1.1 Podstawowe definicje; główne kierunki przemian rozwojowych roślinnych tkanek in vitro
Określenie kultury in vitro, najdosłowniej rozumiane, oznacza hodowle prowadzone w szkle (w zamkniętych naczyniach). W praktyce jednak przez roślinne kultury in vitro będziemy rozumieć hodowle roślin (a częściej ich niewielkich fragmentów - organów, tkanek, komórek, lub protoplastów) prowadzone na sztucznych podłożach (pożywkach) w warunkach jałowości. W tym samym, bardzo ogólnym sensie bywa stosowany termin hodowle tkankowe. Wydaje się, że istotę rzeczy jeszcze lepiej ujmowało określenie stosowane kiedyś: roślinne czyste kultury, niestety termin ten praktycznie wyszedł już z użycia.
Techniki kultur in vitro, stanowią jeden z głównych działów nowoczesnej biotechnologii roślin (obok inżynierii genetycznej i blisko z nią związanej diagnostyki molekularnej) i służą celom praktycznym np. masowemu rozmnażaniu roślin, ich doskonaleniu (hodowli nowych odmian), albo pozyskiwaniu z nich cennych metabolitów np. surowców do produkcji leków czy kosmetyków. Metody te odgrywają również ważną rolę w badaniach podstawowych, głównie z dziedziny fizjologii, biochemii oraz biologii molekularnej roślin.
Kultury in vitro przeciwstawia się hodowlom prowadzonym w warunkach naturalnych, niesterylnych np. uprawie polowej czy szklarniowej, które bywają nazywane kulturami ex vitro lub in vivo. Także w uprawach hydroponicznych mamy do czynienia z warunkami ex vitro. Korzenie roślin są w tym przypadku częściowo zanurzone w wodnej pożywce, częściowo zaś "zakotwiczone" w porowatym podłożu unieruchamiającym roślinę i umożliwiającym sprawną wymianę gazową. Uprawy hydroponiczne przypominają kultury in vitro zastosowaniem sztucznych pożywek, ale różnią się od nich brakiem izolacji hodowanego obiektu od zewnętrznego środowiska. Kultury hydroponiczne są sposobem uprawy całych roślin, natomiast w kulturach in vitro, przynajmniej w ich wstępnej fazie, hodujemy zwykle niewielkie fragmenty roślin (np. odcinek korzenia lub łodygi, wycinek blaszki liściowej, pylnik lub zalążek), którym trzeba zapewnić nieco bardziej złożoną pożywkę.
Każdą część rośliny wykorzystywaną jako materiał wyjściowy do założenia roślinnej kultury in vitro nazywa się ogólnie eksplantatem. Dla uzyskania wzrostu kultury wystarczy dowolny eksplantat, byle zawierał żywe komórki z nieuszkodzonym materiałem genetycznym (zdolne do odróżnicowania i podziałów). Jednakże zarówno szybkość wzrostu, jak i procesy rozwojowe zależą od zastosowanego rodzaju eksplantatu pierwotnego (a także od rodzaju pożywki i warunków hodowli). Ze względu na konieczność zapobiegania zakażeniom, lepiej nadają się do hodowli nadziemne części roślin, podobnie lepsze, bo zdrowsze są rośliny pochodzące z uprawy szklarniowej niż polowej. Rośliny z których pobierane będą eksplantaty mogą być wcześniej opryskane układowym fungicydem (środkiem grzybobójczym), jakkolwiek rzadko kiedy jest to niezbędne.
Zwykle eksplantat pobierany jest z fizjologicznie młodych, w znacznym stopniu niezróżnicowanych tkanek roślinnych, bo dużo łatwiej jest uzyskać w nich podziały komórkowe i wzrost kultury. Dobrze jeśli wyjściowy materiał roślinny jest w fazie intensywnego wzrostu, a nie fizjologicznego spoczynku (łatwiej więc zakładać hodowle wiosną niż jesienią czy zimą).
Jeśli eksplantat pobierany jest z roślin rosnących w warunkach niesterylnych, to nazywamy go eksplantatem pierwotnym. Natomiast eksplantatem wtórnym nazywamy fragment rośliny (lub tkanki) pochodzący z kultury in vitro i użyty do zapoczątkowania nowej hodowli in vitro (przeszczepiony na nową pożywkę, na przykład dlatego, że w dotychczasowej zaczęły już wyczerpywać się składniki odżywcze). Proces odświeżania kultury przez przeszczepianie jej fragmentu na nową pożywkę nazywamy pasażowaniem. W przypadku hodowli komórek, prowadzonych w płynnych pożywkach, zamiast terminu eksplantat wtórny stosuje się pojęcie inoculum. Hodowle płynne (w płynnych pożywkach) również poddawane są pasażowaniu, a liczba tych zabiegów (tj. pasaży) od chwili założenia danej hodowli jest jednym z podstawowych parametrów charakteryzujących kulturę. Wydaje się, że komórki, tkanki i organy roślinne mogą być utrzymywane w hodowlach in vitro przez dowolnie długi czas. Na przykład wzrost korzeni pomidora podtrzymywano in vitro przez wiele lat, systematycznie pasażując (co kilka tygodni) wierzchołkowy odcinek rosnących korzeni.
Wzrost jest typowym wynikiem hodowli eksplantatu, objawem wydłużania się komórek, a także podziałów, zwłaszcza jeśli eksplantat zawiera tkankę merytematyczną. Nawet jednak jeśli eksplantat początkowo zawiera wyłącznie tkanki stałe, wyspecjalizowane i nie dzielące się, to pod wpływem warunków hodowli, a zwłaszcza występujących w pożywce regulatorów wzrostu, niektóre komórki mogą ulec fizjologicznemu przeprogramowaniu i odzyskać zdolność podziałów. Proces ten nazywamy odróżnicowaniem. Komórki roślinne, mają zdolność powrotu do stanu merystematycznego, o ile jądro komórkowe i układ błon cytoplazmatycznych nie uległy zbyt silnemu uszkodzeniu. Odróżnicowanie zaczyna się od odbudowy struktur komórkowych, zniszczonych przez enzymy lizosomalne podczas fazy spoczynkowej komórek. Zdolności odróżnicowania nie mają człony rurek sitowych i naczyń, w których jądra zaczęły degenerować, a także włókna, o ścianach komórkowych grubości powyżej 2 μm. Większość jednak komórek roślinnych ma taką zdolność. W wyniku odróżnicowania może dochodzić do powstania w eksplantacie nowych skupisk komórek merystematycznych (centrów merystematycznych). Jeśli podziały wielu komórek zachodzą w sposób nieskoordynowany, to prowadzą do powstania guzowatej narośli, zawierającej głównie komórki miękiszowe i merystematyczne oraz bezładnie rozrzucone pomiędzy nimi komórki innych typów. Taką narośl, nie mającą uporządkowanej budowy wewnętrznej, nie osłoniętą tkanką okrywającą, nazywamy kalusem. W warunkach in vivo narośl podobna do kalusa może tworzyć się spontanicznie w pobliżu miejsc skaleczenia rośliny, stanowiąc tzw. tkankę przyranną, zabliźniającą ubytek tkanki rośliny. Niektóre komórki merystematyczne mogą wtórnie tracić zdolność podziałów i przyjmować postać typową dla tkanek stałych. Zjawisko to nazywamy różnicowaniem. Różnicowanie komórek zapoczątkowuje proces powstawania tkanek stałych, zwany histogenezą. Hodowle kalusa są dogodnym układem doświadczalnym do badania regulacji powyższych przemian rozwojowych przez metabolity, regulatory wzrostu, fizyczne warunki hodowli itp. Stosunkowo wyraźnym przemianom morfologicznym ulegają komórki przekształcające się w drewno. Ten proces, zwany ksylogenezą, jest prawdopodobnie najczęściej badaną w kulturach in vitro formą histogenezy.
W kalusie, a czasami bezpośrednio w tkankach eksplantatu pierwotnego, mogą się też rozwijać zawiązki całych organów. Takie tworzenie się organów od nowa (a nie poprzez pobudzenie wzrostu drobnych zawiązków, istniejących już w eksplantacie pierwotnym) nazywamy organogenezą. Jeśli więc na pożywce umieścimy pąk jakiejś rośliny i uda nam się pobudzić jego rozwój in vitro i przekształcanie się w pęd, to będziemy mogli zaobserwować wzrost i histogenezę, ale nie organogenezę (tkanki pędu wprawdzie rozrastają się tu, ale z uformowanego już w roślinie macierzystej zawiązka, w tym przypadku pąka). Natomiast jeśli użyjemy jako eksplantatu pierwotnego np. kawałka blaszki liściowej albo wycinka wyrośniętej części korzenia i w wyniku hodowli otrzymamy pędy lub korzenie, to będziemy świadkami organogenezy, ponieważ eksplantat pierwotny nie zawiera zawiązków tych organów i muszą one powstawać od nowa. Wyróżnia się dwie główne formy organogenezy w zależności od ich wyniku - pędową (zwaną też kaulogenezą) i korzeniową (czyli ryzogenezę). Jeśli organogeneza poprzedzona jest powstaniem kalusa, to nazywa się ją pośrednią, natomiast o organogenezie bezpośredniej mówimy, gdy nowe organy powstają już w tkankach eksplantatu pierwotnego, bez wyraźnego namnożenia się kalusa. W niektórych kulturach zawiązki pędu i korzenia powstają w sposób skoordynowany, tworząc dwubiegunowe, drobne struktury przypominające roślinne zarodki, jakie normalnie rozwijają się w nasionach. Proces ten może zachodzić zarówno w hodowlach tkanek rozrodczych (generatywnych) jak i wegetatywnych (somatycznych) i nazywany jest embriogenezą. W naturalnych warunkach embriogeneza i rozwój nasion poprzedzone są zwykle zapłodnieniem. W kulturach in vitro bardzo często embriogenezę zapoczątkowuje nie proces zapłodnienia, ale odpowiednie warunki hodowli (przede wszystkim skład pożywki). Wszelkie zarodki rozwijające się z pominięciem procesu zapłodnienia nazywamy zarodkami apomiktycznymi. Zarodki takie, jeśli powstają z żeńskich komórek generatywnych (nie zapłodnionych!), nazywane są zarodkami partenokarpicznymi. Z męskich gamet (lub innych komórek męskiego gametofitu, którym u roślin kwiatowych są kiełkujące ziarna pyłkowe) powstają zarodki zwane androgenicznymi. Natomiast z komórek somatycznych tworzą się zarodki somatyczne, zwane też embrioidami. Z zarodków, w sprzyjających okolicznościach, powstają młode rośliny, które czasem (całkiem fachowo!) nazywane są roślinkami (ang. plantlets). To samo "czułe" określenie bywa stosowane w odniesieniu do wszelkich innych drobnych roślin regenerujących w warunkach in vitro. Jeśli zarodki pozostają na pożywce pobudzającej embriogenezę, to na ich powierzchni mogą się tworzyć potomne zarodki somatyczne, które bywają wtedy nazywane zarodkami przybyszowymi.
1.2 Pożywki
Wszystkie niezbędne do wzrostu substancje hodowany obiekt pobiera z pożywki (tylko kilka składników może być też, w nieznacznym stopniu, pobierane z atmosfery naczynia hodowlanego). Pożywka może mieć postać wodnego roztworu (płynna) albo galaretki (pożywka stała), otrzymanej dzięki dodaniu czynnika żelującego do roztworu substancji odżywczych. Jako substancje odżywcze pożywka zawiera zwykle następujące składniki (tab.1):
proste sole mineralne, dostarczające wszystkich niezbędnych pierwiastków (makro- i mikroelementów),
witaminy (zwłaszcza z grupy B),
jakiś cukier (zwykle sacharoza), stanowiący dla hodowanego obiektu główne źródło węgla
regulatory wzrostu
czasami jakiś aminokwas, rzadziej inne substancje, np. kwasy organiczne, przeciwutleniacze.
Hodowanemu obiektowi trzeba dostarczyć wszystkich niezbędnych pierwiastków. Uważa się, że roślinom do prawidłowego rozwoju potrzebne jest tylko kilkanaście spośród 90 występujących w przyrodzie pierwiastków. Przyjęło się dzielić je na organogeny (węgiel, wodór i tlen), makroelementy (tworzą powyżej 0,1% suchej masy roślin, a w pożywkach występują zwykle w stężeniu powyżej 0,5 mM) i mikroelementy wymagane w mniejszych ilościach (ich zawartość w roślinach może być ponad 1000x mniejsza niż makroelementów). Oczywiście podane zawartości makro- i mikroelementów odnoszą się do roślin oszczędnie odżywianych (nie przenawożonych). Jeśli rośliny hodowane są w środowisku o wysokiej zawartości np. cynku (lub innych przyswajalnych pierwiastków), to stężenie tego składnika w ich tkankach może wielokrotnie wzrosnąć, mimo to jednak nie będziemy cynku uważać za makroelement. Makroelementami są: N, P, K, Ca, Mg, S. Do mikroelementów natomiast zalicza się zwykle: Fe, Mn, Mo, Cu, Zn, B, Cl. Niektórzy fizjologowie roślin wyróżniają również pierwiastki śladowe, albo korzystne (w odróżnieniu od niezbędnych), zaliczając do nich np. Co, Na, Si, Al, V (zależnie od gatunku rośliny). W praktyce jednak granica pomiędzy mikroelementami, a pierwiastkami śladowymi jest trudno uchwytna i w dalszym opisie pierwiastki z obu grup będziemy nazywać mikroelementami. Makroelementy i mikroelementy z reguły dostarczane są do pożywki w postaci prostych soli mineralnych i pobierane są przez komórki w postaci jonów. Żelazo, ze względu na słabą przyswajalność dla roślin w postaci prostych jonów, zazwyczaj stosowane jest w formie chelatów, tj. soli kompleksowych, w których atom metalu połączony jest kilkoma wiązaniami kompleksowymi (tzw. wiązaniami kleszczowymi) z cząsteczką chelatora. Łatwo przyswajalnymi związkami żelaza są na przykład wersenian żelazowo-sodowy, cytrynian żelaza i winian żelaza. W tabeli 1 wśród składników kilku pożywek podano wersenian sodowy i siarczan żelaza, jednakże roztwory tych dwóch substancji łączy się przed dodaniem ich do pożywki, tak że do pożywki wprowadza się już właściwie produkt ich reakcji, tj. wersenian sodowo-żelazowy (NaFeEDTA). Tabela 1 podaje skład pożywek w bardzo często stosowanym formacie; ściślej jednak mówiąc, zawiera ona nie tyle skład pożywki, co zestaw substancji dodawanych do pożywki podczas jej przyrządzania. Rzeczywisty skład jest znacznie bardziej złożony ze względu na dysocjację soli i wzajemne oddziaływania poszczególnych składników podczas sporządzania pożywki, jej odkażania, przechowywania a także podczas hodowli.
