EKSPRECJA GENÓW U EUCARIOTA jest procesem bardziej skomplikowanym niż u procariota i związane jest to przede wszystkim od różnic w budowie w DNA, jak wiadomo w u eucariota są kodujące i niekodujące introny i egzony, jeżeli chodzi o ilość DNA u człowieka jest około 1000 razy więcej aniżeli u bakterii, z drugiej strony u organizmów eucariotycznych zbudowanych z wielu komórek(człowiek 100 bilionów) niewszystkie istniejace geny musza być w tym samym czasie czynne – aktywne. Ich aktywacja związana jest z przyłączaniem do określonych struktur DNA, przede wszystkim białek, one pełnią funkcje regulatorowe. Istotną rolę w regulacji ekspresji genów pełnią histony, przynajmniej jeden z nich moze indukować transkrypcję(inicjację transkrypcji). Ekspresja genów u eucariota jest kontrolowana podobnie jak u procariota na poziomie transkrypcji, ale również na poziomie translacji. Kontrola ta(regulacja procesu) polega przede wszystkim na kombitoryjnym przyłączaniu różnego rodzaju białek(?). Aktywatory transkrypcji posiadają dwa główne rejony. Pierwszy rejon, to domena wiążąca się z DNA, która rozpoznaje określoną sekwencję na DNA i domena aktywująca(aktywacyjna), która pomaga w składaniu się kompleksu transkrypcyjnego przy kasecie TATA. Stwierdzono jednocześnie, że transkrypcją mogą regulować białka wiążące się z określonymi sekwencjami DNA oddalonymi od kasety TATA nawet o kilka tysięcy par zasad.

Dzieje się tak, dlatego, że...

DNA jest cząteczką elastyczną, która może tworzyć pętle. Pamiętać należy, że białka regulatorowe, które wiążą się z DNA, musza charakteryzować się dużym powinowactwem do tej struktury. Najlepiej poznane są trzy motywy wystepujące w takich białkach.

Są to:
palec cynkowy
motyw helix zwrot helix

Suwak leucynowy

W niektórych aktywatorach znajduje się wielokrotny motyw palca cynkowego(czyli w aktywatorach mamy białka).

Palce cynkowe to pętle utworzone z fragmentów łańcucha polipeptydowego, które utrzymywane są przez jon cynkowy. Taka struktura umożliwia wciskania się białka w motyw podwójnej spirali DNA, w rowek tej spirali podwójnej DNA. Dzięki związaniu się takiego białka z palcami cynkowymi ze specyficzną parą zasad mozliwy jest kontakt czynnika transkrypcyjnego z genem docelowym.

Okazuje się, że u człowieka z palcami cynkowymi współdziała conajmniej 10% DNA(to jest bardzo dużo).

Wykazano, że niektóre białka regulatorowe wiążą sie nie bezpośrednio z DNA, ale z innymi białkami, wywołując efekt na ekspresję okreslonego genu.

Cechą charakterystyczną białek suwaka leucynowego, jest to, że zawierają one w co siódmej pozycji leucynę w obrębie 35 aminokwasów łańcucha polipeptydowego. Białka takie podobnie jak motyw helix-zwrot helix. Tworza dimer złożone z dwóch skręconych ze sobą łańcuchów o strukturze super helisy.

W przypadku helix-zwrto helix białka znajdują coś tam i łączą sekwencję.

Sekwencje suwaka leucynowego posiada jeszcze rejon zasadowy(około 30 aminokwasów), który służy(to na CZarno NA ZDJĘCIU), JAKO REJON wiążący się z DNA.

Pamiętać nalezy w odróżnieniu od procariota transkrypcja genów u eucariota przebiega rzy udziale 3 głównych polimeraz, które wymagają do zainicjowania swej funcji obecności różnych czynników białkowych.

Istotną rolę w regulacji genów u eucariota, pełnią hormony, które najczęściej syntetyzowane są w jednych komórkach, a funkcje swą pełnią w innych.

Hormony białkowe spełniaja swą funkcję w regulacji ekspresji genów przez swój wpływ na czynniki transkrypcyjne(nie bezpośrednio hormon wpływa na transkrypcję, ale na białka które będą regulować tranksrypcję). Hormony stereidowe posiadają łatwośc przenikania przez błony bilogiczne ze względu na swa budowę(są to substancję niskocząsteczkowe), po wniknięciu do jądra bądź cytoplazmy, mogą łączyć się z odpowiednimi recepturami, a w dalszych etapách z odpowiednimi sekwencjami DNA(i to są te sekwencje hre, odpowiedzi hormonalnej).

Hormony, których wktórnych przekaźnikiem jest cykliczny AMP hormony... i bialkowe, aktywują transkrypcję poprzez kinazę białkową A.
Kinaza jest fosfotransferazą, należy do drugiej kasy enzymów – transferaz i przenosi reszty ortofosforanowa z jednego związku na drugi(fosoryluje substráty za pomocą reszty PO4).

