Na DNA na który chcemy klonować działamy

Powstają lepkie końce, tym samym enzymem restrykcyjnym działamy na wektor, powstają identyczne lepkie końce, łatwo wiec łączyć i replikować, łaczymy za pomocą ligazy ...

OPIS RYSUNKU:

Takim samym enzymem restrykcyjnym działamy na DNA, z którego chcemy wyizolować odpowiedni fragment(może być to DNA ssaka) oraz na wektor za pomocą którego będziemy wprowadzaćobcy DNA do organizmu (bakteryjnego dna?)

Zarówno w izolowanym DNA i w wektrorze, po zadziałaniu enzymem restrykcyjnym powstają takie same lepkie końce, które łączymy następnie za pomocą ligazy na zasadzie komplementarności, powstaje zrekombinowany plazmid

Ten plazmin transpformujemy do organizmu bakteryjnego, nastepnie namnażamy bakterie, identyfikujemy szczepy zawierajace zrekombinowany plazmid i z nich izolujeme interesujący nas fragment DNA.

oprócz klasycznej metody klonowania możemy również użyć metody z zastosowaniem syntezy enzymatycznej na matrycy DNA, wykorzystując enzym, odwrotną transkryptazę. Trzymujemy wówczas cDNA, czyli komplementarny DNA, w którym zawarta jest(przepisywanie z RNA na DNA), w którym zawarta jest informacja dla syntezy określonego białka. Takie podejście do klonowania podyktowane jest trudnościami, w uzyskiwaniu ekspresji genów eukariotycznych w komórkach prokariotycznych. Sytuacja ta związana jest z obecnością intronów w eukariotycznym DNA.

W celu uniknięcia klonowania intronów, stosuje się właśnie cDNA, który jest syntetyzowany na matrycy dojrzałego mRNA(ma tylko egzony). Produkcja białka w takiej sytuacji, będzie uzależniona jedynie od obecności w wektorze, sekwencji regulacyjnych do ekspresji interesujacego nas fragmentu DNA(genu/genów w)

W przypadku do jego identyfikacji
chuchuchuchuj

Metody hybrydyzacji polegają na tworzeniu struktur dwuniciowych z cząsteczek posiadajacych komplementarne sekwencje nukleotydowe. Do wykrywania poszukiwanego fragmentu DNA stosuje się tzw. Sondy molekularne, taką sondą moze być wyznakowany, np. Radioaktywnie fragment RNA bądź jednoniciowego DNA, oczywiście o sekwencji komplementarnej o jednej z nici poszukiwanego genu. Zamiast znakowanie radioaktywnego mozemy to brać przeciwciaa

następnie po hybrydyzacji stosuje się odpowiednie techniki identyfikacji tych poszukiwanych fragmentów i moze byc to technika blotingu(tzw. Przenoszenie plam – rysunek), metody sołterma – stosowana jest w diagnozowaniu chorób genetycznych(na rysunku)
westernbloking stosowany jest w analizie białek

Techniki hybrydyzacji znalazły zastosowanie w wielu dziedzinach biotechnologii, m.in. w analizie DNA.
Niestety ta technika jest czaso i chłonna ale udało sie niedawno opracować, tzw. Technologię mikromacierzy DNA opartą na tzw. Mikro chipach, która umożliwia badanie sekwencji kwasów nukleinowych, w bardzo krótkim czasie, jest to dość nowa metoda(1996 rok pierwsze mikromacierze). Podczas jednego eksperymentu można przebadać tysiace genów

Mikrochip jest zwykle szklaną lub silikonowa płytką o małej powierzchni(mniej więcej 2-3cm^2) z którą związano dużą liczbę oligonukleotydów, czyli fragmentów DNA, które słyużą, do równoległych badań hybrydyzacyjnych.

Analizowane fragmenty kwasów nukleinowych, najczęsciej znakuje się fluorescencyjnie(emisja określonego promieniowania przy okreslonej ilosci fali, wzbudza się taką płytkę falami określonymi)

Te fragmenty DNA, które uległy hybrydyzacji obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym(lub maszyny to robiące za nas)

Fluorescencja wskazuje na te fragmenty DNA< które uległy hybrydyzacji, czyl;i sa obecnego w analizowaniu przez nas DNA

Zastosowaniem tej metody, jest analýza profilii ekspresji genów, która polegała na określleniu ilości rodzajów mRNA w badanej tkance, okreslenie tych rodzajów mDNA pozwala określić rodzaj i ilość białek uczestniczącyh w różnych procesach metabolicznych, wyniki z zastosowaniem tej metody pozwalają na określenie stanu molekularno-metabolicznergo komórki, co ma niezwykle istotne znaczenie w diagnostyce i weterynaryjnej i medycznej.

W 2003 roku opracowano chip, na którym zapisano aktywność wszystkich genów znajdujacyh się w ludzkiej tkance(genom człowieka w 200 roku określnony został) ta sytuacja pozwala na ustalenie które geny(w każdej komórce mamy pełną pulę DNA) są aktualnie transkrybowane i mogą uleć ekspresji, oczywiscie badania robi się w komórkach fizjo i patologicznych.

