezintegracja jadra kom, uszkodzenie blony komorkowej.
- postępująca degeneracja kończąca się lizą – komórka odkleja się od podłoża – trwa kilka dni, najpierw komórka zmienia kształt, staje się zaokrąglona, a jej brzegi wyraźniejsze, później zmiany degeneracyjne wewnątrz komórki, np. zwyrodnienie wodniczkowe, na końcu liza komórki
- powstawanie syncytiów – komórek olbrzymich – przypomina owoc morwy
- powstawanie ciałek wtrętowych – widoczne po zabarwieniu odpowiednią metodą – miejsca wewnątrz komórek inaczej wychwytujących barwnik, powstają w jądrze komórki, cytoplazmie lub w obu miejscach na raz. Tylko u niektórych wirusów. Są to miejsca gdzie wirus jest powielany i składany, blizny w komórkach lub skupiska wirusów potomnych
- powstawanie łysinek
- proliferacja – wirusy onkogenne
- chaotyczny wzrost komórek, wielowarstwowy
- brak hamowania kontaktowego, komórki dzielą się nawet po odklejeniu od podłoża
- zmiana morfologii komórek
- zmiana metabolizmu
- dzialanie mechaniczne- gromadza się czast kapsydu, co powoduje ze kom obumiera, zsuwa się do plynu i robi się dziura
- brak widocznych zmian
- brak wirusa w materiale
- wirus niecytopatogenny
- zbyt mała ilość wirusa w materiale
bialka wczesne wir
Okres eklipsy w procesie zakazenia kom można podzielic na 3 stadia:
Przygotowawcze do syntezy komponentow wirusa
Synteza komponentow wirusa
Formowania wirionow
W stadium przygotowawczym nastepuje wstrzymanie syntezy składników kom. Genom indukuje synteze wczesnych bialek: represorow hamujących replikacje kom DNA, rRNA, mRNA, a także innych wczesnych bialek, enzymow (glownie polimeraz katalizujących tworzenie się lancucha kw nukleinowych z wolnych nukleotydow)
Pozne bialka
Potem nastepuje faza wytwarzania poznych bialek czyli strukturalnych, które będą Stanowic czesc skladowa wirionow
Synteza bialek wczesnych i poznych regulowana jest na poziomie translacji ( u RNA wirusow) i na poziomie transkrypcji( u DNA wirusow)
Odczyny serologiczne wymienić. Opisać test elisa i odczyn hamowania
hemaglutynacji
Hamowanie hemaglutynacji – HI
Hamowanie hemadsopcji
Odczyn seroneutralizacji – SN
Test ochronny PT
OWD
Odczyn precypitacji – immunodyfuzji
Odczyn hemaglutynacji pośredniej
Immunobloty
Odczyny z zastosowaniem koniugatów (ELISA, immunofluorescencja, odczyny radioimmunologiczne)
test ELISA- na płytki z z zaadsorbowanymi przeciwciałami, dodajemy wirus, potem surowice z przeciwciałami specyficznymi dla wirusa znakowana enzymem oraz substrat dla enzymu. Wynik barwny reakcji swiadczy o uwolnieniu enzymu z przeciwciała, czyli antygen specyficznie pasowal do przeciwciała= wirus zidentyfikowany.
Metody uwalniania wirusa z zakazonej komorki
Wirusy dzielimy na:
Uwalniające się w sposób wybuchowy np. polio, ospy- nie przechodza przez blone komorkowa, a wydostaja się na zewnatrz po uszkodzeniu komorki
Uwalniające się w sposób ciągły np.myksowirusy, opryszczki- z uzyciem tych samych enzymmow, które ułatwiły macierzystemu winionowi wejscie do kom. U wielu tych wirusow ostateczne uformowanie nastepuje w blonie komorki, gdzie wirus otrzymuje tluszcze i węglowodany- nosi to nazwe paczkowania
istota i zastosowanine odczynu SN (seroneutralizacji)
Odczyn sluzy do identyfikacji wirusa. Polega na zobojetnieniu właściwości zakaznych wirusa. Musimy mieć surowice diagnostyczna. Odczyn zachodzi w 2 fazach:
In vitro, w probowce zbieramy wirus i surowice , inkubujemy, wykonujemy tez kontrole z samym wirusem
In vivo, stosujemy podloze w którym wirus stosuje jakies dzialanie( np. śmierć zarodkow), jeśli daje efekt cytopatyczny stosujemy hodowle kom
Jeżeli wirus w kontroli daje odpowiednie dzialanie np. śmierć zarodkow, a w zneutralizowanej nie wykazuje tego, tzn, ze zindetyfikowalismy wirusa.