Tabela 1. Skład wybranych pożywek do roślinnych hodowli in vitro
| MS | B5 | WPM | WH | Knop | |
|---|---|---|---|---|---|
| mM | mg/l | mM | mg/l | mM | |
| Źródła makroelementów (makropierwiastków) | |||||
| NH4NO3 | 20,6 | 1650 | -- | -- | 4,99 |
| KNO3 | 18,8 | 1900 | 25 | 2500 | -- |
| CaCl2 * 2H2O | 3 | 440 | 1 | 150 | 0,65 |
| MgSO4 * 7H2O | 1,5 | 370 | 1 | 250 | 1,5 |
| KH2PO4 | 1,25 | 170 | -- | -- | 1,25 |
| (NH4)2SO4 | -- | -- | 1 | 134 | -- |
| NaH2PO4 * H2O | -- | -- | 1,1 | 150 | -- |
| Ca(NO3)2 * 4H2O | -- | -- | -- | -- | 2,35 |
| KCl | -- | -- | -- | -- | -- |
| Na2SO4 | -- | -- | -- | -- | -- |
| K2SO4 | -- | -- | -- | -- | 5,68 |
| Źródła mikroelementów (mikropierwiastków) | |||||
| μM | mg/l | μM | mg/l | μM | |
| FeSO4 * 7H2O | 100 | 27,8 | 100 | 27,8 | 100 |
| Fe2(SO4)3 | -- | -- | -- | -- | -- |
| Na2EDTA * 2H2O | 100 | 37,3 | 100 | 37,3 | 100 |
| KI | 5 | 0,83 | 4,5 | 0,75 | -- |
| H3BO3 | 100 | 6,3 | 50 | 3 | |
| MnSO4 * 4H2O | 100 | 22,3 | -- | -- | |
| MnSO4 * H2O | -- | -- | 60 | 10 | -- |
| ZnSO4 * 7H2O | 30 | 8,6 | 7 | 2 | |
| Na2MoO4 * 2H2O | 1 | 0,25 | 1 | 0,25 | 1 |
| MoO3 | -- | -- | -- | -- | -- |
| CuSO4 * 5H2O | 0,1 | 0,025 | 0,1 | 0,025 | 1 |
| CoSO4 * 6H2O | 0,1 | 0,025 | 0,1 | 0,025 | -- |
| Składniki organiczne | |||||
| μM | mg/l | μM | mg/l | μM | |
| sacharoza | 87.600 | 30.000 | 58.400 | 20.000 | 58.400 |
| mio-inozytol | 555,1 | 100 | 555,1 | 100 | 555,1 |
| kwas nikotynowy | 4 | 0,5 | 8,1 | 1 | 4 |
| pirydoksyna-HCl | 2,4 | 0,5 | 4,9 | 1 | 2,4 |
| tiamina-HCl | 0,3 | 0,1 | 29,6 | 10 | 3 |
| pantotenian-Ca | -- | -- | -- | -- | -- |
| glicyna | 25 | 2 | -- | -- | 25 |
| cysteina-HCl | -- | -- | -- | -1 | |
| Odczyn (pH) | 5,6 - 5,8 | ||||
| agar [g/l] | 10 (8) | 8 | 8 | 8 | -- |
Analizę składu różnych pożywek utrudnia fakt, że ten sam pierwiastek może być dostarczany w postaci różnych soli, a ta sama sól może (w niektórych przypadkach) być stosowana w różnym stopniu uwodnienia. W związku z tym porównując pożywki warto rozpatrywać stężenia molowe (lub mM czy μM) poszczególnych składników. Wskazane jest też zestawienie tzw. bilansów jonowych pożywek, podsumowujących stężenia danego jonu niezależnie od tego w formie jakiego związku jest dostarczany (tabela 2).
Tabela 2. Bilanse jonowe wybranych pożywek do roślinnych kultur in vitro (zachęcamy czytelnika do uzupełnienia tabeli dla pożywek WPM i WH na podstawie danych z tabeli 1; pożywka Knopa - podobnie jak większość pozostałych - stosowana była w wielu wersjach; zwykle nie zawierała Fe, ale czasami dodawano je w formie siarczanu; zaznaczono to - w tej tabeli, podobnie jak w poprzedniej - liczbami w nawiasach)
| MS | B5 | WPM | WH | Knop | |
|---|---|---|---|---|---|
| [mM] | |||||
| NO3- | 39,4 | 25 | 6,7 | ||
| NH4+ | 20,6 | 1 | 0 | ||
| og.azot | 60 | 26 | 6,7 | ||
| PO43- itp. | 1,2 | 1,1 | 1,84 | ||
| K+ | 20 | 25 | 4,31 | ||
| Ca2+ | 3 | 1 | 4,23 | ||
| Mg2+ | 1,5 | 1 | 1,01 | ||
| SO43- | 1,731 | 2 | 1,01 (1,055) | ||
| Fe2+ | 0,1 | 0,1 | 0 (0,045) | ||
| I- | 0,005 | 0,004 | 0 | ||
| BO33- | 0,1 | 0,048 | 0 | ||
| Mn2+ | 0,1 | 0,06 | 0 | ||
| Zn2+ | 0,03 | 0,07 | 0 | ||
| Mo6+ | 0,001 | 0,001 | 0 | ||
| Cu2+ | 0,0001 | 0,0001 | 0 | ||
| Co2+ | 0,0001 | 0,0001 | 0 | ||
| Cl- | 6 | 2 | 0 |
Pożywka MS, opracowana w 1962 r. przez Murashigego i Skooga (czyt. [Muraszigego] i [Skuuga]) zaliczana jest do podłoży bogatych. Charakteryzuje się zwłaszcza znaczną zawartością azotu i to w obu podstawowych postaciach: azotanowej i amonowej. Pierwotnym przeznaczeniem pożywki MS były hodowle tkanek łodygi tytoniu (por. dodatek 2), ale obecnie jest ona wykorzystywana bardzo powszechnie do kultur in vitro bardzo różnych gatunków roślin i różnych ich fragmentów. Stosunkowo bogatą pożywkę stanowi też zestaw B5 Gamborga, opracowany początkowo w celu hodowli kalusów soi, a charakteryzujący się wysoką zawartością jonów azotanowych, a także witamin z grupy B. O wiele uboższy skład ma pożywka Knopa, opracowana z przeznaczeniem do wodnych i hydroponicznych upraw całych roślin, ale znajdująca czasem zastosowanie także do kultur in vitro, zwłaszcza niezbyt wymagających, na przykład do kiełkowania nasion lub zarodników. Również uboga jest pożywka WH opracowana przez White'a i stosowana głównie do hodowli fragmentów korzeni.
Pożywka WPM została opracowana (przez Lloyda i McCowna) w celu hodowli tkanek roślin drzewiastych (skrót pochodzi od ang. Woody Plant Medium). W porównaniu z pożywką MS podłoże WPM charakteryzuje się obniżoną ogólną zawartością soli, a zwłaszcza związków azotu i chloru. Osiągnięto to, zastępując - częściowo - chlorek wapnia azotanem, a azotan potasu (w całości) - siarczanem. W związku z tym pożywka WPM charakteryzuje się też wysoką zawartością siarki.
Witaminy dodawane do pożywek dla roślinnych kultur in vitro, należą przede wszystkim do grupy B. Zwykle są to: tiamina (B1), kwas nikotynowy (B3, PP), kwas pantotenowy B5, pirydoksyna (B6). Do witamin grupy B zalicza się również mio-inozytol (syn. mezo-inozytol), jakkolwiek w odróżnieniu od wszystkich powyższych witamin inozytol nie zawiera grupy aminowej i nie pełni funkcji prekursora żadnego koenzymu (natomiast jest ważnym składnikiem błony komórkowej). Z tych powodów inozytol pod względem biochemicznym trafniej określany bywa jako cyklitol (cykliczny, wielowodorotlenowy alkohol). Znacznie rzadziej od powyższych substancji dodaje się do pożywki witaminę B2 (ryboflawinę), kwas foliowy (witaminę Bc) oraz - nie zaliczany już do grupy B - kwas askorbinowy (czyli witaminę C). Ryboflawina, na świetle, znacznie przyspiesza utlenianie niektórych regulatorów wzrostu z grupy auksyn i czasami bywa właśnie do tego wykorzystywana. Ponieważ w wyniku takiej fotoprzemiany następuje również unieczynnienie samej witaminy B2, pożywki zawierające tę substancję są na świetle stosunkowo nietrwałe. Jako przeciwutleniacz bywa natomiast dodawany do pożywki kwas askorbinowy. Tę samą funkcję może spełniać aminokwas cysteina. Jeszcze częściej dodaje się do pożywek glicynę oraz kwas glutaminowy lub glutaminę, choć już nie w charakterze przeciwutleniaczy, ale po prostu jako aminokwasy przyspieszające wzrost niektórych obiektów. Prawie zawsze pożywka zawiera też jakiś cukier. Uważa się, że na rośliny dwuliścienne najkorzystniej działa zwykle sacharoza (w stężeniu 1-5%), natomiast do hodowli jednoliściennych lepsza może okazać się glukoza (3 - 4%). Dużo rzadziej dodaje się do pożywki fruktozę, maltozę, galaktozę, laktozę lub mannozę. Sporadycznie opisywano tkanki, np. sekwoi i bielma kukurydzy, które mają tak wysoką aktywność amylolityczną, że jako jedyne źródło węglowodanów wystarcza im polisacharyd - skrobia. Cukry pełnią funkcje zarówno substratu do przemian metabolicznych, jak i substancji decydującej o dostępności dla roślin wody z pożywki (tj. o potencjale osmotycznym pożywki). Wskazuje na to fakt, że w hodowlach kalusa tytoniu sacharozę można częściowo zastąpić rafinozą (cukrem nieprzyswajalnym dla tych komórek).
Wprowadzanie do pożywek cukrów, witamin i aminokwasów może trochę dziwić, bo wiadomo, że w naturalnych warunkach rośliny zadowalają się pobieranymi ze środowiska prostymi związkami mineralnymi. Trzeba jednak pamiętać, że nie wszystkie komórki roślinne przeprowadzają fotosyntezę i są samożywne. Poza tym w warunkach kultur in vitro wydajność fotosyntezy jest dodatkowo ograniczana szybkim wyczerpywaniem się dwutlenku węgla w dość szczelnie zamkniętym naczyniu hodowlanym (szczelne zamknięcie ma chronić hodowany obiekt przed zakażeniami i wysychaniem). Dostarczając hodowanym obiektom organicznych półproduktów, jakimi są cukry czy aminokwasy, możemy uzyskać zwiększenie częstości podziałów i przyspieszenie wzrostu. Z drugiej jednak strony właśnie z powodu dodawania do pożywki składników organicznych konieczne staje się prowadzenie wszystkich manipulacji w warunkach jałowości, ponieważ substancje te bardzo pobudzają rozwój drobnoustrojów. Utrudnia to trochę pracę i podnosi koszty, stąd podejmuje się czasem próby zakładania hodowli w pełni samożywnych, na ubogich, mineralnych pożywkach.
Bardzo charakterystycznymi składnikami pożywek, silnie wpływającymi na wynik hodowli są substancje zwane regulatorami wzrostu, albo fitohormonami. Ta druga nazwa sugeruje oczywiście, że chodzi o roślinne substancje, które pełnią funkcje podobne do zwierzęcych hormonów. W przeciwieństwie jednak do hormonów zwierzęcych, fitohormony często wytwarzane są nie w ściśle określonej tkance, ale w różnych tkankach. Często wyraźnie działają na tę tkankę w której są wytwarzane, podczas gdy hormony zwierzęce z reguły działają w tkankach innych od tych w których zostały wytworzone. Fitohormony mają niewielką swoistość działania - dają szeroki zakres efektów, np. auksyny m. in. pobudzają wydłużanie i podziały komórek, tworzenie tkanek przewodzących, tworzenie korzeni przybyszowych, wzrost owoców, hamują rozrost kątowych merystemów, przerywają spoczynek pąków, wpływają na determinację płci kwiatów, kontrolują starzenie się liści. Z powodu tych różnic między fitohormonami, a hormonami zwierzęcymi, termin regulatory wzrostu (i rozwoju) uważa się za nieco bardziej poprawny (lecz niezbyt poręczny).
Auksyny i cytokininy są najczęściej wykorzystywanymi do hodowli in vitro fitohormonami. Nieco rzadziej wykorzystuje się gibereliny, a także kwas abscysynowy. Sporadycznie dodawane są do pożywki jeszcze inne regulatory wzrostu (tab. 3c).