Promotory genów wrażliwych na tą kinazę posiadają element DNA, tzw. Element cre, który w odpowiedzi na wysokie stężenie cyklicznego AMP, wiąże się z odpowiednim białkiem aktywującym transkrypcję.

CRE wiąże sie z białkiem wiążącym sie do CRE i powstaje CREB. Ten CREB pod wpływem kinazy A ulega fosforylacji i wiąże kolejne białko CBP(wsio dzieje się w jądrze) CBP – białko wiążące CREB i taki kompleks(ufosforyzowany CREB - chyba?) aktywuje transkrypcję.

Możemy dalej?

Okazuje się, że u człowieka około 95-98% DNA nie koduje białek. Powstaje pytanie jaka jest rola tych ponad 90% DNA, z niekodującego DNA powstaje bardzo aktywny RNA, który spełnia swą rolę jako regulator aktywności innych genów. Wiele sekwencji intronowych jest usuwanych z pierwotnego transkryptu. W częsci z tych transkryptów zawarte są akrtywne czynniki, tzw. Mikro RNA które reguluja aktywnoność określonych genów i tak: temat...
niskocząsteczkowe kwasy RNA, pierwszy z nich SI RNA, są to dwuniciowe cząsteczki o długości 20-25 par zasad, które powodują CZASOWNIK o homologicznej sekwencji, dlatego powstaje interferujący? Powstje to siRNA ppprzez pocięcie RNA, naprzykład dwuniciowego RNA przez enzym dajser na fragmenty o odpowiendiej długości. Ten dajser jest wielo-CHUJOWĄ(domenowa chyba) Nukleazą i należy do rodziny tzw. RNAz 3. Mechanizm działania:

Krótkie Si RNA wiążąm sie z komplexem białkowym o aktywnosci rybonukleazy, ten kompleks zwany jest RISC, zbudowany jest z białek enzymatycznych i RNA i ten kompelks dopiero bierze udział w wyciszaniu ekspresji genu w procesie interferencji RNA.

Szczegółowo.

Kompleks ten risk wiaże się z komplementarną do sicząsteczną mRNA i tnie ją na kawąłki uniemożliwiając w ten sposób powstanie kodowane przez ten odcinek mRNA białka. Sekwencja si-RNA jest najczęściej w 100% homologiczna z sekwencją mRNA.

Rośliny i inne organizmy eucariotyczne wykorzystują mechanizm interferencji RNA (jakiś wyraz był jezcze/nie był – CHUUUUJ) powodowane przez SI RNA do obrony przed wirusami. Teraz jest możliwa syntéza inwitro RNA.

Mikro DNA

Sa to jednonicziowe cząsteczki jaki SI o długości 21-23 nukleotydy, które wpływają równiez na regulację ekspresji genów. Prekursorem miRNA są niewielkie RNA o strukturze spinki do włosów, które pdlegają podobnej obróbce jak Si-RNA. MI rna wchodzą w skład kompleksów rybonukeloproteinowych, blokujacych specyficznie translację mRNA. Nie posiadają 100% homologii z docelowym odcinkiem mRNA, zaangażowane są przede wszystkim w negatywną regulację ekspresji genów, podczas rozwoju. Przypuszcza się, że regulują aktywność około 30% ludzkich genów.

W 2012 roku odkryto piRNA o długości 24-30 nukleotydów, które występują w komórkach rozrodczych(plemnikach). Powstają one bez udziała rnazay ajzer i tworza kompelksy z tzw. PiVi. Zakłada się, że powstaja z długich jednoniciowych RNA kodowanych w genomie przez sekwencje powtarzajace się. PiRNA biorą udział w wyciszaniu ekspresji ruchomych elementów genomu, ale również utrzymują integralnośc genomu komórek płciowych. Zakłucenia szlaku syntezy piRNA oraz mutacje genów odpowiedzialnych za syntezę białek pivi powodują aktywację transfozomów(ruchome elementy DNA) i skutkiem tego są liczne defekty genetyczne.

Podsumowując należy stwierdzić kodony kodujace białka nie stanowia jedynej informacji, z której korzysta komótka, oprócz około 30 tysiecy genów kodujące białka u ssaków, niezwykle istotne znaczenie ma niekodujacy DNA. Ale równiez histony, ich chemiczne modyfikacje oraz stan chromatyny jądrowej. Ilość genów kodujących białka u poszczególnych organizmów wydaje się mieć znaczenie drugorzedowe(nie ważne jest wiecej genyów, to ten organizm będzie na wyższym poziomie rozwouju) istotną rolę mają oddziaływania miedzy sobą różnych genów i ich produktów. Klasyczny przykład – nicień posiada 19 tysiecych genów kodujących, a człowiek 30 tysiecy.

