Kalus, kallus, merystem przyranny – tkanka roślinna powstająca w miejscu zranienia rośliny najczęściej z okolicznych komórek tkanki miękiszowej. Jest to amorficzna masa komórek mająca zwykle postać białego nalotu. Komórki tworzone przez te merystemy powodują stopniowe zabliźnianie się i zarastanie ran. Komórki kallusa są zwykle większe od komórek tkanki macierzystej.

Kalus stanowi bezkształtną masę niezróżnicowanych i szybko dzielących się komórek. Może być wyprowadzony z prawie każdej tkanki roślinnej poprzez traktowanie jej mieszaniną hormonów roślinnych (auksyn i cytokinin w takim samym stężeniu). Tak wytworzony kalus, w zależności od warunków, w jakich się będzie rozwijać (tj. stężenia hormonów), może ulec ponownemu zróżnicowaniu w kierunku pędów (większe stężenie cytokininy) lub korzeni (większe stężenie auksyn), włącznie z odtworzeniem całej rośliny. Hodowle in vitro kalusa znajdują szerokie zastosowanie w badaniach nad fizjologią i genetyką roślin.

Kalus jest również jedną z faz embriogenezy somatycznej – odpowiednio pobudzona część rośliny przechodzi wszystkie stadia rozwoju zarodkowego, tworząc w efekcie nowe organy, a nawet cały organizm – tak zwana totipotencja. Małe kawałki rośliny ulegają najpierw odróżnicowaniu, tworząc właśnie kallus, a następnie ponownie się różnicują, budując pędy, korzenie itp.

Czas, jaki potrzebny jest do zarośnięcia rany, zależy od jej wielkości, od warunków, w jakich ona rośnie, a także od rodzaju rany. Rany o gładkiej, nieposzarpanej powierzchni zarastają kallusem szybciej. Badania wykazały, że w ciemności kallus rośnie szybciej. Szybciej rośnie także w warunkach dużej wilgotności powietrza. Ostatecznie kallus doprowadza do zarośnięcia całej rany, a powstające nad nim kambium wytwarza jednolitą warstwę, z której następnie wytwarzane są tkanki drewna i łyka, jednak nowo powstałe warstwy drewna nie zrastają się ze starymi. I chociaż z czasem, po wielu latach, nie widać już z zewnątrz na pniu śladu po ranie, to jednak na przekroju poprzecznym pnia widoczna jest wyraźna granica między starymi i nowymi przyrostami.

Części kallusa wystawione na działanie światła zawierają chlorofil. Mogą też wytwarzać się w kallusie młode pączki, a z nich wyrastają pędy. Czasami kallus rozrasta się bardzo bujnie, doprowadzając do powstania narośli o nieprawidłowych kształtach.

Kallus występuje głównie u roślin nagonasiennych i okrytonasiennych. Znacznie rzadziej spotyka się go u plechowców i paprotników.

Pierwszą odkrytą auksyną był IAA (kwas indolilooctowy). W 1946 roku Ball doprowadził do odtworzenia całej rośliny tytoniu (Nicotiana tabacum) z wierzchołka wzrostu. Równocześnie prowadzono badania nad możliwością skrócenia okresu spoczynku nasion oraz organogenezą kalusa. Komercyjne wykorzystanie kultur in vitro do rozmnażania roślin, głównie ozdobnych stało się możliwe od roku 1965, kiedy Murashige opracował efektywny sposób klonalnego rozmnażania storczyków. Jego metodę zaczęto stosować do innych gatunków roślin.

Czym są kultury in vitro roślin?

Czym w zasadzie są kultury in vitro? To hodowla komórek, tkanek lub fragmentów organów roślinnych, prowadzona w naczyniach szklanych, na specjalnie dobranych pożywkach, w ściśle kontrolowanych, sterylnych warunkach.