odpowiednie warunki do rozwoju zarodkow
Temp 37,5- 38,5
Przerzucamy je 2 razy dziennie aby siec naczyn się prawidłowo rozwijala
Dostęp odpowietrza 1jajo- 1 litr
Wilgotność 50-70%
Namnażanie wirusa w organizmie
1. Adsorpcja
- reakcja między receptorem komórki a wirusowym miejscem wiążącym receptor
2. Penetracja
- fuzja – wirusy otoczkowe posiadające białko fuzyjne – do środka wnika tylko nukleokapsyd
- wiropeksja pinocytoza – wirusy otoczkowe (hem aglutynina, komórka gospodarza musi posiadać klatrynę). Cały wirus wnika do komórki po utworzeniu pęcherzyka
- translokacja – małe wirusy bezo toczkowe – całe wnikają do wnętrza komórki
3. Uwolnienie genomu wirusowego (odpłaszczenie wirusa) – początek eklipsy
- możliwe podczas adsorpcji, jednocześnie z penetracją lub po niej
- w proces ten zaangażowane enzymy gospodarza
4. Synteza składników wirusa
- transkrypcja genomu wirusowego na mRNA (wyjątek ssRNA+, które samo działa jak mRNA)
- translacja: białka wczesne, funkcjonalne i późne (białka kapsydu, strukturalne)
- replikacja
5. Formowanie się i dojrzewanie wirionów potomnych (koniec eklipsy)
- łączenie podjednostek białka z kwasem nukleinowym
- może zachodzić w różnych miejscach w zależności od wirusa
6. Uwalnianie wirionów potomnych z komórki
- gwałtowne – po śmierci i lizie komórki – jednocześnie uwalniane są wszystkie wirusy potomne, np. poliowirusy
- w sposób ciągły – pączkowanie (uwalnianie do przestrzeni międzykomórkowych), przechodzenie z komórki do komórki przez pory lub dzięki fuzji błon (powstają komórki olbrzymie, mające do tysiąca jąder)
Znaczenie glicerolu w wirusologii
Zastosowanie w przy przechowywaniu materiałow do badan wirusologicznych. Nie wpływawa toksycznie na podłoża biologiczne. Jeśli probami SA fragmenty tkanek to dodajemu do 50% glicerolu (działanie bakteriobiojcze i przeciwgrzybicze)
Drogi zakażenia zarodka
Zakażenie:
w zależności od wirusa między 6 a 15 dniem inkubacji
po prześwietleniu miejsce zakażenie zaznaczamy, odkażamy, borujemy (naruszamy tylko skorupkę), znów odkazić, inokulujemyn (strzykawką insulinówką lub tuberkulinówką z krótką igłą), otwór zalepiamy roztopioną parafiną
zakażone zarodki opisujemy ołówkiem – bo flamaster może przenikać do środka
po zakażeniu trafiają z powrotem do inkubatora
przy niektórych metodach zakażania jaj już nie obracamy
| Droga zakażenia | Wirus, cel zakażenia |
| Błona komórkowo-omoczniowa | Wirusy dermatotropowe – opryszczki, krowianki, pryszczycy, ospy itp. → zarodki 7- 8 dniowe, wcześniej inkubujemy w obniżonej wilgotności (żeby zwiększyła się komora powietrzna) → dwa sposoby → metoda klasyczna, do celów diagnostycznych (prześwietlamy zarodek, zaznaczamy ołówkiem granice komory powietrznej, poniżej komory powietrznej, po stronie zarodka, między naczyniami rysujemy trójkąt o boku 5mm. Nad komorą powietrzną borujemy otwór. Delikatnie odpiłowujemy zaznaczony trójkąt. Przesunięcie komory powietrznej na obszar trójkąta – zadrasnąć igłą błonę pergaminową i dać kroplę płynu fizjologicznego – błony rozklejają się, tworzy się sztuczna komora powietrzna, gdzie wprowadzamy wirus 0,1-02ml. Brzegi trójkąta zalepiamy parafiną i nakładamy na to szkiełko nakrywkowe) Zarodków nie obracamy. → metoda alternatywna, do badań ilościowych |