Auksyny występujące naturalnie w tkankach roślinnych (endogenne) są pochodnymi tryptofanu i zawierają dwupierścieniowy układ indolu. Ich przykładami są. kwas indolilo-3-octowy (IAA) i kwas indolilo-3-masłowy (IBA). Powyższe substancje są też łatwo dostępne w handlu i często dodaje się je do pożywek. Poza indolowymi auksynami w skład pożywek mogą wchodzić także ich syntetyczne analogi, w których indol zastąpiony jest innym układem pierścieniowym. Uważa się, że aby wykazywać działanie typowe dla auksyn substancja musi spełniać następujące warunki: a.) zawiera układ pierścieniowy z co najmniej jednym wiązaniem podwójnym, b.) zawiera łańcuchowy podstawnik sąsiadujący z wiązaniem podwójnym, c.) zawiera grupę karboksylową oddzieloną od układu pierścieniowego jednym lub dwoma atomami węgla. Są to zapewne warunki konieczne lecz nie wystarczające, ponieważ spełniają je również typowe aminokwasy jak tryptofan, fenyloalanina, tyrozyna, a mimo to nie mają aktywności auksynowej. Typowymi syntetycznymi auksynami są np. kwas α-naftylooctowy (NAA), kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy, dicamba (dikamba), picloram (pikloram). Na ogół auksyny syntetyczne mają większą trwałość i wyższą aktywność niż związki będące dokładnymi odpowiednikami auksyn endogennych. Niektóre auksyny syntetyczne (zwłaszcza 2,4-D, picloram, dicamba) bywają stosowane jako herbicydy (środki chwastobójcze; w tym celu używane są jednak w stężeniach kilkadziesiąt tysięcy razy wyższych niż w pożywkach do kultur in vitro - rzędu kilkudziesięciu gramów/l). Wśród substancji modyfikujących działanie auksyn wyróżnia się antyauksyny, tj. związki blokujące receptory auksyn, fitotropiny, tj. substancje blokujące ukierunkowany (polarny, dopodstawowy) transport auksyn, substancje przyspieszające rozpad auksyn i substancje hamujące ten proces (tab. 3). O tym jak różnorodne efekty morfologiczno-fizjologiczne mogą wywoływać auksyny wspominaliśmy już wyżej, szczególną uwagę warto jednak zwrócić na trzy rodzaje reakcji, uważane za najbardziej charakterystyczne dla auksyn:
pobudzanie wydłużania komórek (wzrostu wydłużeniowego)
pobudzanie podziałów komórkowych (we współdziałaniu z cytokininami, a czasami także giberelinami)
uaktywnianie niektórych jądrowych genów.
Działaniu auksyn towarzyszy też zakwaszenie środowiska (wypompowanie protonów z komórek). W niektórych przypadkach samo zakwaszenie środowiska, bez obecności auksyn wywoływało efekty typowe dla działania auksyn.
Typowymi wynikami działania cytokinin są: pobudzenie podziałów komórkowych oraz przeciwdziałanie procesowi starzenia się roślinnych organów. Cytokininy mogą także pobudzać kiełkowanie w ciemności nasion dodatnio fotoblastycznych (tj. wymagających światła do kiełkowania). W pobudzaniu podziałów komórkowych cytokininy współdziałają z auksynami. Pod niektórymi innymi względami są przeciwieństwem auksyn - powstają głównie w korzeniach (auksyny w wierzchołkach pędu), skąd wędrują ksylemem ku górze i pobudzają organogenezę pędową, pobudzają rozwój merystemów kątowych (hamowany przez auksyny), hamują wydłużanie się pędów. Również pod względem chemicznym cytokininy stanowią w pewnym stopniu przeciwieństwo auksyn - o ile, jak już wspominaliśmy, auksyny są kwasami organicznymi, to naturalne cytokininy są pochodnymi adeniny, a więc azotowej zasady. Przykładami takich naturalnie występujących w roślinach cytokinin są zeatyna i N6-izopentenyloadenina (2-iP, IPA). Pochodnymi adeniny, ale mającymi charakter wyłącznie cytokinin egzogennych (sztucznie wprowadzanych) są 6 benzyloaminopuryna (BAP) i kinetyna. Istnieje też grupa substancji o zupełnie innej budowie chemicznej (pochodnych mocznika), ale bardzo podobnym działaniu fizjologicznym, stąd nazywa się je związkami cytokininopodobnymi, albo po prostu mocznikowymi cytokininami. Ich przykładami są tidiazuron (thidiazurone = TDZ) i CPPU. Uwaga! Należy starannie odróżniać cytokininy (fitohormony, substancje niebiałkowe) od zwierzęcych białek zwanych cytokinami!
Wszystkie gibereliny natomiast zawierają złożony, czteropierścieniowy szkielet gibanu. Opisano dotychczas grubo ponad 100 związków tego typu, obejmujących kwas giberelinowy i jego różne pochodne. W praktyce tylko kilka substancji z tej grupy bywa czasami dodawane do pożywek, a najczęściej jest to kwas giberelinowy (GA3). Typowe wyniki działania giberelin, to pobudzenie wydłużania pędów (zwłaszcza u karłowatych mutantów), zahamowanie wzrostu korzeni bocznych, przerwanie spoczynku nasion, pąków i cebul, uaktywnienie enzymów katabolicznych w nasionach, pobudzenie kiełkowania pyłku i wydłużania łagiewek pyłkowych, wywoływanie partenokarpii (powstawania owoców z niezapylonych słupków), pobudzenie kwitnienia w warunkach nieindukcyjnych. Czasami stosuje się też substancje hamujące biosyntezę giberelin, np. paclobutrazol, ancymidol, które powstrzymując wzrost bulw, cebul, czy zarodków, pozwalają na zgromadzenie w nich większej ilości materiałów zapasowych, a także ułatwiają aklimatyzację roślin do niesprzyjających warunków hodowli ex vitro. W tym samym celu mogą być wykorzystywane retardanty, takie jak CCC (chlorek chlorocholiny i AMO 1618).
Przykłady regulatorów wzrostu i rozwoju, które obecnie (jeszcze?) są dużo rzadziej wykorzystywane w kulturach in vitro niż auksyny, cytokininy i gibereliny, podaje tabela 3C.
Warto podkreślić, że wynik działania fitohormonów w pożywce zależy od stanu fizjologicznego umieszczonej na niej tkanki i od występujących w komórkach fitohormonów endogennych. Regulatory wzrostu pobierane są z pożywki, co prowadzi do przejściowego podwyższenia wewnątrzkomórkowego stężenia tych substancji. Ten wzrost jest zwykle krótkotrwały ponieważ istnieją naturalne mechanizmy unieczynniania fitohormonów, częściowo w wyniku rozpadu (np. wspomnianego już utleniania indolowych auksyn), częściowo zaś w wyniku wbudowywania ich w konjugaty - mało aktywne fizjologicznie połączenia z innymi substancjami, np. cukrami. Ocenia się, że zaledwie ok. 1% głównych fitohormonów występuje w komórce w postaci wolnej, większa ich część natomiast tworzy konjugaty.
W niektórych doświadczeniach stosuje się tzw. pulsowe (tj. bardzo krótkotrwałe) działanie badanych składników pożywki. W tym celu eksplantat inkubuje się na pożywce zawierającej badany składnik przez okres zaledwie kilku do kilkudziesięciu godzin, po czym przenosi się na inną pożywkę. Czasami pulsowe oddziaływanie na rośliny jakiegoś składnika pożywki jest wynikiem nie szybkiego pasażu, ale niewielkiej trwałości składnika w pożywce lub tkance. Na przykład jeśli pożywka zawiera witaminę B2 oraz - w niewielkim stężeniu - IAA, a hodowla prowadzona jest na świetle, to auksyna będzie działać pulsowo nawet jeśli eksplantat pozostanie na tej pożywce przez kilka tygodni. Na świetle stosunkowo szybko rozpadają się także niektóre antybiotyki (np. tarcefoksym, tj. cephotaxim).
Tabela 3A. Charakterystyka fitohormonów. Auksyny*
| Efekty działania | Przykłady | Substancje modyfikujące działanie fitohormonu (wpływające na szybkość jego biosyntezy, transportu, rozkładu, lub blokujące receptory) |
|---|---|---|
| Masa mol. | ||
|
IAA (kwas indolilo-3-octowy) |
175,2 |
| IBA (kwas indolilo-3-masłowy) | 203,2 | |
| NAA (kwas naftalenooctowy) | 186,2 | |
| PAA (kwas fenylooctowy) | 136,2 | |
| 2,4-D (kw. 2,4- dichlorofenoksyoctowy) | 221,0 | |
| CPA (4-CPA, kw. p-chlorofenoksyoctowy) | 186,6 | |
| picloram (kwas 4-amino-3,5,6- trichloropikolinowy) | 241,5 | |
| dicamba (kwas 2-metoksy-3,6-dichlorobenzoesowy) | 221,0 | |
| 2,4,5-T (kwas 2,4,5-trichlorofenoksyoctowy) | ||
| NOA (kwas 2-naftoksyoctowy) |
* pojęcia najbardziej istotne i godne zapamiętania wyróżniono kolorem
Tabela 3B.Charakterystyka cytokinin i giberelin
| C y t o k i n i n y | Efekty działania | Przykłady | Substancje modyfikujące działanie fitohormonu (wpływające na szybkość jego biosyntezy, transportu, rozkładu, lub blokujące receptory) |
|---|---|---|---|
| Masa mol. | |||
|
zeatyna | 219,2 | |
| rybozyd zeatyny | 351,4 | ||
| 2iP (N6-izopentenylo-adenina) | 203,2 | ||
| izopentenyloadenozyna | 335,4 | ||
| BAP (6-benzyloaminopuryna) | 225,3 | ||
| kinetyna (KIN) | 215,2 | ||
| TDZ (thidiazurone) | 220,2 | ||
| CPPU (N-(2-chloro-4-pyridyl)-N'fenylomocznik) | 247,7 | ||
| 2hZ (dihydrozeatyna, DZ), Ad (bezwodna adenina), Adh (adenina trójwodna), AdS (siarczan adeniny, bezwodny), AdSh (siarczan adeniny dwuwodny), Ado (adenozyna), mT (meta-topolin) | |||
| G i b e r e l i n y |
|
kwas giberelinowy (GA3) | 346,4 |
| giberelina (GA4) | 332,4 | ||
| giberelina (GA7) | 330,0 |
Tabela 3C. Fitohormony rzadziej stosowane do kultur in vitro
| Przykłady | Efekty działania | Substancje modyfikujące działanie fitohormonu (wpływające na szybkość jego biosyntezy, transportu, rozkładu, lub blokujące receptory) |
|---|---|---|
| etylen |
|
|
| kwas abscysynowy (ABA) |
|
Fluridon i paclobutrazol hamują syntezę ABA; fluridon działa poprzez blokowanie wczesnego etapu syntezy karotenoidów, wydaje się jednak, że nie jest toksyczny |
| poliaminy: putrescyna (PUT) spermina spermidyna |
|
|
| brassinosteroidy ergosterol brassinolid (BL) dolichosteron |
|
|
| kwas jasmonowy (JA) i jego pochodne |
|
|
| metylowy ester (MeJA), kwas dihydrojasmonowy (HJA), kwas tuberonowy, glikozyd kwasu tuberonowego (TAG) kwas kukurbitowy (CA) |
||
| kwas salicylowy i jego acetylowana pochodna (aspiryna) |
|
|
Wszystkie wymienione dotąd składniki pożywek są substancjami o ściśle określonym składzie. Pożywki, które zawierają tylko takie substancje nazywa się syntetycznymi. Czasami wzbogaca się jednak pożywki niejednorodnymi substancjami, które mają bardzo złożony skład chemiczny, nie w pełni znany badaczowi i w niewielkim stopniu przez niego kontrolowany. Dodatkami takimi mogą być: hydrolizat kazeiny, peptony, ekstrakt drożdżowy, mleczko kokosowe, a sporadycznie mleczko kukurydziane, sok pomidorowy itp. Te mieszaniny są zwykle źródłem aminokwasów, witamin lub fitohormonów i gdy tylko to możliwe badacze dążą do zastępowania ich związkami chemicznymi w ściśle określonej postaci i ilości. Hydrolizat kazeiny i ekstrakt drożdżowy mogą pobudzać wzrost eksplantatów, ale bardzo ułatwiają też rozwój drobnoustrojów, stąd czasami dodawane są do pożywki po prostu dla sprawdzenia skuteczności odkażania materiału roślinnego użytego do zapoczątkowania hodowli. Hydrolizat kazeiny wzmacnia działanie cytokinin, zwłaszcza w obecności IAA.
Czynnikiem żelującym jest najczęściej agar, znacznie rzadziej agaroza, κ-karagen (kappa-karagen; ang. κ-karrageenan) itp. Agar jest substancją polisacharydową budującą ściany komórkowe morskich krasnorostów (Gelidium sp. i Gracilaria sp.), i zawierającą dwie frakcje: niepolarny polimer, zwany agarozą, oraz bardzo zmienną domieszkę polarnych podstawników. Można stosować typowy agar mikrobiologiczny, ale istnieją też w handlu agary przygotowywane specjalnie z myślą o kulturach roślinnych. W takim przypadku wytwórca gwarantuje, że jego produkt nie zawiera żadnych zanieczyszczeń hamujących wzrost roślin. Agary różnych producentów różnią się stopniem czystości i zdolnością żelowania (wytrzymałością mechaniczną galaretki otrzymanej z agaru o danym stężeniu). Przy zakładaniu niektórych, szczególnie wrażliwych hodowli (np. komórek glonu zawłotni) zaleca się przemywanie agaru przed dodaniem go do pożywki, ale takie środki ostrożności stosuje się bardzo rzadko.