Komórki roślinne są totipotentne, czyli posiadają nieograniczone zdolności do dzielenia się i odtwarzania poszczególnych organów i całego organizmu. Dawniej, w in vitro do wywołania totipotencji stosowano, bogate w składniki odżywcze i substancje wzrostowe, płynne bielmo (mleczko kokosowe, mleczko kukurydziane). Naturalne składniki mogą być zastąpione pożywkami otrzymanymi syntetycznie o zoptymalizowanym składzie. Zdolności regeneracyjne wszystkich komórek są takie same. Zależy to od wielu czynników, a mianowicie: wieku komórek, ogólnej kondycji tkanki, stopnia zróżnicowania i specjacji. Również tkanki tego samego organu mogą wykazywać różnice w regeneracji, np. tkanki górnej części korzenia marchwi (Daucus carota) regenerują lepiej niż te same tkanki pobrane z części dolnej. Komórki wykorzystywane w kulturach powinny posiadać żywotne jądro, nie uszkodzone błony plazmatyczne i niezbyt grube ściany.

Różnicowanie się komórek, inaczej dyferencjacja może nastąpić drogą organogenezy bezpośredniej i pośredniej. Pierwsza polega na wykształceniu organów roślinnych, bez stadium przejściowego, bezpośrednio z wyłożonych na pożywce tkanek bądź z zawiesiny komórek. Z kolei organogeneza pośrednia, zawiera etap przejściowy w postaci wytworzenia tkanki kalusowej, w której następnie wytworzą się centra komórek merystematycznych (Merystem to tkanka twórcza, gdzie zachodzą intensywne podziały komórkowe, co powoduje powstawanie organów roślinnych). Nie wszystkie komórki kalusa mają jednakowe możliwości rozwojowe. Niektórzy badacze uważają, że kalus to struktura składające się z komórek kompetentnych i niekompetentnych, co powoduje zróżnicowany wzrost rośliny. Tłumaczy to zjawisko zachodzące w hodowlach tkanek, gdzie wydajność morfogenezy nie jest jednolita, mimo że tkanki pochodzą z tych samych części roślin.

Warunki prowadzenia kultur in vitro

Istnieje jedna najważniejsza zasada, a mianowicie elementy sterylne muszą być oddzielone od niesterylnych. Wszystkie pomieszczenia powinny być utrzymywane w czystości. Trzeba zapewnić optymalne warunki do wzrostu roślin. Do tego celu buduje się specjalne pomieszania, gdzie można kontrolować temperaturę wzrostu, wilgotność oraz fotoperiod. Są to tak zwane fitotrony.

Po zebraniu materiału należy przeprowadzić jego sterylizację. Proces musi być przeprowadzony bardzo starannie, gdyż w przypadku błędów zakażeniu może ulec cała hodowla. Środki do dezynfekcji powinny być tak dobrane, aby niszcząc patogeny nie uszkodziły eksplantatu. Najczęściej do jałowienia materiału roślinnego używa się: roztworu podchlorynu wapnia, roztworu podchlorynu sodu, wodę bromową, wodę utlenioną, alkohol etylowy czy handlowe preparaty Domestos lub Ace.

Szkło i narzędzia należy poddać sterylizacji w suszarce lub autoklawie. Przed izolacją eksplantatów trzeba wyjałowić również pożywki. Izolację materiału roślinnego wykonuje się w warunkach sterylnych, na stole z laminarnym przepływem powietrza, zapewniając w ten sposób sterylność prac. Zakażenia ujawniające się na pożywce i eksplantatach są spowodowane obecnością patogenów oraz saprofitów, których nie wyeliminowano podczas dezynfekcji lub błędów popełnionych w późniejszych etapach hodowli.

Należy używać wyłącznie wody o wysokiej czystości w procedurach hodowli tkankowej. Woda podwójnie destylowana lub dejonizowana są również dopuszczalne. Woda nie powinna być przechowywana, ale natychmiast wykorzystana. Regularna konserwacja i monitorowanie urządzeń do oczyszczania wody są konieczne. Oczyszczona woda do hodowli tkanek jest również dostępna komercyjnie.

