Powtórzenie do kolosa z laborek z zeszłego roku

1. 1.       Pobranie materiału

• W trakcie operacji, lub świeżo po śmierci. Całe obiekty np. kom. Jajowe.

1. 2.       Utrwalanie

• Zatrzymanie zmian pośmiertnych i zachowanie struktury komórkowej.

• Różne tempo przenikania skrawków przez poszczególne płyny; rozpuszczanie i przemieszczanie substancji w komórce. ODPOWIEDNI DOBÓR UTRWALACZA.

• Kurczenie lub pęcznienie preparatów.

  • Kwasy mineralne i organiczne:

    • Kw. Chromowy, osmowy, azotowy, octowy lodowaty, trójchlorooctowy i pikrynowy

    • Substancje organiczne:

      • Aceton

      • Etanol

      • Metanol

      • Formalina

      • Sole metali ciężkich

        • Azotan srebra

        • Dwuchromian potasu

        • Sublimat HgCl2 i inne.

  • Inne sposoby to mrożenie skrawków w ciekłym azocie lub zamrażanie i odwadnianie w próżni.

  • PŁYNY UTRWALAJĄCE:

    • Płyn Carnoya

      • Zalety:

¨       Wszystkie barwniki

¨       Kwas octowy utrwala jądro

¨       Zmniejsza kruchość tkanek

• Minusy:

¨       Rozpuszcza tłuszcze i lipidy

¨       Nie można wykrywać organelli

• Skład: alkohol absolutny, chloroform, kw. Octowy lodowaty.

• Formalina

  • Zalety:

¨       Ścina białko, szybko przenika

¨       Zachowuje tłuszcze i lipidy

¨       Mało zmienia strukturę kom.

¨       Można użyć też innych utrwalaczy

¨       Długie przechowywanie

• Wady:

¨       Pęcznienie tk. łącznej

¨       Po długim utrwalaniu wytrącanie aldehydów, trudniejsze barwienie jądra.

¨       Złogi przypominające pigment, gdy dużo krwinek

¨       Szkodliwe dla zdrowia

¨       Rozpuszcza glikogen, kw. Moczowy, Fe, Ca.

• Stosuje się 4% roztwór lub formalinę zobojętnioną.

• Odwadnianie w alkoholach, ksylen z parafiną, parafina półtwarda – z woskiem – normalna – bloczki.

• Płyn Ciaccio

  • W składzie formalina i dwuchromian potasu – nie rozpuszcza tłuszczy i lipidów.

  • Płyn Boeina

    • Zalety:

¨       Dobrze przenika małe i duże skrawki

¨       W miarę dobrze utrwala struktury

¨       Prawie wszystkie barwniki

¨       Częściowo odwadnia.

• Wady:

¨       Pęcznienie tk. łącznej

¨       Źle konserwuje narządy krwiotwórcze.

• Skład: kw. Pikrynowy, formalina, kw. Octowy lodowaty

• Aldehyd glutarowy

  • Do mikroskopii elektronowej

1. 3.       Płukanie po utrwaleniu (usuniecie utrwalacza)

• Jeżeli w składzie utrwalacza nie ma alkoholu – woda

  • FORMALINA

  • SUBLIMAT

  • KW. CHROMOWY I OCTOWY

  • Jeżeli był alkohol – kolejne alkohole o wyższym stężeniu, niż ten w utrwalaczu

    • ALKOHOL

    • KW. PIKRYNOWY

    • ZŁOŻONE MIESZANINY NP. PŁYN BOUINA

1. 4.       Odwadnianie (alkohole o rosnącym stężeniu)

• Alkohole o wzrastającym stężeniu. Czas odwadniania zależny od grubości skrawka i użytego utrwalacza.

1. 5.       Płyny pośrednie

• Prześwietlenie w ksylenie; pozbycie się resztek alkoholu

1. 6.       Zatapianie w parafinie

• Najczęściej parafina. Szybko, daje się kroić na cienkie skrawki. Minus – działanie wysokimi temperaturami na skrawki.

  • Mieszanina parafiny z ksylenem 1:1. Parafina rozpuszcza się, penetruje tkanki.

  • Do parafiny o niższej temp. Topnienia lub do normalnej (58-59)

  • Formowanie bloczka. Bloczki porcelanowe lub metalowe. Zalanie preparatu parafiną. Studzenie w kąpieli lub na płycie chłodzącej.

  • Żywice metakrylowe lub akrylowe.

