Mikrobiologia ćw. 3

Charakterystyka niektórych

grzybów i wirusów

Grzyby

• Materiały do badania mikrobiologicznego

– Płyny ustrojowe
– Wymazy z ran
– Kał
– Materiały śródoperacyjne, cewniki
– Wymazy z górnych dróg oddechowych
– Wyskrobiny ze skóry i paznokci

• Przechowywanie materiału klinicznego

– Należy jak najszybciej przetransportować do

laboratorium

– Temp. 4° C
– Transportować w zamkniętych pojemnikach w

statywie

Grzyby– podział ze wzg.

klinicznych

• Dermatofity– skóra, włosy, paznokcie

– Microsporum, Trichophyton

• Grzyby dymorficzne– dwie postacie

morfologiczne w zależności od temp. 35-37°

C– drożdże,*> 37° C– Pleśń

– Histoplasma, Blastomyces

• Drożdże

– Tryptococus, Geotrichun

• Nitkowate– pleśnie

– Mucor

– Rhizocus

• Ciemne

– Cladosporium

• Hialinowe

– Aspergillus

Grzyby– preparat

bezpośredni

• W sterylnej foli
• Po odwirowaniu materiałów płynnych
• W plwocinie, BAL-u i ropie poszukujemy

grudek, ziaren, pasemek

• Materiały kliniczne na wymaz wyskrobujemy

na szkiełko z 0,9% NaCl

• Preparaty z wycinków tkankowych

(dermatofity) wykonujemy z 10% KOH– usuwa

materiały tkankowe zostawiając

nienaruszonego grzyba

• Niekiedy robi się preparaty barwione metodą

Grama- preparat barwi się wówczas na

niebiesko

Grzyby– metody

barwienia

• Gomori-Grocat

– Drożdżopodobne

• Fiolet krezolowy

– Gromada Zygomota

• Mucykarin

– Cryptococus

• Pozytywno negatywna– tusz kreślarski
• Strzępki, zarodniki- przyśpieszają diagnostykę

oraz umożliwiają wcześniejsze leczenie

• Rozpoznanie potwierdza się wzrostem w

posiewie grzybów

Grzyby– podłoża

• Podłoże Sabourauda

– Cyklonheksamid– hamuje wzrost grzybów pleśniowych
– Chloramfenikol- hamuje wzrost bakterii
– Inkubacja 10 dni w temp. 30° C (37° C)
– Przegląd hodowli po 24h- wstępna diagnostyka

• Gdy stwierdzi się obecność grzyba jedną płytkę

inkubujemy w temp. 37° C

– Przegląd hodowli po 48h identyfikuje się wrażliwość

na leki

• Podłoże Czepek-Doxa

– Cechy wzrostu podobne jak w podłożu Sabourauda.

Inne antybiotyki

• Podłoże Christiansena

– Cechy wzrostu podobne jak w podłożu Sabourauda.

Inne antybiotyki

Grzyby typy wzrostu

• T. Rubrum

– Kolonie czerwone

• T. Violacum

– Kolonie fioetowe

• E. Flocusum

– Wzrasta na oliwkowo

• M. Frufur

– Kolor kremowy, gładkie, miękkie

• A. Niger

– Czarne, „puszyste” ,postrzępione brzegi

• C.albicans

– Kolor kremowy lub biały

Grzyby– mikrohodowla

•

Szkiełko podstawowe, agar, grzyb (wymaz)

–

Tak przygotowany preparat ustawiamy na płytce

Petriego (wilgotna bibułka w środku)

•

Dermatofity

–

Barwienie błękitem metylowym

•

Pleśnie

–

Podbarwienie laktofenolem

•

Ocena mikroskopowa morfologii hodowli

grzybów

•

Identyfikacja

–

Dermatofity

•

Wygląd mikrokonidi i makrokonidi (zarodniki)

•

Oraz obecność i wygląd zarodników szczątkowych

–

Pleśniowe

•

Wygląd owocników

Grzyby– testy

• Test filamentacji

inaczej „germ tubes”