Jakkolwiek agar znalazł bardzo szerokie zastosowanie jako czynnik żelujący, spotyka się też w handlu jego zamienniki. Należy do nich Phytagel (czyt. fajtadżel), polimer otrzymywany z bakterii, a zbudowany z reszt glukozy, ramnozy oraz kwasu glukuronowego. Agargel (czyt. agardżel) jest mieszaniną agaru i Phytagelu. Karagen jest polisacharydem złożonym z podjednostek galaktozowych. Otrzymywany jest ze ścian komórkowych krasnorostów. Gelrite (czyt. dżelrajt) jest polimerem otrzymywanym z bakterii Pseudomonas eloda.
Czynniki żelujące są zwykle dobierane jako substancje nieprzyswajalne dla roślin, a więc pełniące funkcje mechaniczne oraz osmotycznych regulatorów, ale nie wpływające bezpośrednio na metabolizm roślinnych komórek. Mimo to stężenie czynnika żelującego w pożywce może wywierać silny wpływ na wynik hodowli. Na przykład w hodowlach cienkich skrawków łodygi tytoniu, prowadzonych na poż. z 1% agarem, otrzymywano zawiązki kwiatów, a przy niższych stężeniach agaru - pąki wegetatywne. Czasami w kulturach in vitro dostrzec można zaburzenia związane z gospodarką wodną tkanek i dostępnością wody w pożywce. Typowym objawem takich zaburzeń jest nadmierne uwodnienie tkanek i związany z tym przejrzysty, szklisty wygląd (zaburzenia te nazywa się właśnie szklistością lub witryfikacją). Prawdopodobnie wynikiem nieprawidłowej gospodarki wodnej roślin jest obserwowane czasami zamieranie wierzchołków pędów. Rozwiązaniem takich problemów może być zmiana stężenia lub rodzaju środka żelującego, a także zapewnienie roślinom lepszej wymiany gazowej (np. poprzez zastosowanie odpowiednich pokrywek naczyń hodowlanych).
W przypadku gdy do pożywki nie dodaje się żadnego czynnika żelującego, a hodowany obiekt zanurzony jest w płynnej pożywce, konieczne jest stałe napowietrzanie hodowli, w przeciwnym razie komórki roślinne uległyby zatruciu produktami fermentacji. Najczęściej hodowle na płynnych pożywkach prowadzone są w kolbach stożkowych, a napowietrzanie pożywki uzyskuje się przez szybkie poruszanie kolb na specjalnych wstrząsarkach. Jeśli eksplantat użyty do takiej hodowli stanowi luźne skupisko komórek, np. kalus to wynikiem wstrząsania kultury może być jego rozpadnięcie się na pojedyncze komórki i drobne skupiska komórek. W ten sposób powstają tzw. hodowle zawiesinowe.
Dobór pożywki jest w dużej mierze sztuką opartą na metodzie prób i błędów. Ze względu na dużą liczbę składników pożywki i wynikającą stąd ogromną liczbę możliwych kombinacji ich stężeń, w większości prac badacze skupiają się na optymalizacji zawartości jednego do kilku składników, dla pozostałych dobierając wstępnie standardowe, niezmienne stężenia. Ponieważ o kierunku procesów rozwojowych przebiegających w kulturach in vitro decydują głównie fitohormony i (w mniejszym stopniu) witaminy, najczęściej optymalizuje się zawartość tych właśnie składników, natomiast dobór soli mineralnych można zwykle ograniczyć do porównania kilku "klasycznych" zestawów, np. składniki mineralne MS i B5. Porównując działanie kilku, np. czterech, stężeń wybranej auksyny i takiej samej liczby stężeń cytokininy (a więc w podanym przykładzie analizując działanie 16 wariantów pożywki) można wstępnie dobrać optymalny zestaw fitohormonów (warto potem powtórzyć doświadczenie dla innego rodzaju auksyny i cytokininy). Po znalezieniu zadowalającej kombinacji fitohormonów, można sprawdzić, czy dobrana wstępnie pożywka ma najodpowiedniejszy potencjał osmotyczny. W tym celu porównuje się hodowle na pożywkach zawierających zoptymalizowany zestaw fitohormonów i (ewentualnie) witamin, natomiast składniki mineralne w standardowym stężeniu, albo rozcieńczone 2 do 4-krotnie. Warto w końcu porównać także działanie kilku stężeń sacharozy (np. 1 - 6%) i ewentualnie innych cukrów.
Bardziej systematyczne podejście do optymalizacji składu pożywki stanowi system DeFossarda. Badacz ten zaproponował po 3 zestawy składników mineralnych, auksyn, cytokinin i innych substancji organicznych (zestaw bogaty, średni i ubogi). Każdy z nich łączy się z wszystkimi możliwymi kombinacjami pozostałych zestawów, uzyskując w ten sposób 3x3x3x3 = 81 pożywek do przeanalizowania. Po wybraniu najodpowiedniejszej, można rozważyć dalsze próby optymalizacji jednego do kilku składników uznanych za najważniejsze dla osiągnięcia założonego celu hodowli.
1.3 Odkażanie
W typowych kulturach in vitro panują warunki możliwie dokładnie kontrolowane. Hodowane rośliny wolne są od zakażeń, albo towarzyszy im tylko ściśle określony i celowo wprowadzony przez badacza rodzaj drobnoustrojów. Takie czyste, wolne od przypadkowych zakażeń kultury nazywamy aksenicznymi. Kultury in vitro powinny być akseniczne. Wymaga to odkażenia zarówno pożywki jak i materiału roślinnego używanego do założenia hodowli. Odkażaniu trzeba też poddać wszelkie narzędzia i naczynia z którymi eksplantaty mogą się stykać.
Najczęściej stosowaną metodą odkażania pożywek i wszelkiego rodzaju płynów (np. wody do płukania materiału roślinnego), a czasami także naczyń i narzędzi jest autoklawowanie. Zabieg ten polega na przetrzymywaniu materiału w parze wodnej o wysokiej temperaturze (zwykle ok. 120°C) i wysokim ciśnieniu (zwykle 1 atm, tj. 0,1 MPa, powyżej ciśnienia atmosferycznego). W wodnych roztworach przy podanym ciśnieniu zachodzi wrzenie w temperaturze 121°C, a więc jest to maksymalna temperatura do jakiej można doprowadzić te roztwory przy podanym ciśnieniu (oczywiście, w warunkach ciśnienia atmosferycznego nie dało by się ich podgrzać powyżej 100°C). Przyjmuje się, że w podanych warunkach w ciągu około 15 minut w autoklawowanym roztworze giną wszelkie drobnoustroje. Jednakże mija trochę czasu zanim cała objętość roztworu osiągnie zadaną temperaturę, stąd w praktyce czas autoklawowania wydłuża się, zależnie od objętości roztworu, do 20 - 30 minut (przy typowych objętościach, nie przekraczających 1 litra). Nie wszystkie substancje dają się podgrzać do 121°C - niektóre są zbyt nietrwałe i ulegają w takich warunkach rozkładowi. Jeśli pożywka zawiera takie wrażliwe składniki (zwane też termolabilnymi) to można odkazić je w niewielkiej objętości roztworu na zasadzie filtracji, a potem dodać do wyautoklawowanej i ochłodzonej pożywki. Stosuje się w tym celu filtry o porowatości poniżej 0,3 μm (zwykle 0,22 μm), które powinny zatrzymać wszelkie zarodniki grzybów i przetrwalniki bakterii. Same filtry, przed ich wykorzystaniem mogą być poddane autoklawowaniu, albo dostarczane są przez producenta gotowe do użycia, odkażone promieniami X lub gamma (promienie X, to promieniowanie elektromagnetyczne o długości fali 10-11 - 10-9 m, natomiast promienie γ to fale elektromagnetyczne o długości poniżej 10-11 m). Typowymi związkami termowrażliwymi, wymagającymi odkażania przez filtrację, są np. GA3, zeatyna, ABA, mocznik, niektóre witaminy. W pewnym stopniu termolabilna jest też sacharoza, która w wysokiej temperaturze częściowo rozpada się na fruktozę i glukozę. Podczas długotrwałego autoklawowania może dochodzić także do karmelizacji - powstają brunatne aldehydy, takie jak furfural, metylofurfural, metyloglioksal. Działają one niekorzystnie na wzrost tkanek, dlatego niektórzy autorzy zalecają żeby roztwory sacharozy odkażać przez filtrację (choć w praktyce, przy typowej, niezbyt wysokiej zawartości sacharozy w pożywce, bardzo rzadko się tego przestrzega).
Metalowe narzędzia, takie jak skalpele pincety, igły preparacyjne mogą być odkażane przez autoklawowanie, albo w roztworze podchlorynu sodu (podobnie jak materiał biologiczny - patrz niżej), najczęściej jednak odkaża się je przez zanurzenie w alkoholu (denaturacie), a następnie opalenie nad palnikiem gazowym albo w specjalnym elektrycznym sterylizatorze. W odniesieniu do termoodpornych pustych naczyń i narzędzi można też zastosować tzw. suchą sterylizację, polegającą na przetrzymaniu ich w wysokiej temperaturze w suchym powietrzu (co najmniej 3 godz. w 160°C, albo 2 godz. w 170°C, albo pół godz. w 180°C).
Do powierzchniowego odkażania materiału biologicznego (części roślin) wykorzystuje się substancje uwalniające chlor (podchloryn sodowy, podchloryn wapnia, chloraminę) lub tlen (wodę utlenioną), a znacznie rzadziej stosowane są: woda bromowa, chlorek rtęci, antybiotyki i in. Przed zamoczeniem fragmentów roślin w roztworze czynnika odkażającego wskazane jest umycie materiału pod bieżącą wodą, a w przypadku organów podziemnych, nawet ich kilkugodzinne płukanie. Należy także wyciąć ewentualne tkanki zamierające, dobierając do odkażania materiał możliwie najzdrowszy. Często odkażanie powierzchniowe zaczyna się od krótkiego (kilkudziesięciosekundowego) moczenia materiału w stężonym alkoholu etylowym (70% lub absolutnym). Ten wstępny etap może unieszkodliwić niektóre drobnoustroje, dodatkowo natomiast ma za zadanie usunąć, z powierzchni roślinnej tkanki, woski, tłuszcze i wszelkie inne hydrofobowe substancje, które mogłyby utrudnić dostęp właściwego czynnika odkażającego. Dla ułatwienia kontaktu roztworu odkażającego z powierzchnią komórek czy tkanek, do roztworu tego dodaje się też często niewielką ilość dowolnego detergentu (środka obniżającego napięcie powierzchniowe roztworu). Należy pamiętać, że z reguły czynnik odkażający działa w pewnym stopniu szkodliwie nie tylko na drobnoustroje, ale i komórki roślinne. Czas działania czynnika odkażającego i jego stężenie trzeba dobrać doświadczalnie, zależnie od gatunku rośliny i rodzaju tkanki (typowe wartości podano w tabeli 5). Niektóre substancje przeciwdrobnoustrojowe mogą być ponadto dodawane do pożywki i w ten sposób przez cały czas chronią kulturę przed zakażeniem. Są to przede wszystkim antybiotyki (nieskuteczne w odniesieniu do grzybów) oraz preparat inhibitora oddechowego pod handlową nazwą PPM (Plant Preservative Mixture), zwalczający zarówno bakterie jak i grzyby. Po odkażaniu powierzchniowym materiał kilkakrotnie płucze się jałową wodą destylowaną, po czym można przystąpić do wycinania właściwych eksplantatów pierwotnych i układania ich na pożywce.
W celu uniknięcia zakażeń drobnoustrojami unoszącymi się w powietrzu wszystkie manipulacje na jałowych materiałach, takie jak przelewanie pożywki, odkażanie materiału biologicznego, wycinanie eksplantatów, czy przeszczepianie hodowli, wykonywane są w tzw. komorze laminarnej (dokładniej - komorze z laminarnym nawiewem powietrza). Komora podczas pracy przemywana jest stale laminarnym (tj. niezaburzonym, równomiernym) strumieniem jałowego powietrza, co uniemożliwia wtargnięcie do jej wnętrza drobnych zanieczyszczeń unoszących się w powietrzu. Powietrze przepływające przez komorę jest jałowe, ponieważ przechodzi przez tzw. filtr absolutny czyli HEPA (ang. high efficiency particulate air filter) tj. filtr o porowatości 0,22 μm. Przepływ powietrza wymuszony jest przez elektryczny wentylator. Powietrze zasysane spoza komory przechodzi najpierw przez filtr wstępnego oczyszczania, po czym tłoczone jest przez filtr absolutny (stanowiący tylną lub górną ściankę wnętrza komory). Przed rozpoczęciem pracy w komorze jej wnętrze odkażane jest przez 20 - 30 minutowe naświetlanie promieniami nadfioletowymi (UV-C, o długości fali około 265 nm), a jednocześnie uruchamiany jest przepływ powietrza, dzięki czemu niektóre mikrozanieczyszczenia zostają po prostu z komory wydmuchane. Później blat komory odkażany jest przez przetarcie 50% alkoholem izopropylowym (albo 70% etanolem). Osoba rozpoczynająca pracę przy komorze laminarnej odkaża również ręce przez przetarcie ich alkoholem. Komora laminarna w znacznym stopniu pozwala na uniknięcie przypadkowych zakażeń, ale praca przy niej wymaga staranności i uwagi. Trzeba pamiętać, że główną barierą dla drobnoustrojów jest słabo wyczuwalny strumień powietrza; łatwo naruszyć tę osłonę wykonując szybkie, gwałtowne ruchy rąk, rozmawiając (zwłaszcza ustami zwróconymi do wnętrza komory), kichając, wkładając głowę do wnętrza komory, ustawiając w poprzek komory wysokie naczynia utrudniające przepływ powietrza. Znakomitym sposobem na "uzyskanie" zakażeń, pomimo stosowania komory laminarnej, jest też przenoszenie rąk nad jałowymi (w założeniach) naczyniami i narzędziami. Pomimo odkażania rąk alkoholem, na ich powierzchni pozostaje sporo drobnoustrojów, które opadając mogą zakażać materiały i narzędzia. Dlatego zanim sięgniemy do wnętrza komory po znajdujące się tam przedmioty, musimy zakryć albo wsunąć w głąb komory wszystkie naczynia i materiały, tak by uniknąć ich zakażania. Przedmiotów jałowych nie dotykamy nigdy palcami, ale wykorzystujemy wysterylizowane szczypczyki (pincety). Co kilka do kilkunastu minut powtarzamy sterylizację metalowych narzędzi.