Pożywki dla kultur in vitro

Pożywka, na którą wykłada się ekplantaty musi dostarczać niezbędne do wzrostu i rozwoju związki mineralne (makro- i mikroelementy), źródło energii i węgla, witaminy, organiczny azot i regulatory wzrostu. Mają one znaczenie w przerywaniu spoczynku i indukcji podziałów komórek, ale również wiele czynników fizycznych pożywki ma wpływ na powodzenie kultury. Przede wszystkim jeśli składniki są rozpuszczone w wodzie destylowanej mamy do czynienia z pożywką płynną, bądź stałą, gdy jest zestalona agarem. O stopniu zestalenia decyduje zawartość procentowa agaru, a to z kolei wiąże się z potencjałem wodnym pożywki. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w wodzie redestylowanej lub dejonizowanej mierzy się pH pożywki. Optymalna wartość waha się między 5 – 6. W inicjacji podziałów komórkowych i wzrostu kalusa światło nie jest najistotniejsze. Jest wiele rodzajów pożywek i ich modyfikacji. Do najbardziej znanych należą: Gauthereta (1942), Hildebrandta i in. (1946), Nitcha (1951), Hellera HE (1953), Reinerta, White’a (1956), Murashige i Skoog’a MS (1962), Linsmaier’a i Skoog’a LS (1965), Gamborga i in. B5 (1968), Philips’a i Collins’a L2 (1979).

Składniki pożywek do prowadzenia kultur in vitro

Eksplantat, który hodujemy potrzebuje do wzrostu i rozwoju wszystkich niezbędnych pierwiastków. Spośród 90 pierwiastków występujących w przyrodzie roślina potrzebuje zaledwie kilkunastu z nich. W zależności od gatunku i jego potrzeb ustala się odpowiednie stężenia składników.


Makroelementy w pożywkach

Jak wskazuje nazwa ilość dostarczanych składników z tego rodzaju musi być wysoka, aby wzrost i rozwój roślin zachodził prawidłowo. Azot, fosfor, potas, magnes, wapń i siarka (węgiel podawany jest w postaci organicznej) są zwykle uważane za makroelementy, które zazwyczaj występują w co najmniej 0,1% suchej masy.

Azot

Azot jest najważniejszy dla rośliny. Większość nieorganicznego azotu jest konwertowany do aminokwasów, a następnie do białek. Ilość nieorganicznego azotu w pożywce waha się 25 – 60 mM. Najczęściej dostarczany w postaci jonów azotanowych (KNO3) i amonowych (NH4NO3). Zawartość całkowita jak i względna jest bardzo istotna. Teoretycznie korzystne jest dostarczanie azotu pod postacią jonów amonowych, jako że azot musi być w formie zredukowanej by być wbudowanym w makromolekuły. W wysokich stężeniach jony amonowe mogą być toksyczne dla tkanek roślinnych np. powodować witryfikację zarodków (zeszklenie, nie nadają się wtedy do prowadzenia dalszej kultury), a absorbcja ich przez rośliny powoduje zakwaszenie podłoża. Dlatego stosowanie ich jako jedyne źródło azotu, wiąże się ze stabilizacją pH pożywki.

Potas

Jest ważnym dla rośliny jonem o ładunku dodatnim. Chociaż wymagana ilość potasu jest bardzo zróżnicowana w zależności od gatunku, stężenie potasu w pożywkach waha się od 20-30 mM.

Fosfor

Jest integralną częścią kwasów nukleinowych i innych związków strukturalnych. Dodawany jest jako sole amonowe, sodowe lub potasowe, w stężeniach 1-3 mM. Zbyt duże stężenie fosforu może prowadzić do wytrącania się składników podłoża w postaci nierozpuszczalnych fosforanów.

Wapń

Wapń jest kofaktorem wielu enzymów i pełni szczególnie ważną rolę w syntezie ściany komórkowej. Jest on dostarczany głównie jako chlorek wapnia lub azotan wapnia, stężeniach w zakresie od 1 do 3 mM. W kulturach roślin, niedobór wapnia może doprowadzić do martwicy wierzchołka pędu.

Magnez

Ma zasadnicze znaczenie dla funkcjonowania enzymów, jest integralną częścią cząsteczki chlorofilu. Zwykle jest dodawany w postaci siarczanu magnezu, w stężeniach zbliżonych do wapnia.

Siarka

Siarka jest częścią kilku aminokwasów i odgrywa ważną rolę w strukturze białka. Dostarczana jest jako jon SO4-, w stężeniach 1-3 mM.