| Doomoczniowo | ->pantropowe wirusy → w celu namnożenia dużej ilości wirusa do dalszych badań → około 10 dnia → prześwietlamy zarodek, zaznaczamy granice komory powietrznej. 5mm poniżej, po stronie zarodka, między naczyniami zaznaczamy miejsce borowania. Odkażamy jodyną, borujemy, odkażamy. W kierunku ku środkowi jaja, do jamy omoczniowej wprowadzamy 0,1 – 0,2ml wirusa |
| Doowodniowo | → wirusy pneumotropowe, grypy, parainfluenzy → około 10 dnia Dwie metody: → inwazyjna, pewniejsza – podobna do poprzedniej → nieinwazyjna – zaznaczamy komorę powietrzną i odcinamy wierzchołek. Na nie kroplę oleju parafinowego – błony pergaminowe stają się przejrzyste. |
| Dożółtkowo | → wprowadzenie dużej ilości materiału – do 1ml → zarodki 5-6dniowe, bo mają duży woreczek żółtkowy → po stronie przeciwnej do zarodka, prostopadle do środka, połowa wysokości jaja |
| Domózgowo | → wirusy neurotropowe, np. wścieklizny → obciąć kapturek, prześwietlić błonę olejem parafinowym. Materiał w główkę zarodka. Bardzo mała ilość – 0,02ml |
Miano hemaglutynacji- najwyższe rozcieńczenie w którym nastąpila hemaglutynacja
Miano surowicy w odczynie HI- najwyższe rozcieńczenie w którym nie wystąpiła hemaglutynacja.
Mechanizmy rezystencji przeciw wirusom
Gdy organizm nie miał w przeszłości kontaktu z zarazkiem- dysponuje pewnymi czynnikami opornymi, a ponadto uruchamia dalsze, chroniące go przed zakażeniem wirusowym, natomiast małą lub prawie znikomą obronę przypisuje się działaniu przeciwciał i odporności komórkowej.
Gdy gospodarz miał już kontakt z antygenem lub był sztucznie uodpororniony i ma już przeciwciała, lub uczulone limfocyty T- zakazenie stanowi bodziec do reakcji anamnestycznej i nastepuje wtrzymanie rozwoju procesu.Przy schorzeniach odlugim okresie inkubacji- możliwe jest wytworzenie przeciwc ial nim nastapia objawy chorobowe.
U noworodków- istotna rola przeciwciał przekazanych przez matkę w życiu płodowym, lub za pośrednictwem siary, żółtka jaja u ptakow. W tym przypadku rozwoj procesu również ulega zahamowaniu.
Bariery fizjologiczne.
Ograniczają możliwość wnikania wirusa i jesgo rozprzestrzeniania się.
Skóra- niskie pH, pot, tłuszcz, łój
spłukiwanie błony śluzowej przez ślinę w jamie ustnje
izolujące działanie śluzu
niskie pH w żołądku, żółć w dwunastnicy
bariera krwiomózgowa- hamuję rozprzestrzenianie się wirusów neurotropowych
Cytotoksyczne makrofagi
Aktywowane nieswoiste makrofagi pojawiają się w 1 dniu po zakażeniu, osiągają najwyższy poziom 2-3 dni, znikają w ciągu tygodnia. Niszczą wybiórczo komórki zakażone niektórymi toga wirusami.