REKOMBINACJA DNA IN VITRO.

Rekombinacja polega na wymianie odcinków miedzy cząsteczkami odpowiadajacymi sobie rejonami DNA i może zachodzić np. Pomiedzy cząsteczkami 2 chromosomów homologicznych, który każdy pochodzi od jednego z rodziców. Rekombinacja jest podstatowowym narzedziem wymiany genów miedzy chromosomami, co zwiększa różnorodnośc komórek. Z kolei przenoszenie genów miedzy komůrkami umożliwiają wiusy poprzez rekombinację materiału chromosomowego i wirusowego.

ZDJĘCIE ZDJECIE ZDJECIE ZDJECIE!!!11!!!111ONEONE!!111

Możemy dalej?

ZDJĘCIE ZDJECIE ZJECIE!!!11!!!!11ONEONE!(wirusy u których następuje odwrócenie...)

ZDJĘCIE ZDJĘCIE ZDJĘCIE ZDJĘCIE!!!11!!!1!!!ONEONE!(Technologią rekombinacji in vitroi jej podstawowe narzędzia)

ZDJĘCIE ZDJECIE ZDJECIE ZDJĘCIE!!!111!!!oneone!!11!!(enzymy restrykcyjne)

A jeżeli chodzi o zastosowanie tych

za pomoca tych enzymów wycinane są odpowiednie fragmenty DNA, np. Z genomu ludzkiego, czyli geny które posidają informację dla syntezy białka, które chcemy produkować poza organizmem człowieka. Takim enzymem restrykcyjnym działamy na wyizolowane DNA, wiemy na jakiej sekwencji zostanie DAN przecięte i na takim samym działania na chujjj wektora.... za pomoca którego będzie transforowac wyizolowany odcinek DNA np. Do komórek bakteryjnych w celu wywołania ekspresji. Skutkiem działania enzymów restrykcyjnych jest uzyskanie genów(czy fragmentów DNA), które na swojich końcach zarówno 3‘ i 5‘, zawieraja tempe lub lepkie końce. W rekombinacje zastosowanie posiadają jedne i drugie, ale głównie te lepkie końce. NA czym to polega.

ZDJECIE ZDJECIE ZDJĘCIE ZDJĘCIE!!11!!!1ONEONE!1!!!!(Sposób działania endonukleaz restrykcyjnych).

Enzyn ligaza faga T4 służy do połaączeni dwóch róznych odcinków DNA – izolowanego i wektorowego pod warunkiem, ze maja takie same lepkie końce.

ZDJECIE ZDJECIE ZDJĘCIE ZDJĘCIE!!11!!!1ONEONE!!!(ligaza faga t4)

ZDJĘCIE ZDJĘCIE ZDJĘCIE ZDJĘCIE!!111!!!ONEONE!!! polimeraza Taq

ZA POMOCA WEKTORÓW wprowadzamy interesujacy nas DNA, których chcemy sklonować do komórek bakteryjnych, ale nie tylko(do protoplastów komórek roślinnych). We ktory sa albo plazmidami, albo bakteriofagami.

Wyróżniamy 3 rodzaje wektorów
Bakteryjne – małe koliste cząsteczki DNA, których naturalną funkcją jest nadawanie komórce gospodarza odporności na antybiotyki

Plazmidy posiadają wiele właściwości, które są niezwykle przydatne do kontrkcji, tzw. Wektorów klonujaych, czyli takich do których możemy przyłączyć obcy DNA. Istnieją one jako pojedyncze bądź liczne kopie w obrębie bakterii i replikują niezależnie od bakteryjnego DNA(replikazaja musi być neizalezna, co za tym idzie transkrypcja i translacja) Są one mniejsze niż chromosoma bakteryjny, dziekic zemu jest łatwo je od niego dodzielić. Z kolei fagi zawierają cząsteczki liniowego DNA, do którego moze byc włączony obcy DNA. Fagi posiadają wiecej miejsc włącznia obcego DNA.

Trzecia grupa – kosmidy – nie pochodza z kosmosu. Połączenie plazmidu z fagiem, wybiera najlepsze cechy pazmindów i fagów!!!
Kazdy wektro – niezaleznie czym jest(plazmid, kosmid, czy fag) musi posidać markery selekcyjne.W obręb których zawsze wprowadzamy obcy DNA. Musi być znana równiez mapa restrykcyjna takiego wektora, tzwn. Mapa restrykcyjna jest to znajomość miejsc czyli sekwencji nukleotydowych, które zostana przecięte przez określony enzym restruykcyjny(musimy wiedziec w którym miejsce wektora wprowadzamy).

zdjęcie zdjecie zdjecie zdjecie!!!1!!!111oneone!!(Plazmid pBR322 – pierwszy odnaleziony chuj)