1. 7.       Krojenie na mikrotomie

• Próby 5-6nm

• Materiał wycięty z bloczka i przyklejony do kostki. Cięcie.

• Szkiełko podstawowe czyste i odtłuszczone, pokryte białkiem i wodą. Zapełnione szkiełko na stolik grzewczy – rozprostowanie preparatów. Do cieplarki (37) – wysuszenie. Do pudełek.

• Zamrożone na kriostacie. Szkiełka polilizynowe.

1. 8.       Odparafinowanie i uwodnienie do barwienia

• Do ksylenu (rozpuszczenie parafiny)

• Uwodnienie – szereg alkoholi o malejącym stężeniu. Na koniec do wody.

1. 9.       Barwienie

• Substancje w zależności o potrzeb:

  • Nitrowe

  • Azowe

  • Pochodne trójfenylometanu

  • Pochodne ksantenu

  • Pochodne akrydyny

  • Barwniki:

    • Zasadowe – jądra, zasadowe subst. Cytoplazmatyczne (ergastoplazma)

      • Błękit toluidyny, zieleń metylowa, czerwień jądrowa, fuksyna zasadowa, hematoksynina (niebieski/fiolet)

      • Kwaśne – cytoplazma

        • Eozyna (Różowy), kwas pikrynowy, zieleń świetlna, czerwień Konga

      • Obojętne – lipidy

        • Sudany (czarny, III), czerwień oleista

  • Sposoby: pojedyncze lub złożone.

  • METODY BARWIENIA:

    • Hematoksynina (fiolet) i eozyna (róż) (H/E) – jądro, cytoplazma i wakuole

    • AB/PAS

      • Błękit alcjanu (?) – od odczynu: pH 2,5 – turkus, pH 0,5 – granat. -> śluzowce

      • PAS – kwas nadjodowy – jod wybarwia glikogen na Magenta, śluzowce i obojętne

      • Kw. Pikrynowy – cytoplazmę

      • VAN GIESONA (włókna tkanki łącznej)

        • Jądra – czarno-brunatne

        • Cytoplazma – żółto-zielona lub żółta

        • Włókna kolagenowe – czerwone

        • Sprężyste – żółte

        • Mięśnie – żółto-brunatne

      • MGG – rozmazy krwi i szpiku

        • Erytrocyty – różowe

        • Jądra leukocytów - czerwono-fioletowe

        • Cytoplazma limfocytów – błękit

        • Cytoplazma monocytów – szaroniebieska

        • Cyt. Leukocytów - różowa

1. 10.   Wykończenie

• Odwodnienie, prześwietlenie w ksylenie. 

• Płyny konserwujące (chroni przed wysychaniem, przezroczysty, nie odbarwia)

  • BALSAM KANADYJSKI i DPX (zawierają ksylen)

  • GLICEROŻEL – do zabezpieczania lipidów i enzymów (nie posiada rozpuszczalników organicznych)

 

MIKROSKOPY:

v      Elektronowy

• Czarno-białe zdjęcia. Przejście elektronów przez preparat

• Osmowanie – OsCu – obszary chłonące elektrony. Zatapianie w żywicach

• Ultramikrotom < 1nm

• Siatki zamiast szkiełek

• Immunizacja złotem – znakowanie przeciwciał złotem (aktyna) Większe kulki (miozyna)

  • Sondy ze złotem komplementarne do odc. RNA – szukanie białka.

v      Świetlny – białe lub barwne

• Barwienia histologiczne – powinowactwo do kwasów lub zasad.

• Histochemiczne – reakcja chemiczna na poziomie tkanki (np. detekcja enzymu)

• Immunohistochemiczne (połączenie dla elektronowego i świetlnego) – np. gastryny. Przeciwciała, antygen + antygen II z chromogenem i polimerem białkowym

  • Peroksydaza chromowa, alkaliczna fosfataza, fluorochrom (fluorescencja – przesunięte widmo. Barwniki DAPI, 7APD? – wiążą się z jądrem)