Tabela 4. Skład wybranych pożywek do roślinnych hodowli in vitro
| czynnik odkażający | stężenie (%) | czas odkażania (min) | uwagi |
|---|---|---|---|
| podchloryn sodu | 0,5 - 2 | 5 - 30 | bardzo skuteczny; tworzy zupełnie klarowny roztwór; jego łatwo dostępnym źródłem może być chlorowy wybielacz do bielizny (np. płyn Ače - odpowiednio rozcieńczony!); występujące w nim dodatki zapachowe w żaden sposób nie szkodzą; dla zwiększenia trwałości tego roztworu jest on jednak silnie zalkalizowany; niektórzy badacze zalecają zobojętnienie go kwasem solnym przed użyciem do odkażania (nie wydaje się to jednak konieczne) |
| podchloryn wapnia | 9 - 10 | 5 - 30 | bardzo skuteczny, ale trudno rozpuszczalny w wodzie tworzy "mleczko" |
| chloramina T | 5 | do 30 | skuteczna; rozpuszczalna w wodzie, trwalsza niż podchloryny |
| nadtlenek wodoru | 10 - 12 | 5 - 15 | skuteczny; często stosowany do odkażania nasion roślin iglastych |
| woda bromowa | 1 - 2 | 2 - 10 | skuteczna |
| azotan srebra | 1 | 5 - 30 | dość skuteczne, ale zużyte roztwory są bardzo uciążliwe dla środowiska, dlatego stanowczo nie zalecane |
| chlorek rtęci | 0,1 - 1 | 2 - 10 | |
| antybiotyki | 4 - 50 mg/l | 30 - 60 | bardzo skuteczne w zwalczaniu bakterii; zupełnie nieskuteczne w zwalczaniu większości grzybów |
1.4 Fizyczne warunki hodowli
Zakładanie hodowli kończy się szczelnym zamknięciem naczynia hodowlanego (słoika, probówki lub kolbki), jego opisaniem (np. data założenia hodowli, jej "właściciel", rodzaj pożywki) i przeniesieniem do pokoju hodowlanego, tj. pomieszczenia w którym panują kontrolowane warunki temperatury i oświetlenia. Jakie warunki będą najodpowiedniejsze do hodowli zależy od jej obiektu i celu. Zwykle temperatura wynosi ok. 20 - 26°C, niższa temperatura (ok. 10°C) stosowana jest czasami, gdy badaczowi zależy na utrzymaniu materiału w warunkach in vitro bez konieczności częstego przeszczepiania (a więc przy zahamowaniu wzrostu rośliny). Intensywność światła jest zwykle mniejsza niż w uprawie całych roślin ( zwykle ok. 500 - 3000 lux, rzadko do ok. 10.000 lux por. Dodatek 3), a niektóre hodowle prowadzone są w całkowitej ciemności (zwłaszcza kultury kalusa i korzeni). Wynik hodowli może zależeć nie tylko od intensywności światła, ale też od jego barwy, jednakże standardem w kulturach in vitro jest stosowanie świetlówek dających światło "zimne" białe. Czasami stosuje się też specjalne jarzeniówki dla roślin, których światło wzbogacone jest w promienie długofalowe - czerwone - i krótkofalowe - fioletowe (rośliny, przeciwnie niż człowiek, najmniej wyczulone są na światło zielone - i w najmniejszym stopniu je wykorzystują. W tym samym celu jarzeniówki mogą być uzupełnione lampami sodowymi. Zazwyczaj stosuje się światło na przemian z okresami ciemności, zmieniającymi się w rytmie dobowym (fotoperiod). Typowy fotoperiod określa się jako 16:8h (16 godzin światła + 8 godzin ciemności). Jeśli jakaś kultura prowadzona jest stale w ciemności, to wszelkie niezbędne manipulacje i obserwacje można wykonywać włączając na chwilę słabe świetło zielone. Umieszczona w pokoju hodowlanym kultura powinna być systematycznie obserwowana, tak by mieć pewność, że nie rozwijają się w niej zakażenia (pleśnie, bakterie), kultura jest zdrowa i dobrze odżywiona. Co kilka dni do kilku miesięcy konieczne jest pasażowanie kultury - przeniesienie jej fragmentu na świeżą pożywkę. Najczęściej przeprowadza się ten zabieg co 4 tygodnie.
1.5 Rodowód hodowli roślinnych komórek, tkanek i organów
Pierwsze roślinne kultury in vitro zakładano w celach czysto poznawczych, a miało to miejsce już ponad sto lat temu. Do końca XIX wieku biolodzy zgromadzili wiedzę i umiejętności, bez których pomysł hodowania izolowanych komórek czy tkanek nie mógłby w ogóle przyjść badaczom do głowy. Biologiczne pojęcia komórek i tkanek znano już od niemal dwustu lat (dzięki doniesieniom Roberta Hooka i Marcello Malpighiego), ale dopiero w XIX wieku uświadomiono sobie powszechne występowanie tych struktur i ich znaczenie dla budowy wszystkich organizmów. Do połowy XIX w nie zdawano sobie nawet sprawy ze złożoności wewnętrznej budowy komórek. Dla cytologii i botaniki zaczynał się właśnie okres lawinowego rozwoju. Przed końcem stulecia opisano szczegółowo wszystkie podstawowe typy roślinnych komórek i tkanek. "Wiek pary i elektryczności" był też okresem rozwoju mikrobiologii. Dzięki doświadczeniom Ludwika Pasteura i innych pionierów tej dyscypliny, odrzucono teorię samorództwa i opracowano metody sterylizacji pożywek i prowadzenia czystych kultur drobnoustrojów. Już w 1881 r Robert Koch zaczął używać agaru do zestalania pożywek mikrobiologicznych. Justus von Liebig i Johan Knop opracowywali proste pożywki mineralne zastępujące glebę w uprawie roślin. Karol Darwin zaś (w chwilach wolnych od dociekań na temat ewolucji) sformułował hipotezę, zgodnie z którą wzrost roślinnych organów regulowany jest przez substancje typu hormonów. Rechinger w 1893 r stwierdził że cienkie skrawki przyrannej tkanki roślin zdolne są do wzrostu na wilgotnym piasku. Badaniem korelacji wzrostowych u roślin zajął się Vöchting i doszedł do wniosku, że zjawisko to można by lepiej zrozumieć, gdyby udało się obserwować wzrost wyizolowanych z roślin komórek. Myśl tę podjął Gottlieb Haberlandt, austriacki botanik, którego zwykle uważa się za właściwego "ojca" roślinnych hodowli tkankowych. W 1898 r założył hodowle komórek izolowanych z miękiszu palisadowego, skórki i włosków epidermalnych kilku roślin (jasnoty purpurowej - Lamium purpureum i hiacynta wodnego - Eichornia crassipes, śniedka - Ornithogalum, miodunki - Pullmonaria mollissima). Inkubował je na pożywce Knopa wzbogaconej sacharozą, asparaginą i peptonem. Obserwował wydłużanie się komórek palisadowych, zmiany ich kształtu, grubienie ścian komórkowych, pojawianie się skrobi w chloroplastach. Komórki pozostawały żywe przez kilka miesięcy, nie udało się jednak Haberlandtowi zmusić ich do podziałów. Wyniki tych pionierskich doświadczeń były więc niezbyt zachęcające, mimo to niezrażony badacz sformułował kilka hipotez - niezwykle śmiałych, inspirujących, a z dzisiejszej perspektywy wręcz proroczych. Zakładał mianowicie, że
izolowane komórki roślinne można będzie kiedyś utrzymywać w czystych hodowlach przez dowolnie długi czas;
nawet komórki somatyczne (niegeneratywne) można będzie pobudzić do tworzenia zarodków i odtwarzania całych roślin;
substancje pobudzające podziały zostaną otrzymane z tkanek merystematycznych i rozrodczych;
hodowle komórkowe staną się ważnym narzędziem w badaniach rozwoju roślin.
Minęło sporo lat zanim zdołano doświadczalnie wykazać słuszność wszystkich tych założeń. Do 1939 r otrzymano stale rosnące, wieloletnie hodowle roślinnych komórek i korzeni. Prowadzono też hodowle in vitro niedojrzałych zarodków. Ogromny postęp w roślinnych kulturach in vitro nastąpił po drugiej wojnie światowej, w dużej mierze dzięki wyizolowaniu i scharakteryzowaniu fitohormonów. Wtedy też stało się możliwe doświadczalne zademonstrowanie totipotencji pojedynczych komórek somatycznych, tj. ich zdolności do odtworzenia całego organizmu. Ta nadzwyczajna właściwość komórek, świadczy o tym, że każda (w zasadzie) komórka zawiera pełną informację genetyczną niezbędną do działania całego wielokomórkowego organizmu. Wykorzystuje się to praktycznie w metodach masowego rozmnażania roślin.
2.1 Mikrorozmnażanie
Mikrorozmnażanie, czyli rozmnażanie klonalne lub mikropropagacja, jest jednym z najważniejszych praktycznych zastosowań roślinnych czystych kultur. Termin ten oznacza wykorzystanie hodowli in vitro do masowego rozmnażania wegetatywnego roślin. Oczywiście cząstka "mikro-" w nazwie tej techniki odnosi się jedynie do ilości wyjściowego materiału biologicznego, natomiast liczba uzyskiwanych w ten sposób roślin potomnych może być bardzo wysoka. Poza wysokim współczynnikiem rozmnożenia (proporcją liczby uzyskanych roślin do wyjściowej liczby roślin użytych do rozmnażania) zaletą tej techniki jest bardzo duże wyrównanie genotypowe i fenotypowe produkowanych roślin, charakterystyczne zresztą dla wszystkich metod rozmnażania wegetatywnego. Wyrównaniu właściwości roślin sprzyja też fakt, że mikrorozmnażanie prowadzi się w dokładnie kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Ścisła izolacja hodowanego materiału od zewnętrznego środowiska, ułatwia otrzymanie roślin wolnych od patogenów i szkodników a także uniezależnia produkcję od miejscowych warunków geograficznych, klimatycznych itp. Z drugiej strony, praca w warunkach laboratoryjnych pociąga za sobą znaczne koszty produkcji, bo urządzenie laboratorium i jego eksploatacja są niewątpliwie wielokrotnie droższe w porównaniu z bardziej tradycyjnymi metodami produkcji roślin. W związku z tym technika ta wykorzystywana jest obecnie głównie w odniesieniu do roślin, których cena jednostkowa jest stosunkowo wysoka, na przykład roślin ozdobnych, drzew i krzewów owocowych lub leśnych, a także cennych materiałów hodowlanych i gatunków zagrożonych wyginięciem. Argumentem przemawiającym za wykorzystaniem tej techniki w produkcji sadzonek drzew leśnych jest fakt, że w odniesieniu do tych gatunków nie istnieją, albo mało skuteczne są prostsze metody rozmnażania wegetatywnego, natomiast kwitnienie i owocowanie tych roślin następuje dopiero gdy osiągną wiek kilkudziesięciu lat. Do mikrorozmnażania wystarczy pobrać niewielki fragment młodej siewki, gdy tylko stwierdzimy, że właśnie ta roślina wykazuje korzystne cechy fenotypowe. Ze względu na pracochłonnośc i wysokie koszty produkcji mikrorozmnażanie nie ma obecnie znaczenia w towarowym rolnictwie, bo przy masowości produkcji rolniczej cena pojedynczej rośliny musi być tu bardzo niska. Nawet jednak rośliny typowo rolnicze, np. ziemniak, bywają poddawane mikrorozmnażaniu, lecz nie przez rolników - producentów, ale hodowców. Dzięki temu z pojedynczych wyselekcjonowanych roślin można uzyskać zdrowy i wyrównany materiał mateczny, który potem dodatkowo powiela się metodami już bardziej tradycyjnymi i tańszymi.
