09:47 2013-10-21
Interferencja RNA czyli historia pewnej petunii i robaka noblisty
Proces w który w obecności dcRNA wpływa na ekspresje NRA zawierające go homologiczne
Przez lata błędnie uważano że wprowadzenie do komórki antysensownego RNA poprzez tworzenie hybrydy z mRNA uniemożliwia proces translacji
Ochrona przeciwwirusowa (wiele wirusów zawiera dsRNA jako materiał genetyczny)
Regulacja ekspresji genów
sekwencja microRNA tworzącego strukturę szpilki do włosów (kairpin loop)
Interferencja z mRNA
Enzymy
1Dicer
tnie długołańcuchowe dsRNA
należy do rodziny RNAz klasy III (rozpoznających dsRNA)
aktywny jako dimer, każdy monomer ma 5 domen
2 miejsca aktywne są defektywne
w efekcie postania fragmenty dsRNA o długości 21-23bp (siRNA) u bakterii produktem RNazy III są fragmenty 9-11bp
tnie RNA wirusowe i pre-miRNA
2. RISC
Helikaza zależna od ATP
odpowiada za wyciszanie ekspresji genów
Rdzeń zbudowany z białka argonautę(?)
Domena PAZ
Wiąże koniec 3' jednoniciowego RNA
Domena PIWI
wiąże koniec 5' jednoniciowego RNA
podobna do RNazy H
ssRNA znajduje się pomiędzy domenami PAZ i PIWI
3. miRNP
Budowa jak RISC
zawiera miRNA zamiast siRNA
Etapy degradacji RNA
RNAi
siRNA
miRNA
rasiRNA
dsRNA
pochodzenie
Wirusy
Efekt działania polimerazy RNA RNA zależnej
Hairpin loops - spinka do włosów - mamy geny, które kodują miRNA które nie podlegają translacji, ale transkrypcji tak. Maja dewie sekwencje, po transkrypcji jedno jednoniciowe RNA będzie miało sekwencje komplementarne na swoim drugim końcu, łączy się przypominając splątany sznurek i dzięki komplementarnemu podwójnemu łańcuchowi będzie rozpoznawany przez enzym dyrosza, odcina on pętle i powstaje zwykłe dwuniciowe miRNA, jako struktura krótka tworzy kompleks RISC. Może to wyciszyć ekspresję genu albo ją nasilić.
RNAi działanie
Hydroliza mRNA
represja translacji
Metylacja histonów
Small interfering RNA siRNA
20-25 nukleotydowe fragmenty dsRNA
występujące naturalnie jako produkt działania enzymu Dicer
m
miRNA
występuje naturalnie jako produkt genów
20-25bp
jest transkrybowane z DNA lecz nie podlega translacji
Gen kodujący jest dłuższymi miRNA - zawiera sekwencję mi RNA oraz jej odwrócony fragment
...
Mi-RNA funkcje
\Komplementarna do części sekwencji mRNA fragmentu niekodującego 3'UTR
U zwierząt miRNA zazwyczaj nie jest komplementarne do części kodujących jak u roślin
Związanie miRNA z 3'UTr HAMUJE TRANSLACJE, ALE NIE WPŁWA NA DEGRADACJĘ mRNA
shRNA
short hairpin RNA
Zastosowanie
badania naukowe
wyciszanie genów
medycyna
dostarczamy przy pomocy wirusów
lepsza selektywność niż siRNA
shRNA to syntetyczne RNA tworzone przez człowieka!!
ekspresja siRNA
przejściowa -dsRNA dostarczane do komórki
Stabilna - użycie wektora DNA do produkcji shRNA
Jako wektor
-plazmidy
-retrowirusy
-adenowirusa
-inne?
siRNA - dostarczanie
hodowla komórkowa
in vivo
micele lipidowe
koniugaty
bakteryjnym fagami RNA
cholesterolem
Ateokolagenem
Kłady wirusowe (retrowirusy)
10:09 2013-10-21
Modyfikacje posttranslacyjna białek
Czyli jak zwiększyć różnorodność
Białka-modyfikacje
Zwiększają zmienność białek
zmieniają funkcję białek
aktywacja białek
lokalizacja białek
interakcje białko-białko białko-kwas nukleinowy, białko-lipidy białko0kofaktory
"Dalej napierdala. On chyba kręci z Wyżłem, a ten napierdalał Pokorze a ten nam robił z dupy jesień średniowiecza. Kurwa mać ile można srać o białkach."