Komórki NK
Odgrywają najważniejszą rolę we wczesnych mechanizmach obronnych. Powstają i ulegają zróżnicowaniu w szpiku kostnym. Zabijają w następstwie spontanicznego cytolitycznego działania bez udziału przeciwciał. Cytolizie ulegają komórki zakażone wirusem oraz obce limfoidalne komórki normalne i nowotworowe. Ich aktywność mogą wzmagać zakażone wirusem komórki lub sam wirus oraz interferon.
Dopełniacz
Oprócz udziału w swoistych procesach immunologicznych spełnia ważną rolę przy braku przeciwciał, ponieważ aktywację dopełniacza mogą powodować też wirusy lub komórki zakażone wirusem.Białka dopełniacza łacza się z powierzchnia wirusa i tym samym maskuja lub pokrywaja struktury winiona potrzebne do jego przyczepienia się do wrażliwej komórki. Ponadto dopełniacz ma zdolność powodowania lizy wielu wirusów otoczkowych.
Wpływ supraoptymalnych temperatur na syntezę wirusa.
Zakażone komórki zostają otoczone przez leukocyty w powstającej strefie zapalnej gromadzi się kwas mlekowy, wzrasta ciśnienie CO2 i następuje spadek pH. Ponadto pirogeny uwolnione z leukocytów wywołują wzrost temperatury ciała-hamuje to replikację i wzmaga uszkodzenie lizosomów, z których uwalniają się enzymy.
Fagocytoza
Makrofagi o dużej aktywności fagocytarnej mogą odgrywać ważną rolę w zapobieganiu zakażeniu wrażliwych komórek przez wirusy krążące we krwi.Ochronne działanie makrofagów nie jest w zakażeniach wirusowych regułą i zależy zarówno od właściwości wirusa (może on wykorzystać m.do rozprzestrzeniania się) jak i rodzaju gospodarzy.
Nieswoiste inhibitory
Zawarte w surowicy i innych płynach ustrojowych. Mogą wywierać hamujący wpływ na rozprzestrzenianie się wirusa.
Czynniki genetyczne
Determinuja fenotypowa ceche niewrażliwości na określone zakazenia wirusowe (odpornosc gatunkowa rasowa)
Oporność na zakażenie wirusowe wzrasta z reguły równolegle z wiekiem. Mlode maja mniejsza zdolność wytworzenia interferonu
Odczyn hemadsorpcji
Hemadsorbcja
- zdolność komórek zakażonych wirusem otoczkowym do adsorbowania na swojej powierzchni erytrocytów (wirus zmienia powierzchnię komórek zakażonych)
- hodowlę komórkową zakażamy badanym wirusem, inkubujemy, wylewamy płyn z hodowli, wprowadzamy krwinki czerwone
- po 10 minutach wypłukujemy nieprzyczepione krwinki czerwone
Immunofluorescencja
– pośrednia (wirus + swoista surowica nieznakowana + surowica antyglobulinowa znakowana fluorochromem)
Test ELISA
do identyfikacji wirusa – test typu Sandwich
- na płytce z zaadsorbowanymi przeciwciałami dla wirusa (nieznakowane)
- wprowadzamy wirus – powstają kompleksy
- dodajemy przeciwciała znakowane enzymem
- dodajemy substrat dla enzymu
- wynik spektrofotometrycznie
metody bezpośredniego wykryw wirusa-wymien i opisz odczyn HA
Stwierdzenie obecności wirusa w badanym materiale bezpośrednio :
Mikroskopia
-mikroskop świetlny(w przypadku dużych np. ospy) odpowiednio zabarwiony preparat
- mikroskop elektronowy - musi być 10^6 cząsteczek wirusa, barwimy negatywowo kwasem fosforowolframowym)
- immunomikroskopia elektronowa – do próbki dodajemy swoistą surowicę , tworzą się skupiska przewcial z wirusami
- szukanie ciałek wtrętowych, np. przy wściekliźnie, odpowiednie barwienie
odczyny enzymatyczne- Hemaglutynacja i hemadsopcja- służące wyłącznie do stwierdzenia obecności wirusa otoczkowego w materiale, nie do jego identyfikacja
odczyny serologiczne- immunofluorescencja, immunoperoksydazowy, ELISA, immunodyfuzja w żelu, OWD
sondy genetyczne, hybrydyzacja- wykrywanie kwasów nukleinowych wirusów