Mikroelementy w pożywkach

Są niezbędne w ilościach śladowych i pełnią różnorodne funkcje. Należą tu: mangan, jod, miedź, molibden, bor, żelazo, kobalt, i cynk. Czasem w niektórych przepisach wykorzystuje się jeszcze glin i nikiel.

Żelazo

Żelazo jest niezbędne do syntezy chlorofilu oraz pełni funkcję w wielu reakcjach utleniania i redukcji. Na ogół występuje w pożywkach w stężeniach 1 µM. Głównym problemem w dostarczaniu żelaza in vitro jest to, że tworzy nierozpuszczalne związki w zasadowym pH, problem ten jest szczególnie widoczne w hodowli płynnej, gdzie można zauważyć osad. Jest zazwyczaj dodawane jako siarczan żelaza, choć spotyka się również cytrynian żelaza. EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) jest dodawany w połączeniu z siarczanem żelaza. Kompleksy, które powstają po połączeniu żelaza i EDTA umożliwiają powolne i ciągłe uwalnianie się żelaza z podłoża. Ułatwia to wnikanie żelaza do tkanek roślinnych w szerszym zakresie pH. W innym przypadku nastąpiłoby wytrącenie się jonów żelaza z pożywki w postaci tlenku żelaza.

Mangan

Mangan jest potrzebny do reakcji enzymatycznych, szczególnie w procesach oddychania i fotosyntezy i dodaje się go zwykle jako siarczan manganu w stężeniach 5-30 µM.

Cynk

Cynk jest również wymagany do aktywności enzymatycznej. Dodawany do podłoża w stężeniach podobnych do manganu. Najbardziej rozpowszechnioną formą, w której cynk jest dodawany to siarczan.

Bor

Bor jest niezbędnym elementem zaangażowanym w biosyntezę ligniny i w metabolizm kwasów fenolowych. Dostarczany w postaci kwasu borowego w stężeniach 25-100 µM. Objawy niedoboru charakteryzują się martwicą wierzchołka pędu.

Miedź

Miedź jest istotna w wielu reakcjach enzymatycznych, w tym w cyklu oksydazy cytochromowej. Dodawana w postaci siarczanu magnezu, w bardzo niskich stężeniach (0,1 µM). Przy wysokiej koncentracji może być toksyczna.

Molibden

Molibden bierze udział w transformacji azotanu do amonu. Pożywka suplementowana 1 µM molibdenianu sodu.

Kobalt

Kobalt nie jest uważany jako istotny składnik w fizjologii roślin, ale jest zawarty w wielu powszechnie stosowanych podłożach hodowlanych. Jest dostarczany w niskich stężeniach, ponieważ tak samo jak miedź w wyższych może być toksyczny.

Mimo, iż stwierdzono, że również jod nie jest ważnym elementem to dodaje się go do pożywek (5 µM), ponieważ zauważono jego wpływ na poprawę wzrostu korzeni i kalusa w in vitro.

Inne elementy: nikiel, glin, krzem są dodawane do nielicznych pożywek. Nie zostały one uznane za istotne dla większości gatunków.

Składniki organiczne w pożywkach do prowadzenia kultur in vitro

Związki organiczne są również dodawane do pożywek roślinnych. Niektóre z tych związków, takich jak cukry, są absolutnie niezbędne dla wzrostu, podczas gdy inne, takie jak witaminy czy kwasy organiczne, nie muszą stanowić istoty pożywki, ale mogą przyspieszyć wzrost.
Aminokwasy są powszechnie dodawane do pożywek. Do tych najczęściej stosowanych można zaliczyć glicynę, inne to: kwas asparaginowy, arginina, asparagina, alanina, kwas glutaminowy, glutamina i prolina, ale w większości przypadków ich dodatek nie jest konieczny. Aminokwasy stanowią dobre źródło zredukowanych jonów azotu. Hydrolizat kazeiny może stanowić relatywnie tanie źródło mieszanki aminokwasów.