• Zdolność do

wytwarzania
charakterystycznych
wypustek
(filamentów) w
surowicy czy innych
płynach ustrojowych
w temp. 37° C przez
2 do 3h

Candida
albicans

Candida tropicalis

Grzyby– testy

• Test na ureazę

– Stosujemy podłoże z mocznikiem
– W ciągu 7 dni barwa podłoża powinna zmienić się z

żółtej na różową

• Trichophyton rubrum –
• Trichophyton mentagophytes +

• Test perforacji włosa

– Zdolność poprzecznego perforowania jałowego włosa
– Włosy wyjaławiamy i dodajemy ekstrakt drożdżowy

preparat umieszczamy na płytce Petriego (szkiełko z

nawilżoną bibułką)

– Preparat inkubujemy przez 2 tygodnie, a następnie

umieszczamy pod mikroskopem

• Dodatni wynik daje Trichophyton mentagophytes +
• Ujemny wynik daje Trichophyton rubrum –

Grzyby– testy

• Auksanogram węglowodanowy

– Zdolność do przyswajania węgla z cukrów

• Auksanogram azotowy

– Zdolność do przyswajania azotu ze związków

azotowych

• Zymogram

• Zdolność do fermentacji cukrów

• Test API

– miniprobówki + klucz

• Test ID

– Wgłębienia + komputer

• Metody serologiczne – dla grzybów

– Aglutynacja lateksowa

• Z płynu mózgowo – rdzeniowego

• Surowicy krwi

Grzyby– testy

• Serologiczne c.d.n

– OWD

– Precypitacja

• Serologiczne z zastosowaniem znaczników

– Immunoenzymatyczne

– Immunoradilogiczne

• Genetyczne

– Polimeraza łańcuchowa PCR

– Metody sond genetycznych– hybrydyzacji

• Wysoka czułość i swoistość

• Szybkie wykrywanie i identyfikacja w materiale

klinicznym

Grzyby – testy

• Antymikotyki – ocena lekowrażliwości

– Fungitest

• Metoda półilościowa oparta na metodzie

rozcieńczeniowej

• Na leki przeciwgrzybiczne

– Mikokonazol

– Ketokonazol

– Flukokonazol

– ATP- fungus INT

• Metoda ilościowa

– Ocena MIC

• Najmniejsze stężenie leku chamujące wzrost

kolonii grzybiczej

Podejrzenia grzybicy

• Skoki gorączki
• Zmiany w płucach przypominające gruźlicę
• Stwierdzenie obecności grzyba w materiale

klinicznym

• Brak efektów antybiotykoterapii

Grzyby– sposób zarażenia

• Przenoszenie dermatofitów

– Człowiek– człowiek

• Kontakt bezpośreni lub pośredni
• Antropofilne

• Gleba

– Geofilne

• Zwierzę

– Zoofilne
– Kontakt z chorym zwierzęciem
– Gleba

• Naskórek, który zostawiły podczas tarzania

Grzyby– choroby

•

Kandydoza – układowa

– Candida albicans

• Wchodzi w skład fizjologicznej flory górnych dróg

oddechowych (40- 80%), przewodu pokarmowego i

żeńskich dróg rodnych

– Candida tropicalis
– Candida krusei
– Zakażenia

• Skóry
• Układu pokarmowego, oddechowego, kostnostawowego
• Zapalenie oka, wsierdzia, OUN
• Posocznica
• Układu moczowego i rodnego

– Diagnostyka

• Wytwarzanie wypustek( test filamentacji)
• Wytwarzanie clamydospor („przetrwalników)