  • Kropki kwantowe – przeciwciało z jonem metalu i otoczkami z ziarenkiem o śr. X. Do elektronowego i fluorescencyjnego. Kropka emituje widmo. (CZARNA MAGIA – nie wiem o co w tym chodzi i mogę mieć zwalone notatki ^^)

v      Skaningowy – odbija wiązkę

v      Transmisyjny – poprzez próbkę

v                                         płukanie w buforze fosforanowym ma na celu usuniecie utrwalacza z tkanek cele utrwalenia zahamowanie procesów metabolicznych poprzez denaturacje enzymów związanie i wytracenie niektórych substancji co zapobiega pozniejszej dyfuzji i umozliwia uwidocznienie w strefach pośrednich utrwalania tkanki mogą powstac artefakty związane z procesem autolizy utrwalacze pertipitujace alkohole kwasy powodują denaturacje i wytrącenie białek bez tworzenia wiazan krzyzowych alkoh o wzrast stężeniach dzieki temu nastepuje dehydratacja czyli proces usuwania wody z tkanek ma to na celu utwardzenie materiału prześwietlanie zastąpienie sus odwadniającej subst przeswietlajacą czyli traktowanie tkanki ksylenem w celu nadania jest przezierności jest on całkowicie rozpuszczalny w sus odwadniającej jak i w medium do atapiania media do zatapiania parafina nie można pozostawic w tkance lipidów, krucha skrawki nie wybarwiaja się bo w wodnym srod czasteczki barwnika sa odpychane przez parafine celoidyna elastyczna stosowana do tkanek twardych rozwarstwiających się np. oko, duzych, długi proces przepajania tkanek tylko grube tk zywice akrylowe twarde i spoiste co umozliwia krojenie na b cienkie skrawki np. met akrylan glikolu zywice epoksydowe b twarde co umozliwia krojenie na skrawki półciekie i ultra cienkie, stosowany w mikroskopii elektron mikrotom stolik przedmiotowy stalowy nóz mechanizm regulujący grubosc skrawków mechanizm skrawania alko o niższych stężeniach powodują nawadnianie technika mrożeniowa krótkotrwała zachowuje wszystkie skład zapobiega denaturacji białek zachowuje aktywność enzymów blokuje autolize kom ZAMRAZANIE w ciekłym azocie freonie izopropanie w kriostacie kriostat mikrotom do ciecia prep głęboko zmroz agregat chłodzący komora chłodząca a w srodku mikrotom zamraza w ciepłym N płytka szklana chroni przed zwijaniem się preparatu szkiełka silonizowane materiał zatapiany jest w medium do zatap skrawki do preparatyki histochem wada: trudno uzyskac cienkie skrawki 10mm nie zamrazamy kosci i chrząstki subst zamykająceniepolarne zywice(naturalne :balsam Kanad sztuczne: dpx) glicerolzel glicerol w soli fizjolog roztwór gumy arabskiej w sacharozie alkoh poliwinylowy technika pas uzywana do wizualizacji glikogenu i obojętnych polisach nienasycone fosfolipidy barwniki ze wzg na gr chem barw nitrowe kw pikrynowy azowe mon oazowe oranz G dwuazowe Sudan 3 pochodne trójfenylometanu zadadowe fuksyna kwasowe eozyna rodomina poch akrydyny oranz akrydyny poch antrachinonu czerwien jadrowa azynowe safranina oksyazynowe błękit Nilu di azynowe błękit metylenowy naftalocyjanomiedziowe błękit alcjanu ze wzg na PH zasadowe błękit toluidyny safranina hem atoksyl czern jądrowa fuksyna, Kawsne eozyna błekit anilinowy kw pikrynowy (wchodzi w skład płynu błena) oranż G OBojetne azur metylenowy fiolet metylowy Sudan 3 oil red-wybarwiaja tłuszcze podziały barwien sposoby wizualizacji obrazu mikroskop, b bo mikroskopii elektron fruorostencyjnej-rodamina, charakter barwien (topograficzne histochem immunochem, ze wzg na ilość uzytych barwników(proste 1 rodz barwników złozone 2 lub wiecej), lepsze wyniki sa przy rozcieńczonych roztwo i przy dłuższym barwieniu niż w stez wiekszych i przy krótszych barwieniach hem atoksyl  i oil red by mieć punkt odniesienia wybrawianej rzeczy od jądra 1% HCl odbarwia hem atoksyl do różnicowania zaklejamy w balsamie Kanad ale nie tłuszcze! OIL RED nie wymaga odwadniania skrawków i przeprow przez płyny posr ciecie na kriostacie nie ma utrwalenia 10min barwienia świeżo przygotow oil red dobrze opłukac dest H2O Barwic hem atoksyl płukac w biezoącej wodzie do niebieskiego zabarwienia zakleic w cieplym glicerolzelu potem do suszarki tłuszcze można tez Barwic Sudanem 3 ale on dziala powierzchniowo a oil red dogłębnie barwi na intensywny czer kolor