Źródło węgla

Zwykle kultury tkankowe roślin nie są wysoce autotroficzne, ze względu na ograniczenia w dostępności CO₂. Dlatego cukier jest dodawany do medium jako źródło energii. Sacharoza jest tania, łatwo dostępna, dobrze przyswajalna i stosunkowo stabilna. Na drodze metabolizmu rozkładana jest do glukozy i fruktozy. Jest również częściowo hydrolizowana podczas autoklawowania. Koncentracja cukrów w pożywce wynosi zwykle od 20 do 40 g/l. Inne węglowodany (takie jak: glukoza, maltoza, fruktoza, galaktoza czy sorbitol) mogą być również używane. Okazuję się, że w niektórych przypadkach są o wiele bardziej skuteczne niż sacharoza. Cukry odgrywają również rolę osmotyczną. Potencjał ten może mieć istotny wpływ na odpowiedź w in vitro. Sole mineralne biorą udział w regulacji potencjału wodnego w 20-50%, a resztę funkcji pełnią właśnie węglowodany. Kiedy sacharoza ulegnie hydrolizie podczas autoklawowania, jej wkład w potencjał osmotyczny jest tym większa.

Witaminy

Jedynie tiamina (witamina B1), która jest niezbędna do metabolizmu węglowodanów i biosyntezy niektórych aminokwasów, okazała się mieć zasadnicze znaczenie dla większości kultur roślinnych. Kwas nikotynowy (niacyna) i pirydoksyna (B6) są powszechnie dodawane do medium Murashige i Skoog i niektórych innych. Inne witaminy, takie jak biotyna, kwas foliowy, kwas askorbinowy (witamina C) i witamina E (tokoferol) dodaje się rzadko. Stężenia witamin są zazwyczaj bardzo niskie.

Mio-inozytol - alkohol cukrowy, dodawany do większości podłoży hodowlanych. Szczególnie u jednoliściennych znacznie poprawia odpowiedź w kulturze.

Węgiel aktywowany

Jest czasem dodawany do mediów w celu adsorpcji związków toksycznych wydalanych przez tkanki roślinne, zwłaszcza utlenione naturalne fenole. Może to być szczególnie ważne w pożywkach ukorzeniających. Jednak węgiel aktywowany adsorbuje nie tylko toksyczne związki, ale także regulatory wzrostu i inne związki, które są dodawane do medium.

Związki żelujące

Stosowane w celu przygotowania stałych i półstałych pożywek. Wybór środka żelującego dla poszczególnych roślin jest na ogól empiryczny. Z nieznanych powodów, tkanki niektórych gatunków nie rosną jednakowo w obecności każdego czynnika żelującego.

Agar, produkowany z krasnorostów, jest najpopularniejszym typem środka żelującego i nadający się do codziennych zastosowań. Zbudowany jest z w dwóch komponentów: agarozy i agaropektyny. Gdy agar miesza się z cieczą, tworzy żel, który topi się w temperaturze ok. 100°C i krzepnie w temperaturze około 45°C. Zaletą jest to, że agar nie reaguje ze składnikami pożywki i nie jest trawiony przez enzymy tkanek roślinnych. Jako, że jest to produkt naturalny czasem jego jakość może różnić się od dostawcy i partii. Nie wpływa to znacząco na odpowiedź kultury. Są jednak doświadczenia, gdzie czasami agar nie jest najlepszym rozwiązaniem. Agar nie działa dobrze w środowisku kwaśnym (pH<4,5). Dodatek węgla aktywnego również może wpłynąć na proces żelowania. Stężenie agaru powszechnie stosowane w podłożach hodowlanych roślin to 0,5-1%. Zbyt płynna pożywka może powodować szklistość tkanek, a zbyt twarda ograniczenie wzrostu. Jest wiele alternatyw dla tej substancji o jakości o wiele lepszej. Są to np. agaroza lub gumy gellan.

Agaroza jest stosowana, gdy wymagana jest wyższa czystość podłoża. Przykładem są kultury protoplastów, gdzie zanieczyszczenia agaru są niepożądane. Pozyskiwana z agaru i jest znacznie droższa od niego. Główną zaletą jest fakt, że powoduje wyższą wytrzymałość żelu, a przy tym można wykorzystać mniejsze stężenia tej substancji.