Grzyby – choroby

• Kryptokokoza – układowa

– Cryptococus Neoformans

• Kryptokokowe zapalenie opon mózgowych

– Cryptokokus pączkujący ma najczęściej otoczkę

polisacharydową

– Zakażenie

• Drogą kropelkową

• Odchody zwierząt

– Ptaków
– Drobiu

– Diagnostyka

• Uwidocznienie otoczki grzyba

Grzyby – choroby

• Aspargilioza – układowa

– Atakuje gł. układ oddechowy

• Postać alergiczna

• Postać inwazyjna

– Grzyb nacieka na miąższ płucny

• Grzybiak kropidlakowy

– Zmiany widoczne na zdjęciach RTG

– Najczęściej po gruźlicy

• Skórne

• Posocznica

– Zakażenia po przeszczepie szpiku, skóry, oka

– Zakażenie drogą kropelkową

– Leczenie

• Amfotrecyna B

– Postać inwazyjna

• Leczenie chirurgiczne

– Grzybniak kropidlakowy

Wirusy

• Są pasożytami wewnątrzkomórkowymi
• Posiadają DNA lub RNA
• Posiadają białka wiążące białka na powierzchni

komórek

• Materiały do badania mikrobiologicznego

– Surowica

• Jeśli jest pobierana strzykawką, a nie do probówki

należy przed przelaniem zdjąć igłę (zapobiega to

hemolizie krwinek)

– Wymazy

• Szybki energetyczny ruch do probówki z podłożem

transportowym

– Płyn z pęcherzyków płucnych

• Preparat bezpośredni

– Kał

• Suche, jałowe pojemniki

– Krew – 5 – 10 ml

Wirusy – pobieranie

• Zakażenia układu oddechowego

– Wymazy z gardła, nosa, popłuczyny z gardła

• Zakażenia układu pokarmowego

– Kał

• Wysypka pęcherzykowa

– Płyn z pęcherzyków

– Wymaz z gardła

– Kał

• Zapalenie wątroby

– Surowica

– Kał

• Zakażenie OUN

– Płyn mózgowo-rdzeniowy

• AIDS

– Nieskrzepnięta krew

Wirusy – pobieranie

uwagi

• Materiały powinny być pobrane z miejsca gdzie

obserwowany jest proces chorobowy

• Większość wirusów wnika przez drogi

oddechowe lub pokarmowe, gdzie wstępnie

mogą być namnożone, ale podstawowe objawy

kliniczne występują w narządach dalej

położonych

– Należy pobrać próbki z kilku miejsc, niezależnie od

miejsca chorobowego

• Jeśli trudno jest uzyskać próbkę z narządu

wewnętrznego lub wirus jest trudny w izolacji

– Również pobiera się próbki z kilku miejsc

Wirusy– przechowywanie i

transportowanie

• Zamknięta i odpowiednio oznaczona torba

– Wirusy mają dużą lotność

• Przechowywanie w temp. 4°C

– Podłoże transportowe z antybiottykami
– W termostatach

• Jeśli dłużej to w temp. -70° – -20°C

– W nieprawidłowo utrzymywanym materiale

produkty rozpadu komórek lub namnażające się
bakterie mogą uszkodzić wirusa

• Wirusy są bardzo wrażliwe na czynniki

środowiskowe taki jak temperatura czy
wilgotność, czy pH

Wirusy – wielkości

Wirusy – budowa

• Pojedyncza cząsteczka wirusa wydostająca się

z jednej komórki, a następnie zakażająca

kolejną, nosi nazwę wirionu.

• W skład wirionu danego wirusa wchodzi

zawsze tylko jeden rodzaj kwasu

nukleinowego, stanowiący materiał genetyczny

wirusa. Kwasy te w wirusach nigdy nie

występują razem. Są nimi:

– DNA
– RNA

• Dlatego wyróżniamy

– DNA wirusy
– RNA wirusy
– Retrowirusy

Wirusy – budowa

• Kwas nukleinowy może występować w postaci

– Jednoniciowego RNA

– Dwuniciowego RNA

– Jednoniciowego DNA

• Liniowego

• Kolistego

– Dwuniciowego DNA

• Liniowego

• Kolistego

• Materiał genetyczny wirusa jest osłonięty

białkową otoczką, zwaną kapsydem

– Zbudowany z kapsomerów, pojedyńczych jednostek

• Wirusy, które opuszczają komórkę gospodarza

przez pączkowanie, otoczone są dodatkowo

błoną lipidową pochodzącą z komórki

gospodarza

Wirusy – RNA

Wirusy – DNA

Wirusy – symetria

• Symetria helikalna;