Można wyróżnić następujące główne sposoby mikrorozmnażania:
hodowle wierzchołków pędów; jest to forma wzrostu uorganizowanego - wierzchołki pędów rosną, ukorzeniają się, po czym zostają adaptowane do warunków ex vitro i wykorzystane jako sadzonki); odcinek pędu stosowany w tej metodzie ma zwykle długość od kilku milimetrów do kilku centymetrów i zawiera zarówno merystem wierzchołkowy jak i towarzyszące mu zawiązki liści; możliwe jest też regenerowanie roślin ze znacznie mniejszych eksplantatów (długości poniżej 1 mm), zawierających niemal wyłącznie tkankę merystematyczną; jednakże izolowanie merystemów, a nie wierzchołków pędów, będąc techniką dość pracochłonną, stosuje się w nieco innych celach niż mikrorozmnażanie i omówione jest dokładniej w dalszej części tego skryptu
pobudzenie rozwoju pąków bocznych w hodowlach odcinków pędów to metoda bardziej uniwersalna i dużo częściej stosowana niż poprzednia; eksplantatami są węzły łodygi (odcinki z których wyrastają liście); u nasady liści występują uśpione pąki boczne (zwane też pachwinowymi), które w wyniku izolacji eksplantatu, a czasami także pod wpływem występujących w pożywce cytokinin, wznawiają wzrost i tworzą pędy, wykorzystywane następnie podobnie jak w poprzedniej metodzie; również ta metoda opiera się na zjawisku uorganizowanego wzrostu in vitro - komórki eksplantatu realizują program rozwojowy, który został im przypisany jeszcze w warunkach in vivo);
powstawanie pąków przybyszowych bezpośrednio w tkankach eksplantatu - o tej drodze regeneracji mówimy, gdy zawiązki pędów tworzą się w kulturze in vitro od nowa, w wyniku przeprogramowania komórek eksplantatu, tzn. eksplantat nie zawierał pąków; utworzyły się dopiero w kulturze in vitro; mamy tu więc do czynienia nie tylko ze wzrostem uorganizowanym, ale wcześniej jeszcze z organogenezą pędową (kaulogenezą); jeśli organogeneza nie jest poprzedzona powstaniem kalusa nazywamy ją bezpośrednią; poza kaulogenezą, drugą podstawową formą organogenezy jest ryzogeneza, czyli tworzenie się przybyszowych korzeni; o ile jednak z pędu zazwyczaj łatwo i szybko daje się odtworzyć pełną roślinę, to z korzenia udaje się to dosyć rzadko, dlatego ryzogeneza praktycznie nie bywa stosowana do mikrorozmnażania roślin
powstawanie pąków przybyszowych z komórek kalusa - organogeneza pędowa pośrednia; zjawisko podobne do opisanego w poprzednim punkcie, ale w tym przypadku komórki eksplantatu najpierw odróżnicowują i namnażają się, wytwarzając kalus, a dopiero niektóre komórki kalusa przystępują do odtwarzania rośliny;
powstawanie zarodków somatycznych bezpośrednio w tkankach eksplantatu - bezpośrednia somatyczna embriogeneza (to bardzo pożądany sposób rozmnażania roślin - odpada konieczność ukorzeniania pędów; zarodki tworzą się od razu, nie trzeba czekać na rozwój kalusa; zwykle jednak nie jest tak pięknie - częściej udaje się zastosować metodę poniższą)
powstawanie zarodków somatycznych z komórek kalusa - somatyczna embriogeneza pośrednia (wadą tej metody jest obserwowana często niestabilność genetyczna komórek kalusa; zachodzą w nich spontanicznie zmiany, które powodują, że regenerowane w ten sposób rośliny nie są tak wyrównane jak można by oczekiwać po metodzie wegetatywnego rozmnażania).
Przedstawiona tu terminologia nie jest całkiem powszechnie uznawana. Niektórzy badacze za mikrorozmnażanie uznają tylko techniki wymienione w punktach 1-2. W ujęciu nieco mniej rygorystycznym do mikrorozmnażania zalicza się wszystkie powyższe techniki, poza opartymi na somatycznej embriogenezie (p. 5, 6). Niemniej, na naszych zajęciach będziemy trzymać się powyższego schematu (podążając z grubsza za sugestią prof. Murashigego) i do mikrorozmnażania zaliczać będziemy wszystkie metody wymienione w punktach 1-6.
Wykorzystując wierzchołki pędów i pąki kątowe do mikrorozmnażania roślin nie oczekujemy od komórek eksplantatu jakiejś radykalnej zmiany zachowania, w stosunku do tego jakie wykazywały in planta, czyli w hodowanej ex vitro, nie uszkodzonej roślinie. Wprawdzie pąki kątowe w warunkach in vivo są zwykle uśpione, ale już sam fakt oddzielenia ich od wierzchołka łodygi wyzwala je spod wierzchołkowej dominacji (narzuconej przy pomocy auksyn transportowanych w dół łodygi) i pobudza ich rozwój. Dlatego do rozmnażania roślin przy pomocy wierzchołków pędów i pąków pachwinowych wystarczyć mogą pożywki nie zawierające żadnych fitohormonów. Z drugiej jednak strony, dodanie do pożywki fitohormonów, zwłaszcza cytokinin, przyspiesza przełamywanie dominacji wierzchołkowej, nasila rozgałęzianie się pędów i zwiększa współczynnik rozmnożenia. U niektórych gatunków od samej cytokininy korzystniej działa jej kombinacja z auksyną, pobudzającą wydłużanie się pędów. Również giberelina GA3 oraz kwas ferulowy mogą sprzyjać namnażaniu pędów i ich prawidłowej budowie (długości międzywęźli, wielkości liści).
Spośród auksyn, w mikrorozmnażaniu roślin opartym na hodowlach wierzchołków pędów i pąków kątowych, a także na organogenezie pędowej, najczęściej wykorzystuje się IAA, NAA lub IBA. 2,4-D natomiast okazuje się zwykle zbyt silną auksyną do tego celu i zamiast tworzenia się pędów pobudza wzrost kalusa (natomiast w metodach opartych na somatycznej embriogenezie, najczęściej wykorzystywaną auksyną jest właśnie 2,4-D, patrz niżej).
Dwie pierwsze z omawianych tu metod mikrorozmnażania nie różnią się istotnie od tradycyjnego rozmnażania roślin przy pomocy sadzonek wierzchołkowych i odkładów (jakkolwiek zadowalają się znacznie mniejszą ilością materiału wyjściowego). Wydaje się, że wszystkie gatunki rozmnażane tymi tradycyjnymi metodami nadają się też do rozmnażania in vitro za pomocą wierzchołków pędów lub pąków kątowych. Wśród roślin do rozmnażania których te metody rzeczywiście są wykorzystywane w produkcji na dużą skalę, można wymienić m. in. maliny, wiśnie, śliwy, jabłonie, winorośl, a także dalie, gerbery, storczyki, ziemniaki i wiele innych. U tych gatunków z jednego eksplantatu można w ciągu roku "wyprowadzić" tysiące roślin potomnych. Co kilka tygodni (zwykle co miesiąc) pędy odcinane są od tkanki macierzystej i pasażowane na świeżą pożywkę namnażającą.
Pędy ziemniaka, zwłaszcza gdy są hodowane na pożywce o niskim potencjale osmotycznym (zawartości sacharozy podwyższonej np. do 60 g/l), w niskiej temperaturze (ok. 10°C) i przy krótkim dniu (8 godzinnym) mogą tworzyć tzw. mikrobulwy, czyli bulwy o średnicy zaledwie kilku milimetrów. Tworzenie się mikrobulw nazywamy tuberyzacją in vitro (od ang. tuber - bulwa) i w pracach nad mikrorozmnażaniem roślin traktujemy zwykle jako proces pożądany. Dodatkowo można go pobudzić dodając do pożywki pochodną kwasu jasmonowego zwaną kwasem tuberonowym. Mikrobulwy, można wysiewać do gleby jak nasiona, a przy tym są znacznie wygodniejsze w manipulacji i odporniejsze na uszkodzenie niż młode sadzonki.
Organogeneza pędowa, bezpośrednia lub pośrednia, pozwala na uzyskanie jeszcze większego współczynnika rozmnożenia niż hodowle wierzchołków pędów czy pąków kątowych. Pod wpływem odpowiedniego zestawu fitohormonów, obejmującego w przypadku tej metody zazwyczaj zarówno cytokininę, jak i auksynę, niektóre komórki ekskplantatu lub namnożonego na nim kalusa wytwarzają zawiązki pędów - pąki. Czasami w obrębie jednego eksplantatu może się ich tworzyć kilkadziesiąt. Tak bywa na przykład u popularnych roślin ozdobnych z rodziny ostrojowatych, takich jak sępolia (Saintapaulia), syningia (Sinningia) czy skrętnik (Streptocarpus), u których łatwo jest pobudzić powstawanie pędów przybyszowych w niewielkich (kilkumilimetrowych) fragmentach blaszki liściowej i ogonków liściowych. Znamienne, że rośliny te łatwo, choć nie aż tak wydajnie, dają się rozmnażać z liści również w warunkach ex vitro. Rośliną bardzo wydajnie dającą się rozmnażać w ten sposób jest też tytoń, ale takich przykładów można znaleźć dużo więcej. Już pod koniec ubiegłego wieku szacowano, że lista roślin, dla których opublikowano metody mikrorozmnażania (którąkolwiek z powyższych metod) przekroczyła sześćset gatunków i obejmowała praktycznie wszystkie rośliny ważne gospodarczo. U roślin cebulowych, np. lilii, tulipanów, jako eksplantaty wykorzystuje się często kawałki liści spichrzowych, a wynikiem hodowli jest tworzenie się drobnych, kilkumilimetrowych cebulek - mikrocebul.
Wynik hodowli zależy od właściwości biologicznych rośliny, składu pożywki (a zwłaszcza rodzaju i stężeń fitohormonów) a także warunków hodowli. Za wzorcowe, "klasyczne", uważa się dziś badania wpływu auksyn i cytokinin na hodowle tkanek tytoniu, przeprowadzone przez Skooga. W doświadczeniach tych okazało się, że najszybsze tworzenie kalusa następowało przy umiarkowanych, niezbyt wysokich stężeniach auksyn i cytokinin. Zwiększenie zawartości auksyn sprzyjało tworzeniu się przybyszowych korzeni, a podwyższenie zawartości cytokinin pobudzało organogenezę pędową.
W procedurach mikrorozmnażania roślin w oparciu o wierzchołki pędów, pąki kątowe i organogenezę pędową wyróżnić można kilka typowych etapów (nie wszyscy autorzy wyodrębniają punkty pierwszy i ostatni; pozostałe natomiast etapy są na tyle jednoznacznie rozumiane, że producenci ogłaszają krótko np. "sprzedam rośliny po III etapie mikrorozmnażania"):
Dobór materiału roślinnego
Założenie czystej (aksenicznej) kultury
Namnażanie pędów
Przygotowanie pędów do wykorzystania w warunkach ex vitro
wydłużanie
ukorzenianie
(ewentualne wstępne hartowanie)
Przesadzenie roślin do gleby, hartowanie
Na etapach oznaczonych tu numerami 0 - 1 uwzględnia się wszystkie kryteria, o których wspominaliśmy przy omawianiu ogólnych zasad doboru eksplantatu (por. rozdz. 1), a ponadto zwraca się uwagę na te cechy biologiczne i użytkowe roślin matecznych, które odziedziczone przez rośliny potomne, będą wyznaczać ich wartość handlową (np. barwa i wielkość kwiatów, pokrój rośliny). W celu sprawdzenia skuteczności odkażania można niektóre eksplantaty umieścić na typowych podłożach mikrobiologicznych, które lepiej niż pożywki dla roślin pobudzają wzrost drobnoustrojów i pozwalają na szybsze ich wykrycie. Badanie obecności charakterystycznych drobnoustrojów w eksplantatach, albo nawet w roślinach matecznych, z których eksplantaty dopiero będą izolowane, nazywa się czasem z angielska indeksacją (ang. indexing for pathogens), zwłaszcza jeśli wykorzystuje się w nich pożywki różnicujące, metody biochemiczne, albo rośliny wskaźnikowe, dające bardzo charakterystyczne, silne reakcje na obecność jakiegoś drobnoustroju i pozwalające na jego identyfikację.
Na etapie namnażania otrzymuje się bardzo dużą liczbę drobnych (kilkumilimetrowych) zawiązków pędów. Przenosząc je na pożywkę zawierającą znacznie mniejsze stężenia regulatorów wzrostu, lub wcale nie zawierającą fitohormonów, zatrzymuje się proces namnażania pędów, a pobudza ich wzrost. Czasami na etapie wydłużania pędów wykorzystuje się pożywki zawierające węgiel aktywny, który pochłania pozostałości fitohormonów przenoszone wraz z materiałem roślinnym z poprzedniego etapu hodowli. Ukorzenianie pędu i jego wzrost mogą zachodzić na tej samej pożywce. W razie potrzeby ukorzenianie może być pobudzane przez dodatek niewielkiej ilości auksyny takiej jak IAA, IBA lub NAA.
Konieczność hartowania regenerowanych in vitro roślin wynika z dużej różnicy pomiędzy warunkami środowiska in vitro i ex vitro. Przede wszystkim chodzi tu wilgotność powietrza (w kulturach in vitro często bliską 100%) oraz obecność cukru i innych związków organicznych w pożywce, przy ich niemal zupełnym braku w glebie. Zabieg hartowania, a nawet ukorzeniania, może być przeprowadzony (a zwłaszcza kontynuowany) już po przesadzeniu roślin do gleby. Przez okres 1 - 2 tygodni utrzymywana jest wysoka wilgotność powietrza (rośliny mogą być osłonięte tunelami foliowymi) i dość niskie natężenie światła (zacienienie). Później stopniowo usuwa się osłony zmuszając rośliny do adaptowania się do warunków właściwej uprawy ex vitro.
Metodą mikrorozmnażania, która powinna dać się stosunkowo łatwo automatyzować, a więc okazać się stosunkowo mało pracochłonną, tanią, jest wykorzystanie somatycznych zarodków. Skoro mówimy o zarodkach somatycznych, to dla jasności sprawy uzgodnijmy od razu jakie w ogóle rodzaje roślinnych zarodków będziemy wyróżniać. Ogólnie dzieli się je na zygotyczne i niezygotyczne czyli apomiktyczne. Somatyczne należą oczywiście do tej drugiej grupy. Do zarodków apomiktycznych poza somatycznymi, zalicza się jeszcze zarodki partenogenetyczne, powstające z żeńskiego gametofitu, a zwłaszcza należącej do niego komórki jajowej i androgeniczne, powstające z mikrospory (niedojrzałego ziarna pyłku) lub męskiego gametofitu (kiełkującego ziarna pyłku). Wszystkimi zarodkami innymi niż somatyczne będziemy się zajmować w dalszej części tego podręcznika. Dodajmy, że czasami obserwujemy zarodki somatyczne wyrastające na powierzchni innych, starszych zarodków, somatycznych lub zygotycznych. Taki szczególny rodzaj zarodków somatycznych nazywamy przybyszowymi lub dodatkowymi.