Gumy gellan to rozpuszczalne w wodzie polisacharydy produkowane przez Pseudomonas elodea. Są komercyjnie dostępne pod marką AppliedGel, Phytagel lub Gelrite. Zaletą mediów zestalonych tymi substancjami jest to, że można wykryć zakażenia w bardzo wczesnym stadium. Zanieczyszczenia zawarte w Gerlite to nieorganiczne jony, brak jest związków organicznych. Jednym z ograniczeń Gelrite jest to, że stężenie kationów dwuwartościowych, takich jak jony wapnia i magnezu musi mieścić się w zakresie 4-8 mM / litr.

Phytagel ™ jest ekonomiczną alternatywą agaru, dający klarowny, bezbarwny żel o wysokiej wytrzymałości, który pomaga w wykryciu zakażenia bakteryjnego. Jest on używany w stężeniu 1,5-2,5 g/l.

Te czynniki żelujące są w stanie wytrzymać nawet temperaturę 120°C. Wykorzystywane są nie tylko w kulturach in vitro roślin, ale i w mikrobiologii np. przy hodowli mikroorganizmów termofilnych. Ponadto można suplementować pożywki takimi związkami jak: mleczko kokosowe, woda kokosowa, ekstrakt drożdżowy, soki czy pulpy owocowe. Mogą one dostarczać aminokwasy, witaminy, regulatory wzrostu roślin, i / lub metabolity wtórne roślin. Były one jednak powszechnie stosowane w czasach, gdy techniki kultur in vitro „raczkowały”, a składniki potrzebne do wzrostu rośliny były słabo zdefiniowane.

Wyżej wymienione składniki pożywek stanowią niezbędne elementy dla komórek roślinnych. Inne dodatkowe związki wprowadzane są w celu manipulacji wzrostu i rozwoju rośliny. Są to np. fitohormony i inne regulatory wzrostu (auksyny, gibereliny, cytokininy, kwas abscysynowy i etylen).

Etapy mikrorozmnażania

Etap I - Założenie kultury

Aby założyć kulturę należy wziąć pod uwagę kilka istotnych czynników, które determinują osiągnięcie jak najlepszej wydajności. Wybierając eksplantat pierwotny warto zwrócić uwagę na wiek rośliny (młode, zdrowe, intensywnie rosnące rośliny są lepsze); wybór organu roślinnego do pobrania eksplantatu (najłatwiej dalszy wzrost podejmują części roślin zawierające różnego rodzaju tkanki merystematyczne); porę roku (okres wiosenny – najwyższa wydajność); warunki wzrostu rośliny donorowej (optymalne warunki rozwoju, odpowiednie oświetlenie, temperatura, nawożenie); stan fitosanitarny roślin. Eksplantaty poddaje się sterylizacji, najczęściej wykorzystując do tego celu roztwory podchlorynu sodu, potasu lub wapnia, chloraminę T, chlorek rtęci, etanol, wodę utlenioną. Ważne jest żeby czas sterylizacji nie był zbyt długi oraz stężenie substancji odkażającej zbyt wysokie, ponieważ może to wywołać zamieranie tkanek. Po sterylizacji należy trzykrotnie wypłukać eksplantat w sterylnej wodzie. Następnie materiał roślinny przenosi się na pożywki. W ciągu 3-6 tygodni po wyłożeniu na pożywkę następuje tzw. stabilizacja hodowli, w efekcie której uzyskuje się aseptyczny i zdolny do namnażania eksplantat. Na tym etapie selekcjonuje się materiał roślinny i odrzuca nieprawidłowo rozwinięty, nekrotyczny, zdeformowany i porażony.

Etap II - Masowe namnażanie

Etap ten polega na powielaniu materiału roślinnego, dzielenie go i przenoszenia na świeże pożywki. Trwa to aż do uzyskania pożądanej ilości egzemplarzy. W tym okresie aseptyczny materiał roślinny (np.: zarodki somatyczne, pąki przybyszowe, pędy, wieloroślinki) zabezpiecza się przed drobnoustrojami poprzez stałą kontrolę powietrza w pomieszczeniach hodowlanych i testowanie sterylności komór laminarnych. Długość pojedynczego pasażu wynosi od 3 do 8 tygodni i zależy od: gatunku rośliny, chemicznych warunków rozmnażania, fizycznych warunków rozmnażania. Nie powinno się dopuścić starzenia się kultur ponieważ może to doprowadzić do obniżenia żywotności i zdolności do ukorzeniania w następnych pasażach.