– Wirus mozaiki

tytoniowej

• Dwudziestościan

– Najwydatniejszy układ

podjednostek w

zamkniętej osłonie

Wirusy – symetria

• Wirusy z płaszczem

– Płaszcz zawiera podwójną warstwę

tłuszczową z glikoproteinami

przytwierdzonymi do niej.

– Jej symetria przypomina

nukleokapsyd

• Wirusy złożone

– Bakteriofagi

Wirusy – cykl lityczny (1)

Wirusy – cykl lityczny (2)

Wirusy – cykl lizogeniczny

Wirusy – hodowla

• Wirusy zwierzęce i roślinne są hodowane w

kulturach komórkowych

– Ciągła linia komórkowa może być utrzymana przez

określony czas

Wirusy – identyfikacja i

hodowla

• Zwierzęta

– Najczęściej zarodki mysie

– Coxackie, wścieklizna, herpes simplex, arbowirusy

(kleszczowe zapalenie mózgu)

– Po wystąpieniu objawów/ śmierci zwierzęcia

wykonuje się dodatkowe oznaczenia

• Metoda IF

– Pozwalająca na umiejscowienie wirusa lub jego Ag

w komórkach różnych narządów różnych zwierząt

– Przeniesienie do hodowli in vitro

– Zastosowanie metod molekularnych

Wirusy – identyfikacja i

hodowla

• Zarodki ptasie

– Najczęściej 7– 13 dniowe zarodki kurze
– Izolacja herpes, końskiego zapalenia mózgu, orto- i

paramyksowirusów, poksowirusów ( ospa, krowianka,

ospa krowia)

– Zakażone zarodki obumierają
– Lub na ich błonach płodowych pojawiają się

charakterystyczne zmiany

– Przy braku zmian obecność wirusa można stwierdzić

metodą

• Hemoaglutynacji wirusowej
• IF
• Lub zakażając treścią zarodków wrażliwe hodowle

komórkowe lub wrażliwe zwierzęta

Wirusy – hodowla

• Można je też

hodować
metodą
biologiczną

• Najczęściej są

to zarodki
ptaków lub
noworodki
myszy

– Zdrowy

organizm zakaża
się wirusem i
obserwuje
rozwój choroby

Wirusy – hodowla in vitro

• Hodowle

in vitro

in vitro

– Hodowle pierwotne

• Są przygotowywane każdorazowo

• Jak hodowle nerek małp, świń, lub chomików oraz

zarodków kurzych

• Nie mogą być pasażowane

• Należy je wykorzystać w ciągu 2-3 tygodni

– Hodowle linii ciągłych

• Pochodzą z rozmaitych narządów i gatunków

zwierzęcych

• Mogą być używane w ograniczonej liczbie pasaży

(hodowle diploidalne)

• Lub nie pasażowane (hodowle heteroploidalne)