Ponad 200 różnych modyfikacji
Większość to modyfikacje enzymatyczne
około 5% białek jest zaangażowanych w modyfikację innych białek
kinazy
fosfatazy
transferazy
ligazy
hydrolazy
Białka podlegają modyfikacją na każdym etapie istnienia
to samo biało może podlegać różnym modyfikacją
dojrzewanie białka
aktywacja białka
hydroliza białka
W wyniku degradacji elastyny tworzą się peptydy elastynopochodne, co powoduje przyciąganie do tego miejsca komórki układu immunologicznego co wspiera gojenie się rany
Typy modyfikacji
Fosforylacja-defos
ograniczona proteoliza
ubikwitynacja
metylacja
acetylacja
modyfikacje lipidowe
Glikolizacja
Nitrozylacja
Hydroksylacja
gamma-karboksylacja
deaminacja
Modyfikacje odwracalne
fosforylacja
defosforylacja
modyfikacje lipidowe (niektóre)
Modyfikacje nieodwracalne
ograniczona proteoliza
ubikitynacja
hydroksylacja
gamma-karboksylacja
Fosforylacja
Modyfikacja odwracalna
szybka (milisekundy)
enzymatyczna
kinazy serynowo0treoninowe
kinazy tyrozynowe
przekaźnictwo sygnału
Regulacja wzrostu i podziałów komórek
Kinazy
fosforylacji ulegają grupy -OH
seryny
treoniny
tyrozyny
Kinazy serynowo-treoninowe
PKA, PKC, PKG, Kinazy aktywowane mitogenami MAPK kinazy aktywowanie jonami wapnia i kalmoduliną Kinaza Akt kinaza CDK
Kinazy tyrozynowe
Knazy receptorów katalitycznych
znajdują się w błonie komórkowej dla czynników wzrostu GF
Kinazy cytozolowe
Produkty protoonkogenów (src, vsrc (wirusowe), abl)
Białka DEFOSFORYLACJA
Fosfatazy
hydrolityczne odszczepienie reszty fosforanowej
proces szybki
wiele typów fosforylaz białkowo specyficznych
Aktywacja fosforylaz przez insulinę
Glikolizacja
zawsze enzymatyczna
Glikacja - nieenzymatyczne przyłączenie glukozy
temperatura stężenie glukozy, czas kontaktu
Oznaczanie cukrzycy (glikowana hemoglobina i inne białka - im wyższe stężenie glikowanej hemoglobiny to zna znaczy że jest wyższa glikemia to znaczy ze choroba i jej skutki)
Glikolizacja c.d.
Najbardziej skomplikowana modyfikacja
Kontrola zwijania białka
Bez szablonu przenoszenia reszt cukrowych - każda reszta przenoszona w inny sposób
Transport biała np. do aparatu Golgiego - przyłączenie mannozy!