metody ilościowe
odczyn hemaglutynacji- ustalenie miana hemaglutynacyjnego wirusa
HI ilościowy – stosowany w badaniu serologicznym, miano surowicy
odczyn seroneutralizacji- Zobojętnienie wszystkich cząstek wirusa przez przeciwciała – odczyn ilościowy (wzrastające rozcieńczenia jednego z badanych składników przy stałym stężeniu drugiego)
sondy genetyczne-zastosowanie
Różnica między płynem odżywczym a wzrostowym
Różnią się tylko zawartością surowicy a pozatym każdy z nich zawiera:
- aminokwasy(szczególnie te niesyntetyzowane przez komorke), cukry(substancja wzrostową jest glukoza), prekursory kw. Nukleinowych, sole mineralne, witaminy
-barwniki (fuksyna fenolowa) aby stwierdzic ze hodowla dobrze metabolizuje
-podstawą są bufory zrównoważone(tak dobrana ilość kationów i anionów aby nie był toksyczny dla komórki) nietoksyczne o dużej pojemności
-Antybiotyki-zapobieganie przerostowi bakterii i grzybow
-izotoniczny (0.87% NaCl), pH zbliżone do obojętnego.
-hydrolizat laktoalbuminy: bogate źródło subst. Odżywczych
-surowica: różnicuje płyny na podtrzymujące i wzrostowe,ułatwia przyklejanie komórek do podłoża,stymuluje podziały komórkowe,właściwości detoksy kujące, składnik odżywczy, właściwości buforujące, najlepiej płodowa cielęca może być pobrana od młodych cieląt przed pobraniem siary, zapewnia prawidłowe podziały i wzrost komórek bez objawów degeneracji, jest źródłem białka soli mineralnych, hormonów wzrostowych, kobalt nikiel miedz zelazo
-sole wapnia: gdy komórki musza być przyklejone do szkła
Zamiast surowicy może być wyciąg embrionalny z drożdzy i inne.
Płyn wzrostowy- 10-20% surowicy
Płyn utrzymujący- 0,5-5% uzywany keidy uzyskamy już wzrost hodowli i przy zakazaniu wirusem
Metody pozyskiwania wirusa z tkanek
Zachowujemy temperature od 0-4 stopnie, tkanki oplukujemy z glicerolu, rozdrabniamy jałowymi nożyczkami i skalpelem, rozbijamy komórki
homogenizacja- dajemy płyn fizjologiczny
rozcieramy w mozdziezu z jałowym piaskiem
zamrażamy i rozmrażamy ( o ile wirus nie jest na to wrażliwy)
Materiał zbieramy do próbowek wirowych i wirujemy. Powstaje osad- to są fragmenty rozbitych komórek, natomiast wirus jest w płynie nad osadem. Płyn ściągamy i zakążamy podłoża biologiczne (zarodki, h.komorek, zywe zwierzeta)
Odczyny stosowane w identyfikacji wirusa
Identyfikacja serologiczna wirusa
Hamowanie hemaglutynacji – HI
Hamowanie hemadsorpcji
Odczyn seroneutralizacji – SN
OWD
Odczyn precypitacji – immunodyfuzji
Odczyn hemaglutynacji pośredniej
Immunobloty
Odczyny z zastosowaniem koniugatów (ELISA, immunofluorescencja, odczyny radioimmunologiczne)
Hybrydyzacja
Badanie mikroskopowe
Bezobjawowe zakażenie wirusowe
Tylko nieliczne wirusy wywoluja głównie zakazenia kliniczne. Większosc wirusow powoduje zakazenie bezobjawowe, a tylko wyjatkowo objawy kliniczne, np. polio- choroba heinegomedina wyraza się porazeniem w 1 na 100 albo 1000 zakazen. Ryzyko powstania choroby wirusowej jest wypadkowa zjadliwości wirusa i rezystencji organizmu. Role odgrywa naturalna selekcja bardziej opornych osobnikow, atak ze zmiany w populacji wirusa prowadzace do pojawienia się szczepow mniej patogennych, powodujących zakazenia bezobjawowe. Spowodowane jest to tym, ze wirus namnaża się tylko w org żywych. Smierc gospodarza jest rownoznaczna ze śmiercią wirusa. Więc spadek zjadliwości wirusa jest to przystosowanie ewolucyjne korzystne dla wirusa, np. bezobjaowoe zakazenie u nietoperzy w czasie hibernacji umozliwia wirusowi przetrwanie zimy.