– Często używa się tkanki HLa z nowotworu

nabłonkowego szyjki macicy, KB z nowotworu

nabłonkowego jamy ustnej i języka i innych

Wirusy – hodowla in vitro

• Hodowle organowe

– Do celów bieżącej diagnostyki są stosowane

nieliczne (na ogół 2-3) linie komórkowe

– W wyniku zakażenia dochodzi do rozwoju

określonych zmian cytopatologicznych (efekt

cytopatyczny), widocznych w bezpośredniej

obserwacji mikroskopowej lub po barwieniu

zakażonych komórek

– Przy braku objawów testy

• IF
• DIF
• Test interferencji
• Metody molekularne

Wirusy – hodowla in vitro

• Przed wprowadzeniem badanego materiału do

systemu hodowli należy

– Pozbawić materiał substancji balastowych za

pomocą krótkotrwałego wirowania, przy niskich

obrotach

– Do płynu znad osadu dodaje się antybiotyki

• Penicylina

• Streptomecyna

• Czasem antymikotyki

– W niektórych przypadkach bada się też osad

• Np.. Mocz wirusy herpes i cytomegalii

• Wady metody izolacji

– Zróżnicowanie wymagań wirusów pod względem

zakażenia i patogenności dla określonych

gospodarzy, jaj czy linii komórkowych

– Występowanie wielu wirusów zakażających dane

komórki lub wywołujące podobne objawy –

konieczna dalsza identyfikacja

Wirusy

diagnostyka mikroskopowa

• Mikroskop świetlny

– Pozwala na obserwację różnych zmian

charakterystycznych dla wirusa zakażającego

• Rozmaz badanego materiału
• Preparat odbitkowy (oba utrwala się alkoholem)
• Barwienie metodą Giemzy, hematoksyliną i eozyną

– Podstawowa droga do obserwacji zmian

cytoplazmatycznych

• Zmiany degeneracyjne
• Powstanie komórek wielojądrzastych w hodowli

Wirusy

diagnostyka mikroskopowa

• Mikroskopia elektronowa

– Możliwość badania

• Materiałów powierzchniowych

• Wewnątrzkomórkowegoo umiejscowienia wirusów

(różnicowanie na podstawie morfologii tylko

czasami)

– Do uwidocznienia kompleksów antygen-przeciwciało

• Możliwość bezpośredniego typowania serologicznego

– Stosowana głównie do badań poznawczych i w

szczególnie groźnych sytuacjach epidemiologicznych

• Wysoka cena mikroskopu i jego eksploatacji

Wirusy

diagnostyka mikroskopowa

• Mikroskopia immunofluorescencyjna

– Powszechnie stosowana w diagnostyce zarażeń

wścieklizną

– Do identyfikacji określonej klasy przeciwciał klasy

Ig i o określonej aktywności przeciwwirusowej

zwłaszcza w bezpośrednich badaniach materiałów

diagnostycznych np.

• IgM, IgG– zakażenia różyczką, cytomegalią,

Epsteina-Barr

– Do wykazania obecności Ag wirusowego np..

• W wymazach z jamy nosowo-gardłowej w

przypadkach zakażenia wirusami

– Grypy
– Paragrypy

• Z osadu komórek moczu

– Cytomegalia

Wirusy

diagnostyka serologiczna

• Potwierdzenie zakażenia wirusowego ma miejsce

wówczas gdy:

– Wykazywane są swoiste przeciwciała IgM

• Przejściowe ich występowanie u noworodków i

niemowląt wskazuje na zakażenie wrodzone lub

okołoporodowe

• U dorosłych wykazują kontakt pierwotny z Ag lub

reaktywację zakażenia bezobjawowego (letalnego)

– Obserwowana jest serkokonwersja (wzrost 4-krotny lub >

w kolejnym badaniu) dla przeciwciał IgG, IgA

• Wskazuje na przebyte zakażenie, bez możliwości

określenia czasu

• Wartość diagnostyczną mają wielokrotne badania

serologiczne, minumum 2 próbek surowic, w odstępie

2-3 tygodni

– W fazie ostrej choroby
– W okresie rekonwalescencji

Wirusy – diagnostyka

• Metody radioimmunologiczne

– Przydatne dla szerokiego zakresu zakażeń wirusowych

• Wykrywanie wirusów lub ich przeciwciał

– Zalety

• Bardzo czułe

• Swoiste

• Dają odtwarzalne wyniki

– Wady

• Nie są powszechne ze względu na sprzęt i ochronę

środowiska

• Odczyn wiązania dopełniacza

– Wykonywany w licznych zakażeniach wirusowych

– Pozwala na określenie przyrostu przeciwciał

– Wady

• Niska czułość

• Brak różnicowania klas IgG

– Metoda odniesiona do innych metod

Wirusy – diagnostyka

• Metody immunoenzymatyczne

– Do wykrywania obecności antygenów, przeciwciał

wirusowych oraz ustalania miana

– Do wykrywania aktywności w określonych klasach Ig
– Teoretycznie mogą być wykorzystywane we

wszystkich zakażeniach wirusowych

– Zalety

• Szybki wynik
• Bezpieczeństwo wykonania
• Prostota odczynu i interpretacji
• Możliwość pełnej automatyzacji