Etap III - Adaptacja uzyskanych roślin do normalnych warunków

Przed przeniesiem do warunków in vivo materiał roślinny hartuję się przez zmniejszenie poziomu cukrów w pożywce oraz obniżenie temperatury i zwiększenie natężenia światła w pomieszczeniach hodowlanych (fitotronach). Właśnie wtedy uzyskane pędy zmuszane są do wytworzenia systemu korzeniowego, warstwy ochronnej tkanek oraz uruchomienia efektywnych procesów transpiracji i fotosyntezy.
Ukorzenianie przeprowadza się w zależności od gatunku rośliny:

- w warunkach in vitro – długość okresu ukorzeniania pędów na pożywkach o zredukowanej zawartości minerałów wynosi od 1-6 tygodni,
- w warunkach ex vitro – ukorzenianie pędów prowadzone w tych warunkach przebiega równocześnie z aklimatyzacją i wytwarzaniem nowych liści.

Następnie rośliny wysadza się do doniczek, wypełnionych substratem (np. mieszaniną ziemi, torfu i perlitu) i umieszcza w optymalnych warunkach. Z chwilą przyjęcia się rośliny proces mikrorozmnażania zostaje zakończony.

Sposoby mikrorozmnażania

- pobudzanie do rozwoju pąków bocznych
- formowanie pąków przybyszowych bezpośrednio lub pośrednio przez kalus
- embriogenezę somatyczną

Najlepiej poznaną metodą jest ta pierwsza, choć wydajność reprodukcyjna tej metody jest ograniczona liczbą pąków na eksplantatach (2-20 pąków). Dwa pozostałe charakteryzują się bardzo dobrą wydajnością rozmnażania, lecz szczegółowe protokoły są opracowane dla niewielu odmian.

Kultury pąków bocznych

Najczęściej używanymi eksplantatami do inicjacji kultur in vitro pędów bocznych są: merystemy wierzchołkowe, merystemy pąków bocznych wierzchołki pędów, pąki kwiatowe (boczne), fragmenty pędów z węzłem, parą liści i pąkiem bocznym. Eksplantaty wykłada się na pożywki z dodatkiem cytokininy, umożliwiając rozwój już istniejących i tworzenie się nowych pąków kątowych. Klony roślin uzyskane tą metodą są wyrównane fenotypowo i wykazują genetyczną stabilność. Bardzo istotnym aspektem wykorzystania tej metody jest poprawienie zdrowotności roślin. Kultury merystemów pozwalają otrzymać materiał roślinny wolny od patogenów, a zwłaszcza od wirusów. Wykazano, że merystem wierzchołkowy pędu nie zawiera wirusów, bądź posiada ich niewiele i że traci je w trakcie kultury. Często, w celu wydajniejszego procesu odwirusowania technikę mikrorozmnażania łączy się z termoterapią – traktowaniem materiału roślinnego podwyższona temperaturą in vivo (przed pobraniem eksplantatu, 26-45^°C przez 4 do 12 tygodni) lub in vitro (30-36^°C, przez 4 do 8 tygodni) lub z chemioterapią – dodaniem do pożywek antymetabolitów, sufraktantów czy rybawiryny (związków o wysokiej aktywności przeciwwirusowej).

Kultury te znalazły zastosowanie u:

- roślin ozdobnych (Orchidiaceae, Chrysanthemum, Gloxinia, Spatiphyllum, Nephrolepsis, Gerbera, Dianthus, Funkia, Freesia, Nicotiana)
- drzew owocowych i podkładek drzew owocowych (Corylus avellana, Malus domestica, Pyrus communis, Prunus domestica, Armeniaca vulgaris)
- jagodowych (Fragaria x ananasa)
- tropikalnych i subtropikalnych (Malus paradisiaca, Ananas comosus, Morus sp., Hevea brasiliensis)

Kultury pąków przybyszowych

Części rośliny, na których mogą powstawać pąki przybyszowe to korzenie łodygi, liście, kwiatostany, łuski cebulowe czy pędy kwiatowe. Metoda wykorzystywana przede wszystkim u roślin, które z trudem wytwarzają pąki boczne. Na powstawanie i intensywny rozwój pąków przybyszowych w warunkach in vitro wyraźny wpływ mają: rodzaj i wzajemne proporcje zastosowanych auksyn i cytokin, warunki fizyczne hodowli (zwłaszcza światło i temperatura), rodzaj tkanki, gatunek rośliny, kondycja kultury.