Zarodki somatyczne i zygotyczne są oczywiście podobne nie tylko z nazwy, ale wykazują podobną budowę i podobne przemiany rozwojowe - pojedyncza komórka, drobne agregaty komórkowe, zarodek kulisty (globularny), sercowaty, torpedowaty (hodowcy roślin czasem mówią "stadium torpedo" bo torpeda to po angielsku właśnie torpedo) i stadium liścieniowe. W wyniku wzrostu, zarodki przekształcają się ostatecznie w rośliny. Wydaje się, że somatyczną embriogenezę (SE) można wywołać u wszystkich gatunków roślin, ale widoczne są duże różnice gatunkowe i genotypowe w zdolności do SE. Stosunkowo łatwo uzyskuje się to zjawisko np. u marchwi, kalafiora selera, rzepaku, cytryny, kawy, a z gatunków rolniczych - lucerny.
Somatyczną embriogenezę pobudzają warunki hodowli, a mianowicie obecność auksyny (zwłaszcza silnych, syntetycznych auksyn jak 2,4-D i pikloram), odpowiedni (wysoki) stosunek azotu amonowego do azotanowego, dość wysokie pH (ok. 7). W niektórych hodowlach indukująco może działać obecność określonych aminokwasów (zwłaszcza kwasu glutaminowego i proliny) lub kwasów organicznych. Również obecność cytokininy sprzyja zapoczątkowaniu SE, a szczególnie skuteczna pod tym względem bywa zeatyna. Działanie egzogennej auksyny konieczne jest tylko we wstępnej fazie somatycznej embriogenezy. Później (po okresie kilku dni do miesiąca) hodowle przenoszone są na pożywkę, która albo auksyny nie zawiera, albo zawiera jej dużo mniej niż pożywka indukująca (tę drugą pożywkę nazywamy różnicującą). Na pożywce indukującej powstają masy komórek prazarodkowych, tzw. PEMy (od ang. proembryogenic masses), które niewiele różnią się wyglądem od zwykłego kalusa i tworzą tzw. kalus embriogenny czyli zarodkotwórczy (po angielsku zarodkotwórczy to embryogenic, stąd w polskich tekstach pojawia się też czasem słowo "embriogeniczny", znaczące dokładnie to samo co embriogenny). Gdyby te skupiska komórek nie zostały następnie przeniesione na pożywkę różnicującą, to pozostałyby w formie embriogennego kalusa, powiększającego rozmiary, lecz nie tworzącego uorganizowanych struktur.
Tylko niektóre komórki eksplantatu reagują na działanie czynników indukujących SE. Komórki te nazywamy kompetentnymi. Inne w tych samych warunkach wytwarzają tylko kalus, czy zawiesinę, albo w ogóle nie reagują. Kompetentymi okazują się na ogół komórki epidermalne lub położone tuż pod nimi subepidermalne, a także komórki powierzchniowej strefy kalusa, lub hodowane pojedynczo komórki parenchymatyczne. Komórki embriogenne mają charakterystyczną budowę - zwykle są stosunkowo drobne, izodiametryczne, zawierają dużo cytoplazmy i duże jądro komórkowe, a wakuole - drobne , silnie barwiące się błękitem toluidyny, a więc zawierające dużo białka. W chloroplastach tych komórek można dostrzec ziarna skrobi, natomiast zanika gradient protonowy, co sugeruje, że fotosynteza ulega w nich zahamowaniu.
Somatyczna embriogeneza jest procesem bardzo wszechstronnie badanym, co wynika zarówno z jej znaczenia praktycznego, jak i poznawczego. W tym procesie wyjątkowo wyraźnie przejawia się rozwojowa elastyczność i totipotencja komórek. Podczas SE zachodzą podobne przemiany jak w rozwoju zarodków zygotycznych, ale są łatwiej dostępne obserwacji, bo nieukryte pod tkankami nasienia i owocu. Nagromadzające się stopniowo obserwacje sugerują, że SE może być ściśle powiązana z reakcjami roślinnych tkanek na różnorodne czynniki stresowe.
Działanie egzogennej auksyny polega prawdopodobnie na zakłóceniu metabolizmu auksyny endogennej i nagromadzaniu się w komórkach dużych ilości IAA. Poza omówionymi wyżej, dokładnie udokumentowanymi induktorami SE, jako czynniki pobudzające ten proces opisywano sporadycznie metale ciężkie i wysoką temperaturę, a także egzogenny kwas abscysynowy i betainę - substancje, które rośliny same wytwarzają, gdy znajdą się w warunkach stresu. Wytwarzane w embriogennych komórkach cząsteczki RNA kodują tzw. białka związane z patogenezą i białka szoku termicznego. Wśród białek intensywnie wydzielanych przez embriogenne komórki wykrywa się chitynazy, glukanazy i białka osmotynopodobne. Bardzo charakterystyczne dla komórek embriogennych jest powlekanie ścian komórkowych kalozą i nagromadzanie w ścianie komórkowej białek arabinogalaktanowych (AGP). Białka te zawierają glukozaminę i ich obecność wyjaśnia zapewne uaktywnianie się chitynaz podczas embriogenezy. Do niedawna zjawisko to było zupełnie niezrozumiałe, gdyż wydawało się, że w roślinach nie ma żadnego substratu dla tych enzymów. Okazuje się jednak, że białka AGP "nadtrawione" chitynazami wykazują zwiększoną zdolność do nadawania komórkom stanu kompetencji i indukowania SE. Dodając AGP do pożywki z kulturami, które po dłuższym okresie hodowli utraciły zdolność reagowania na typowe induktory SE, przywrócono tym kulturom kompetencję rozwojową. Poszukując markerów molekularnych SE, wykryto gen SERK, kodujący kinazę receptorową somatycznej embriogenezy (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase). ). Jego uaktywnienie się jest najwcześniejszym znanym obecnie objawem nabycia przez komórki somatyczne zdolności (kompetencji) do rozwoju zarodkowego.
W niektórych doświadczeniach obserwowano, że pierwszy podział komórki embriogennej zachodzi w szczególny sposób, przypominający podział zygoty, a mianowicie jest niesymetryczny - jego wynikiem są dwie komórki różniące się wielkością. W rozwoju zarodków zygotycznych komórka mniejsza, określana jako wierzchołkowa, po kilku kolejnych podziałach przekształca się w zarodek właściwy, a komórka większa, zwana podstawową przekształca się w wieszadełko, twór ułatwiający odżywianie zarodka właściwego. Wieszadełko wraz z drobnym, mało jeszcze zróżnicowanym zarodkiem właściwym, nazywane jest łącznie prazarodkiem. Podobnie w somatycznej embriogenezie obserwuje się, jak wspomniano wyżej, komórki zwane prazarodkowymi, i powstające z nich odpowiedniki zarodka właściwego. Typowego wieszadełka w somatycznej embriogenezie nie daje się zwykle zaobserwować.
Zarodki somatyczne można masowo wytwarzać w płynnej pożywce, w specjalnych bioreaktorach (fermenterach). Otrzymane jednak w warunkach in vitro zarodki są zbyt delikatne, aby je po prostu wysiać do gleby, tak jak się to robi ze zwykłymi nasionami. Dlatego najpierw zarodki te poddawane są zabiegom przygotowawczym, np. łagodnemu suszeniu albo otoczkowaniu - umieszcza się je więc jakby w kapsułkach z substancji ochronnej, takiej jak alginian wapnia lub potasu, czy syntetyczne żywice (np. glikol polioksyetylenowy). Tak zabezpieczone zarodki somatyczne nazywane są sztucznymi nasionami, albo nasionami syntetycznymi, albo somatycznymi. Układem nieco prostszym od kapsułek z pojedycznymi zarodkami jest tzw. wysiew cieczowy (ang. fluid drilling), przy którym zarodki są po prostu zawieszone w pewnej objętości gęstej ochronnej cieczy i wraz z nią wylewane są do gleby.
Wyróżnia się więc kilka rodzajów sztucznych nasion:
odwodnione nieotoczkowane
odwodnione otoczkowane
uwodnione otoczkowane (oczywiście ich znaczne uwodnienie nie jest zamierzonym wynikiem jakiegoś zabiegu technologicznego, ale efektem hodowli na pożywce zoptymalizowanej do szybkiego wzrostu kultury)
uwodnione nie otoczkowane indywidualnie, ale stosowane w układzie siewu cieczowego.
Nasiona typu (c) i (d) są metabolicznie aktywne, a więc oddychają, zużywają tlen i złożone metabolity, a nagromadzają produkty oddychania; z tego powodu są nietrwałe i wkrótce po wytworzeniu powinny być wysiane do gleby. Natomiast nasiona typu (a) i (b) dają się długo przechowywać, bo w wyniku odwodnienia komórek ich metabolizm jest zahamowany, ale sam proces osuszania powoduje spadek żywotności wielu zarodków. Tak więc otrzymanie wysokiej jakości sztucznych nasion z zarodkami odwodnionymi jest trudne, gdy jednak ta sztuka się uda, nasiona takie można przechowywać stosunkowo długo. Czasami podobnym zabiegom ochronnym poddaje się inne niż zarodki fragmenty roślin, które wysiane do gleby mogą przekształcić się w kompletne rośliny. Mogą to być np. mikrobulwy, mikrocebule, pąki. Takie laboratoryjnie wytworzone "rozmnóżki" roślin można również nazwać sztucznymi nasionami. Uogólniając więc nieco, możemy przyjąć, że sztuczne nasiona to zarodki somatyczne lub inne drobne eksplantaty (mikrobulwy, mikrocebule, pąki) otrzymane in vitro i przygotowane do wysiania do gleby (zabezpieczone przed uszkodzeniami). To przygotowanie polega najczęściej na otoczkowaniu substancją zwiększającą mechaniczną wytrzymałość eksplantatów. Funkcje ochronne otoczki można wspomagać wysycając ją fungicydami, fitoncydami lub odpowiednio wybiórczymi herbicydami. Czasami rozważa się też dodawanie substancji zapasowych do otoczki, dzięki czemu pełniłaby nie tylko rolę okrywy nasiennej, ale także sztucznego bielma, odżywiającego zarodek podczas wzrostu. Wzrost w pełni wykształconego zarodka, wznowiony po przerwaniu spoczynku, nazywa się oczywiście kiełkowaniem. Tego terminu unika się jednak gdy mowa o somatycznych zarodkach i sztucznych nasionach, głównie dlatego, że nasiona te z reguły nie przechodzą spoczynku więc faza powstawania zarodka (wzrostu zarodkowego) i jego przekształcania się w siewkę (kiełkowania) nie dają się tu wyraźnie rozgraniczyć. Zamiast więc o kiełkowaniu sztucznych nasion mówi się zwykle o ich konwersji (ang. conversion) czyli przekształcaniu się w rośliny. Przekształcanie się zarodka somatycznego (lub sztucznego nasienia) w prawidłowo zbudowaną roślinę nazywamy konwersją. Częstość konwersji (w %) jest podstawowym wskaźnikiem jakości sztucznych nasion.
Próby przemysłowej produkcji sztucznych nasion zaczęto podejmować w 80-tych latach ubiegłego stulecia. Obecnie produkowane są m. in. sztuczne nasiona marchwi, selera, lucerny, papryki, winorośli, kalafiora, soi i ryżu. Mimo to do dziś wykorzystuje się je raczej sporadycznie. Jedną z najważniejszych przyczyn są wysokie koszty produkcji. Produkcja w warunkach sterylnych, na sztucznych pożywkach, nawet gdy prowadzona jest w wielkiej skali, w instalacjach przemysłowych, nie może konkurować pod względem ceny z pozyskiwaniem nasion zygotycznych metodami tradycyjnej uprawy polowej. Nie do końca zostały też rozwiązane problemy techniczne, dotyczące wydajności indukcji somatycznej embriogenezy i synchronizacji tego procesu, co jest warunkiem automatyzacji produkcji. Utrudnieniem jest nietrwałość sztucznych nasion (trudności w ich przechowywaniu) oraz niewystarczająca żywotność. Ważnym problemem jest też zróżnicowanie genetyczne roślin otrzymywanych ze sztucznych nasion. Właściwie należałoby oczekiwać, że zmienności takiej wcale nie będzie, ponieważ jak już wspominaliśmy, sztuczne nasiona można uznać za formę wegetatywnego rozmnażania roślin. Nie działają więc podczas ich powstawania takie mechanizmy odpowiedzialne za różnicowanie genetyczne jak segregacja genów (towarzysząca mejozie) i losowy dobór gamet (mający miejsce podczas zapłodnienia). Mimo to, rośliny otrzymywane z somatycznych zarodków czy sztucznych nasion, wykazują często wyraźne zróżnicowanie, i to również o podłożu genetycznym. Zjawisko to obserwuje się zresztą w mniejszym lub większym natężeniu także przy innych metodach mikrorozmnażania roślin.
2.2 Zaburzenia rozwojowe i zmienność roślin produkowanych in vitro
Można by oczekiwać, że rośliny produkowane in vitro, metodami mikrorozmnażania, stale będą zachowywać swoje genetyczne właściwości i nie pojawią się wśród nich żadne osobniki nietypowe, ponieważ jak już wspominaliśmy, metody te opierają się na wegetatywnym rozmnażaniu roślin, w dodatku prowadzonym w ściśle kontrolowanych warunkach. Nie działają więc w procesie mikrorozmnażania takie mechanizmy odpowiedzialne za zróżnicowanie genetyczne organizmów jak segregacja chromosomów i genów (towarzyszące mejozie – przemianie zapoczątkowującej gametofity) oraz losowy - mniej lub bardziej - dobór osobników rodzicielskich i tworzonych przez nie gamet (zachodzący na etapie zapylenia i podczas zapłodnienia, zapoczątkowującego sporofit).