Zakazenie bezobjawowe- termin nadrzedny, obejmuje wszystkie zależności wirus- gospodarz przy których zakazenie przebiega bez objawow lub bez uchwytnego uszkodzenia Komorek gospodarza, może ale nie musi wyrazac się tworzeniem przeciwciał lub substancji takich jak interferon. Istotne SA mechanizmy dzieki którym wirus może omijac czynniki obronne organizmu i unikac usuniecia go z ustroju, np. brak immunogenności, integracja do genomu, upośledzenie odporności kom, namnazanie w miejscach osłoniętych przed czynnikami obronnymi, np. w gruczołach mlekowych, slinowych.
Za symbioze niechorobotwórczego wirusa i gospodarza można uważać bezobjawowe nosicielstwo wirusa zabezpieczające gospodarza przed zakażeniem zjadliwymi szczepami.
Zakażenie bezobjawowe:
Pierwotne- zarazek osiedlil się w organizmie nie wywołując choroby
Wtórne- jego obecność jest następstwem przebycia zakażenia jawnego i ustalenia stanu równowagi między zarazkiem a gospodarzem.
Brak objawów lub ich wystąpienie zależy od: zjadliwości wirusa, dawki, drogi jaka wniknął, od czynnikow oporności i odporności gospodarza, wieku, genow, stanu fizjologicznego. Wzrost ilości wirusa stanowi bodziec do produkcji interferonu, ten hamuje namnazanie się wirusa. Zależność ta powoduje ustalenie równowagi. Wiele czynnikow naturalnych sztucznych może spowodowac przejscie postaci bezobjawowej w jawna. Dodatkowe zakażenie innym wirusem na skutek synergizmu ujawnia zakażenie utajone, np. wirus opryszczki uaktywniany przez wirusy przeziębień. Kortykosteroidy mogą aktywowac utajone zakażenia wirusem wścieklizny. Stany stresu również mogą aktywować utajone zakażenie. Domieśniowo wprowadzenie wirusem adrenaliny aktywacja zakazenia wirusem Herpes Simple.
Linia komórkowa ciągła
Naturalne metody uwalniania wirusa z zakażonej komórki
Budowa wirusów (morfologia struktura)
znaczne różnice wielkości, różne kształty
kwas nukleinowy – DNA lub RNA – 1 lub 2-niciowy, liniowy lub kolisty, RNA o dodatniej lub ujemnej polarności
białkowy kapsyd, płaszcz, jednakowych podjednostek – kapsomerów
kwas i kapsyd razem tworzą tzw. nuleokapsyd
w niektórych dodatkowo otoczka - dwuwarstwa lipidów i białka – te, które po replikacji uwalniają się z komórki przez pączkowanie
niektóre wirusy zawierają enzymy odgrywające rolę w procesie zakażania, np. lizozym u bakteriofagów, odwrotna transkryptaza u retrowirusów (komórka gospodarza nie posiada takich enzymów)
Symetria wirusów
Kubiczna, dwudziestościenna, ikosaedralna
na zewnątrz kapsyd w postaci 20-ścianu
wewnątrz kwas nukleinowy
nagie lub z otoczką
Helikalna
kapsomery nanizane na łańcuch kwasu nukleinowego
całość skręcona w helisę – nukleokapsyd
nagie lub otoczkowe
Symetria złożona
kilka części i różnych kształtach i symetriach, np. niektóre bakteriofagi (bakteriofag T4)