Ligandy dla receptorów
Regulacja interakcji białko -białko
Zwiększenie rozpuszczalności
Podział glikolizacji od:
miejsce połączenia glikanu
struktura glikanu
skład glikanu (reszty cukrowej białka :P)
wielkość glikanu
Profil glikolizacji jest zmienny
Nie ma szablonu na którym zachodzi
zleży od ekspresji enzymów odpowiedzialnych za glikolizację
Duża zmienność między KOMÓRKAMI - możne być to marker nowotworowy
Olbrzymia zmienność białek
Typ:
N-Glikozylacja (asparagina
O
C
Fosfo
Glipiacja - przyłącznie fosfolipidu przez glikan i linker z fosfoetandoloaminy
Nitrozylacja
Przyłącznie do reszty tiolowych cysteiny tlenku azotu
utworzenie S-nitrozotioli
Szybka redukcja nitrozotioli przez GHS i tiioredoksynę
Proces specyficzny
Mahazynowanie nitrozylowanych białek, np. kaspaz (nieaktywne)
po uwalnianie do cytoplazmy denitrozylacja o wiąże się z aktywacją
Inicjacja apoptozy
Metylacja
Przyłącznie reszty metylowych
N-metylacja
O-metylacja
Zwiększa hydrofobowość białka
Neutralizuje dodatnie ładunek
Podlegają jej:
Histydyna
Arginina
...
Przyłącznie reszt metylowych
mechanizm regulacji epigenetycznej
metylacja histonów
dawcą grup metylowych jest s-adeozylometionina (SAM)
Arginina może ulegać symetrycznej metylacji, powstaje dimetyloarginina, może powstawać asymetrycznej metylacji powstaje ADMA (powstaje też z rozpadu białek metylowanych), można go wydalić z moczem, ale jak to niemożliwe to działa on silnie toksycznie b jest inhibitorem tlenku azotu NO! Powoduje miażdżycę tętnic!
deaminacja
Deaminacja arginacji
powstaje cytrulina
nieodwracalna?
Histony
Regulacja ekspresji genów (m.in. p54, receptorów estrogenowych)
Powstawanie cytrulinowanych peptydów
lega jej arginina i metyloarginina
Inne białka
p53!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! koło kurwa
Cytrulinowane białka i peptydy
Powstają pod wpływem PAD
indukcja przez zapalenie
Modyfikacja różnych białek macierzy
Intensywna cytrulinizacja w RZS
Przeciwciała anty-CCP
markery diagnostyczne - zwłaszcza reumatoidalnego zapalenia stawów.
Bardziej specyficzne niż RF
Czynnik prognostyczny
Deaminacja oksydacyjna
Lizyna
deaminacja oksydacyjne do allizyny
tworzenie wiązań pomiędzy cząsteczkami:
tropoelastyny
tropokolagenu
N-acetylacja
Acetylacja kotranslacyjna która zachodzi z translacją, znaczanie nieznani
Acetylacja reszt epsilon-aminowych lizyny
głównie białek histonowych
HAT o9 HDAC - regulacja ekspresji genów
Znaczenie procesu...
Modyfikacje lipidowe
Znakowanie białek transportowanych do organelli (ER, aparatu Golgiego, mitochondriów, lizosomów, endosomów, błony komórkowej
Zmiana właściwości biała (wzrost litofilności)
Kotwiczenie białek.
Typy:
s - prenulacja
S - mitystovylacja
S- palmocylacja
N-końcowa myry
Pisałem na przestawionej klawiaturze, przy poprawianiu sam nie byłem pewny do końca co jak miało być. ODSYŁAM DO ZDJEĆ WOJCIECHA BOGUSZA wrzuconych na FB!)
S-prenulacja
Podlegają jej wybrane reszty cysteinowe
Białka precyzowane mają na C-końcu specjalny motyw
Przyłącznie reszty C15 lub C20
Proces katalizowany przez transferazy FT i GGT
Kotwiczenie białek w błonach
S + Palmocylacja
Przyłączenie reszt kwasowych palmoilowego do reszty PAT, odwracalna
S+Mirzstzlacji C14
odwracalny
Ograniczona proteoliza
Wstępuje tysiące różnych proteaz
Proces nieodwracalna zawsze
zachodzi w proteosomach i liposomach ale może też w cytoplazmie
Rozpoznaje różne sekwencje aminokwasów,
Aminopopetydazy o karboksypeptydazy
Podział proteaz
.
.
..
Udział w biosyntezie białek