Wirusy – diagnostyka

• Metoda neutralizacji

– Stosowana do wykrywania przeciwciał i do

identyfikacji izolowanych wirusów

– Rzeczywista ocena uodpornienia
– Polega na zobojętnieniu zakaźności wirusa przez

przeciwciała oraz na wykryciu pozostałości wirusa

zobojętnionego

• Po inkubacji mieszamy wirus-przeciwciało, zakaża

się nową hodowlę i obserwuje brak zmian

cytoplazmatycznych

– Ważny test odniesienia w stosunku do innych metod
– Zalety

• Duża czułoś
• Duża swoistość

– Wady

• Długotrwałość wykonania

Wirusy – diagnostyka

• Metody hemoaglutynacji, zahamoania

henoaglutynacji i hemadsorpcji

– Oparte na zjawisku zlepiania komórek i hamowania tego

procesu służą do identyfikacji wirusów i przeciwciał

– Wiele wirusów ma zdolność aglutynowania krwinek

czerwonych

• Hemaglutynacja

– Jeśli w komórkach zakażonych występuje wirus, to po

uwolnieniu się do pożywki hodowlanej z zawiesiną

erytrocytów powoduje aglutynację

• Odczyn hamowania hemaglutynacji

– Jeśli w badanej surowicy są przeciwciała dla określonej

hemaglutyniny wirusowej, to po dodaniu odpowiednich

krwinek czerwonych nie dochodzi do aglutynowania

przez wirusy

Wirusy – diagnostyka

• Hemadsorpcja

– Po 3-5 dniach od zakażenia hodowli komórkowej

materiałem diagnostycznym dodaje się zawiesinę

krwinek czerwonych; jeśli wirus jest zdolny do

hemadsorpcji, erytrocyty za pośrednictwem jego

hemaglutynin są absorbowane do powierzchni

komórek

• Kiść winogron

• Metoda zahamowania hemadsorpcji

– Jeśli w surowicy są przeciwciała swoiste dla danego

wirusa, to wprowadzone do hodowli komórkowej

blokują receptory dla krwine komórek zakażonych

wirusami

• Po dodaniu krwinek nie dochodzi do hemadsorpcji

Wirusy – diagnostyka

• Metody biologii molekularnej

– Coraz częściej stosowane

• Łątwe w użyciu

• Bardzo czułe bezpieczne

– Analiza elektroforetyczna genomów wirusowych

pozwala na charakterystykę DNA wirusów, posługując

się określonymi restrykcyjnymi endonukleazami

– Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

• Do wykrywania swoistych dla danego wirusa

sekwencji w komórkach badanego materiału

• Swoistość testu jest wprost proporcjonalna do

długości nici komplementarnej

– Mapowanie peptydów i ustalenie sekwencji

aminokwasów

– Metody PCR

• Zwiększają czułość hybrydyzacj DNA przez

zwielokrotnienie ilości wirusowego DNA zawartego

w próbce pobranej od pacjenta

Wirusy – wykrywanie

• Mikroskopia elektronowa

– Preparaty bezpośrednie

• Testy immunologiczne – wykrywają białka

wirusowe lub przeciwciała

– ELISA

• Hemoaglutynacja (metoda serologiczna)

• Testy biologiczne

– Wykrywają cytopatologiczne efekty (CPE)

działalności wirusów na komórki

– Hodowla w zwierzętach

• Genetyczne

– PCR

– RFLPs

DZIĘKUJĘ !!!