Różnicowanie się pąków przybyszowych następuje za pośrednictwem tkanki kalusowej (organogeneza pędowa pośrednia) lub bezpośrednio na eksplantacie (kaulogeneza). Organogeneza pędowa pozwala na uzyskanie wyższego współczynnika rozmnażania w porównaniu do hodowli wierzchołków pędów czy pąków kątowych. Inna formą organogenezy jest ryzogeneza (tworzenie korzeni przybyszowych). Jednak bardzo rzadko udaje się odtworzyć roślinę z korzenia, dlatego nie jest ona wykorzystywana w mikrorozmnażaniu.

Kultury pąków przybyszowych znalazły zastosowanie u:

- roślin ozdobnych (Orchidaceae, Gesneriaceae, Piperaceae)
- w tym roślin cebulowych (Amaryllidaceae, Iridaceae, Liliaceae)
- zbóż (Oryza sativa, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Zea mays)

Embriogeneza somatyczna

To proces biologiczny, podczas którego w warunkach in vitro z komórek wegetatywnych formują się zarodki. Jest on łatwy w automatyzacji, tani i niepracochłonny. Zarodki somatyczne to proste struktury z wyodrębnioną osią pęd – korzeń, morfologicznie podobne do zarodków zygotycznych wytworzonych w procesie zapłodnienia. Również ich rozwój jest podobny: pojedyncza komórka, drobne agregaty komórkowe, zarodek kulisty (globularny), sercowaty, torpedowaty i stadium liścieniowe. W wyniku formowania zarodków somatycznych można w warunkach in vitro uzyskać wysoki współczynnik namnażania materiału roślinnego. Materiałem wyjściowym do produkcji takich zarodków mogą być np. fragmenty młodych liści, hipokotyle i liścienie siewek, czy nawet igły roślin. Opisane wcześniej metody rozmnażania polegają na namnażaniu pąków i pędów, czyli struktur jednobiegunowych, a odtwarzanie korzeni zachodzi w kolejnym etapie w laboratorium lub w warunkach in vivo. Efektem końcowym embriogenezy somatycznej jest kompletna roślina z jednym lub dwoma liścieniami, epikotylem i korzonkiem zarodkowym. Zarodki somatyczne można z powodzeniem wykorzystać przy produkcji sztucznych nasion.

Metoda znalazła zastosowanie tam, gdzie uzyskanie nasion może być trudne i długotrwałe. Dzięki niej można otrzymać dowolną ilości zdrowego, wyrównanego materiału siewnego, niezależnie od warunków pogodowych w zaplanowanym terminie. Ponadto istnieją doniesienia, że naukowcy z Kanadyjskiego Centrum Włókien Drzewnych chcą wykorzystać embriogenezę somatyczną do masowej produkcji takiej krzyżówki sosny białej, która będzie odporna na rdzę wejmutkowo-porzeczkową. Jest to choroba drzew iglastych, przede wszystkim sosen i porzeczek, głównie porzeczki czarnej, wywołana przez patogenny grzyb Cronartium ribicola. Naukowcy planują również współpracę z partnerami przemysłu leśnego w celu wykorzystania tego procesu do produkcji sadzonek świerka białego o wydajniejszym wzroście i lepszych cechach jakościowych (świerk biały jest coraz chętniej wybieranym gatunkiem drzewa, ponieważ charakteryzuje się podczas całego cyklu hodowlanego wyższą produkcją drewna niż świerk czarny).

Embriogenezę somatyczną stosuje się do:
- komercyjnego rozmnażania drzew leśnych
- namnażania niektórych gatunków