Ocebnie wykonuje się już mikromacierze białek, które pozwalają na określenie ich rodzaju, ilosci i oddziaływania pomiedzy sobą. Oparte są te oddziaływania przede wszystkim na reakcjach antygen-przeciwciało (przeciwciało monoklonalne, a anntygen to białko)

Kilka zdań na temat zasatowania. ZDJĘCIE!

ZDJĘCIA!

Możemy? Coś tak nieśmiało mówicie nie

Balice – instytut zootechniki – świnie transgeniczne, serce ludzkie.

OPUSZCZONY SLAJD KURWAAAAAAAAA ;<<<<<<<<<<<<<<<

W 2001 roku odczytano ludzki genom i stwierdzono, że zawiera on około 30-40 tysięcy genów, jeszcze wieksze wywołało to, że małe rośliny kwaitoe zawierają prawie 30 tysiecy genów(niby tyle co złowiek a inteligencji brak) okazuje się, ze nie liczba genów, a stopień ich organizacji decyduje o tym jaką funkcję będą pełnić białka.

Wiele spośród białek ssaków, w tym człowiekposiada bardzo złożoną architekturę i w ich syntezę, zaangażowana jest wieksza liczba genów.

Analiza trankryptomiki

W każdej komórce wieloomórkowego organizmu, znajduje się kompletny genom(czyli wszystkie jego geny), jednak zestawy genów, które są odczytywane(ulegaja transkrycpcji) w poszczególnych tkankach czy komórkach, są inne.

Zestawy te nazywamy profilami transkrypcyjnymi EGZAMIN KURWAAAAAAA!

Różnice między nimi wynikamją nie tylko z rodzaju tkanki lub komórki, ale takže z etapu rozwoju(inne profile u młodszy a u starzych inne, inna ekspresja)

Np. U człowieka profil tranksrypcji danej tkanki jest odmienny w embriogenezie(stadium płudu), u noworodka cyz dorosłego.

Zmiany w tych profilach wywołują również czynniki zewnętrzny, np. Stres, choroba.(inny, na egzamin, inny na imprezie).

Można powiedzieć, że organizm jest suma bardzo wielu różnych profili transkrypcyjnych swego genomu.

Pojedynczy profil określa się stanem tranksypcyjnym komórki.

Odpowiada mu zestaw tranksryptów, czyli różnych mRNA, który rówież określami jako program tranksrypcyjny.

Odczytywanie tranksryptonu jest o wiele trudniejsze niż odczytywanie genomu(genomu – stały dna, mikromacierze, a transkrypton w danej chwili jest taki, jutro inny, bo transkrypcja danych białek, fragmentu, zapotrzebowanie na białka – takie produkuje, ale lepiej się rozpoznaje stany patofizjologczne).

Tranksrypton DAROWANY

Proteon – analýza

Aktywność transkrypcyjna genów czyli wytwarzanie cząsteczek odpowiednich mRNA, ma kluczowe znaczenie dla określenia cech morfoligicznych i fizjologicznych komórki. Świadczy o tym to, że systém kontroli aparatu transkrypcyjnego jest jednym z najbardziej skomplikowanych systemów molekularnych w przyrodzie, tym bardziej że wytworzenie transkryptów to nie wszystko, aby wywżeć jakikolkwiek wpłuw na losy tej komórki, transkrypty musza być przetłumaczone na białka. Pojawienie się określonego transkryptu w komórce, nie oznacza, że będzie on w całosci i natychmiast wykorzystywany do syntezy białka. W cząsteczce mRNAzawartych jest wiele skomplikowanych motywów strukturálních, które odbieraja sygnały o stanie komórki. `w zależności od wypadkowej tych sygnałów dany mRNA moze być wykorzystany do syntezy bardzo wielu albo tylko jednej kopii kodowanego przez siebie białka, ale może być ten mRNA zniszczony i to wsio zalezy od stanu fizjologicznego komórki, aby dowiedzieć się jaki jest końcowy efekt konkretnego stanu transkrypcyjnego komórki musimy poznać wszystkie zawarte w niej białka.

U człowieka około miliona różnych białek(to nie jest tak, że gen białko, bo genów 30 tysięcy)

Profil wszystkich białek nosi nazwę Proteonu, jest on jeszcze bardziej skomplikowanych/zróżnicowana niż transkrypton, dlatego że cząsteczki białek już po syntezie ulegają różnorodnym modyfikacjom chemicznym, czyli sa to zmiany potranslaycjne i te modyfikacja ni esa po to żeby być, ale żeby białka mogły pełnić swoją funkcję, dlatego też transkrypton jest zaangażowanych nie tylko w syntezę białek, ale tez substancji regulacyjnych tych enzymów, które powoduja ich modyfikacje, fosforylacja, glikozylacje, acetylacje, metylacje, dołaczenie części lipidowych, metali itd. Itd.

Modyfikacje sa główną przyczyna tego, ze liczba różnych rodzajów białek wielokrotnie przewyższa liczbę genów(1 gen -> 1 białko, ale białko ulega modyfikacjom, stąd ich w chuuuuj!)