Mimo to, rośliny otrzymywane in vitro, a zwłaszcza regenerowane na drodze pośredniej organogenezy lub pośredniej somatycznej embriogenezy, wykazują często wyraźne zróżnicowanie, a cechy które się na to zróżnicowanie składają mogą być stosunkowo trwałe, w niektórych przypadkach nawet dziedziczne. Zmienność jaką czasami obserwujemy wśród roślin otrzymywanych metodą klonowania z komórek czy organów wegetatywnych (somatycznych) nazywamy zmiennością somaklonalną. Zbiór (klon) organizmów otrzymanych na drodze rozmnażania wegetatywnego i wykazujących jakąś charakterystyczną wspólną cechę, która pojawiła się nagle jako objaw zmienności somaklonalnej, nazywamy somaklonem. Mówiąc dokładniej, zmienność somaklonalna to pojawianie się różnic pomiędzy organizmami otrzymanymi w wyniku klonowania z somatycznych komórek lub tkanek tego samego organizmu oraz pojawianie się różnic pomiędzy produktami klonowania, a organizmem wyjściowym w tym procesie (pierwowzorem; materiałem matecznym).
Tak to przynajmniej wynika z praktyki stosowania terminu zmienność somaklonalna, jakkolwiek jest tu trochę terminologicznego zamieszania, wynikającego pewnie stąd, że nasz kochany szumiąco-świszcząco-trzaskający język dość kategorycznie odróżnia następujące pojęcia słabo odróżnialne w języku angielskim:
zmienność (jako niestałość czasową, ogólną zdolność lub skłonność do ulegania zmianom)
zróżnicowanie (aktualne, faktyczne występowanie różnic) oraz
różnicowanie się (proces powstawania różnic). W języku angielskim oba pojęcia z powyższych punktów b) i c) „obsługuje” to samo słowo variation, występujące właśnie w terminie somaclonal variation; natomiast w znaczeniu z powyższego punktu a) używa się raczej innego wyrazu (variability). Można by się więc zastanawiać czy po polsku nie lepiej byłoby mówić o występowaniu lub braku zróżnicowania somaklonalnego raczej niż somaklonalnej zmienności; niemniej właśnie termin zmienność somaklonalna wszedł już do powszechnego użytku. Podobne zresztą definicyjne rozterki mogą sprawiać takie fachowe terminy jak zmienność genetyczna czy środowiskowa (por. http://pl.wikipedia.org/wiki/Zmienność).
Uważa się, że u podłoża zmienności somaklonalnej mogą leżeć trzy rodzaje przyczyn:
mutacje (czyli zmiany sekwencji lub ilości DNA) zachodzące w komórkach hodowanych in vitro
zachodzące w hodowli in vitro modyfikacje epigenetyczne – bardziej subtelne zmiany DNA, do pewnego stopnia odwracalne, polegające na metylacji lub demetylacji niektórych zasad azotowych (zwłaszcza cytozyny), zmianie stopnia zwinięcia (upakowania) jakiegoś odcinka DNA lub zmianie oddziaływań jakiegoś fragmentu DNA z białkami chromatyny
niejednorodność genetyczna eksplantatu (zmienność in situ albo (=) in vivo), wywołana mutacjami lub modyfikacjami epigenetycznymi zaistniałymi jeszcze w tkankach rośliny rosnącej ex vitro, zanim pobrano eksplantat do założenia hodowli in vitro.
Jeśli oczekujemy, że metody rozmnażania wegetatywnego dostarczą osobników identycznych, to opieramy się na założeniu, że różne komórki wegetatywne tego samego organizmu są pod względem genetycznym identyczne: wszak pośrednio są potomstwem tej samej komórki – zygoty, powstałym w wyniku wielu podziałów mitotycznych. Okazuje się jednak, że u organizmów wielokomórkowych mitoza nie zawsze zachodzi jednakowo precyzyjnie i starannie. U roślin bardzo dokładnie kontrolowane są podziały mitotyczne w tkankach merystemów wierzchołkowych pędu i korzenia. Poza merystemami, komórki które zaczynają się różnicować, również mogą się dzielić, ale z mniejszą częstością i precyzją. Zdarza się u nich zwłaszcza rozprzężenie podziału komórkowego i replikacji DNA, a także zaburzenia w tworzeniu wrzeciona kariokinetycznego. Dochodzi do tego, że niektóre komórki somatyczne organizmu w zasadzie diploidalnego mają zwiększony stopień ploidalności. Taka niejednorodność tkanek zaznacza się wyraźnie zwłaszcza u niektórych gatunków, nazywanych roślinami polisomatycznymi. Ich przykładami są groch i rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana – modelowy obiekt badań w genetyce roślin). U rzodkiewnika stopień ploidalności dochodzi do 2n = 15x (kwindekaploid). W tkankach somatycznych, zwłaszcza u gatunków polisomatycznych występować mogą obok siebie komórki różniące się stopniem ploidalności (liczbą podstawowych genomów). Takie niejednorodne genetycznie (a właściwie kariotypowo) tkanki nazywamy miksoploidalnymi. Za przykłady gatunków stosunkowo wiernie przekazujących informację genetyczną nawet w częściowo zróżnicowanych tkankach somatycznych uważa się natomiast marchew i słonecznika.
W komórkach wegetatywnych gatunków polisomatycznych tworzyć się mogą chromosomy czterochromatydowe (diplochromosomy) albo wielochromatydowe (chromosomy olbrzymie, zwane też politenicznymi); proces który do tego prowadzi nazywamy endoreduplikacją. Poliploidyzacja może też objawiać się zwiększeniem się liczby, a nie grubości chromosomów (podwojeniem chromosomów bez podziału jądra komórkowego) w procesie nazywanym endomitozą.
Zmiana stopnia ploidalności wpływa na ekspresję genów, a pośrednio na wielkość komórek i roślin (zazwyczaj komórki i rośliny poliploidalne są nieco większe w porównaniu z diploidami czy tym bardziej haploidami). Poza zmianą stopnia ploidalności w genomie komórek somatycznych mogą zachodzić rekombinacje – zmiany wzajemnego układu odcinków DNA. Może to być spowodowane uaktywnieniem się (przemieszczaniem się) ruchomych elementów genetycznych (transpozonów i retrotranspozonów), a także międzychromosomową wymianą wzajemną, czyli „przekrzyżowaniem się” chromosomów homologicznych, albo mówiąc już całkiem fachowo - crossing-over. Oczywiście proces ten jest w zasadzie charakterystyczny dla mejozy, ale sporadycznie zdarza się także podczas mitoz w komórkach somatycznych.
Nic więc dziwnego, że rośliny regenerowane z różnych komórek tkanki genetycznie niejednorodnej mogą różnić się nieco wielkością, wyglądem i innymi właściwościami. Istotę zmienności somaklonalnej przedstawia poniższy rysunek, oczywiście w ujęciu wybitnie humorystycznym.
Zupełnie poważnie jednak można liczyć się z tym, że pojawią się na przykład następujące fenotypowe efekty zmienności somaklonalnej:
zmiana wrażliwości rośliny na chorobę (zwiększenie się lub obniżenie wrażliwości), zmiana szybkości wzrostu lub pokroju rośliny (np. intensywność rozgałęziania się, karłowatość), modyfikacja budowy organów (np. pojawianie się liści typu „ziemniaczanego” u pomidorów, zmiana wielkości płatków i zaburzenie symetrii kwiatów – badane m.in. u storczyków), męska sterylność, zmiana szybkości dojrzewania owoców.
Interesujące, że autorzy, którzy wprowadzili termin „zmienność somaklonalna” – Larkin i Scowcroft11 – zaobserwowali najpierw właśnie nagłe pojawienie się cechy korzystnej – niespodziewane uodpornienie się roślin (trzciny cukrowej) na fitopatogena (Helminthosporium sacchari). Rozmnażali in vitro rośliny wrażliwe, zamierzając je wykorzystać jako obiekt doświadczeń fitopatologicznych, których bardzo odległym efektem miało być otrzymanie roślin odpornych. Tymczasem rośliny takie pojawiły się jakby spontanicznie, w wyniku mutacji wywołanych samą hodowlą in vitro.
Bardzo charakterystycznymi objawami zmienności somaklonalnej są anergizacja i albinizm. Anergizacja, zwana też habituacją, albo przyzwyczajeniem się hodowli została opisana już w 1942 roku przez Gauthereta, a polega na tym, że tkanka (zwykle kalusowa), która początkowo do wzrostu wymagała jakiegoś składnika pożywki (zwykle fitohormonu, zwłaszcza cytokininy), po pewnym czasie się od niego uniezależnia, tak jakby przyzwyczaiła się, że pożywka zawsze tę substancję zawiera i w końcu „nie dostrzega”, że po kolejnym pasażu tej substancji w pożywce jednak nie zastosowano. Efekt ten tłumaczy się zwykle podwyższeniem tempa biosyntezy endogennych hormonów w tkance albo obniżeniem się zdolności komórek do unieczynniania endogennych fitohormonów, ewentualnie też zmianą wrażliwości komórek na określone fitohormony. Najnowsze badania wskazują zwłaszcza na znaczenie ostatniego z wymienionych wyżej czynników oraz epigenetyczny charakter tej zmiany.
Termin „anergizacja” stosowany jest też w nauce o odporności ludzi i zwierząt, ale oznacza tam unieczynnienie, zniesienie wrażliwości komórek odpornościowych na antygen (czy epitop). Z kolei słówko „habituacja” może oznaczać przywykanie czyli „jest zjawiskiem neurologicznym występującym w układzie nerwowym w przypadku wielokrotnego występowania tego samego bodźca. Odpowiedź układu na kolejne bodźce jest wówczas coraz mniejsza” (Wikipedia). Typowe rozumienie anergizacji czyli habituacji w roślinnej biotechnologii (zaniknięcie reakcji na niedobór czynnika wzrostowego) niewiele ma więc wspólnego ze znaczeniem tego terminu w immunologii i neurologii (osłabienie reakcji na obecność jakiegoś czynnika). Z drugiej strony zdarzają się i prace, w których autorzy mówią o habituacji jako przywykaniu komórek roślinnych do herbicydu, a wtedy słowo to używane jest zgodnie z jego ogólniej przyjętym znaczeniem. Również i tak rozumiana habituacja może być przejawem zmienności somaklonalnej.
Albinizm natomiast polega na całkowitym lub częściowym zaniku zdolności tkanek asymilacyjnych do wytwarzania chlorofilu, co prowadzi do powstawania pędów białych lub żółtawych.
Jak widać z powyższego zestawienia, zmienność somaklonalna w niektórych przypadkach może mieć swój aspekt pozytywny, gdy prowadzi do pojawienia się roślin o nowych korzystnych właściwościach (efektowny wygląd, krzaczasty, bujny pokrój, mniejsze wymagania co do składu pożywki, wzrost odporności na choroby). Rzeczywiście próbuje się czasem wykorzystać zmienność somaklonalną do doskonalenia odmian roślin, podobnie jak wykorzystuje się do tego mutagenezę indukowaną przez czynniki chemiczne lub fizyczne. Jednakże w pracach nad mikrorozmnażaniem, tj. „masowym kopiowaniem” roślin, zmienność somaklonalna jest zjawiskiem raczej niepożądanym (wszak dobra kopia powinna być wierna pierwowzorowi). Również w pracach nad otrzymywaniem organizmów genetycznie zmodyfikowanych (transgenicznych) zmienność somaklonalna budzi obawę – jaki może być skutek transformacji genetycznej w połączeniu z losową zmiennością somaklonalną? Niełatwo to przewidzieć, a trzeba dokonać próby takiej prognozy by ocenić zagrożenia związane z planowaną manipulacją.
Wymienione wyżej uwarunkowania zmienności somaklonalnej nie różnią się bardzo swą istotą – zarówno w przypadku mutacji, jak i modyfikacji epigenetycznych chodzi o zaburzenia w działaniu DNA. Mutacje i modyfikacje epigenetyczne różnią się skalą zaburzeń - mutacje to pojawianie się nowej treści w informacji genetycznej (choćby w formie powtórzenia istniejących już wcześniej fragmentów albo pominięcia części informacji genetycznej), zaś modyfikacje epigenetyczne to zmiana łatwości odczytywania pewnych obszarów DNA. Dział genetyki ogólnej obejmujący badania mechanizmów kształtowania się zmienności epigenetycznej nazywamy epigenetyką (ang. epigenetics).
Różnego rodzaju zaburzenia w budowie DNA są naturalnym elementem działania organizmów; pozorna niedoskonałość aparatu replikacji i naprawy DNA pozwala na pojawianie się w naturze coraz to nowych genów i genotypów i stanowi ważną siłę napędową ewolucji. Choć zaburzenia takie zdarzają się sporadycznie w warunkach zupełnie naturalnych, ich częstość może znacznie wzrosnąć pod wpływem stresów. W warunkach hodowli in vitro komórki narażone są na pewien stres (nie są to w końcu warunki dla nich typowe). Ten stres może z jednej strony pobudzać somatyczną embriogenezę (a więc może odgrywać rolę pozytywną w regeneracji roślin), przyczynia się jednak także do wyraźnego wzrostu częstości mutacji.
Czy więc mutacje indukowane przez promieniowanie jonizujące albo mutageny chemiczne nie różnią się niczym od mutacji będących składnikami zmienności somaklonalnej? Okazuje się, że między zmiennością somaklonalną, a „zwykłą” zmiennością mutacyjną mogą jednak istnieć pewne różnice (a badacze spierają się jeszcze na ile istotne są te różnice). Czasami obserwowano pojawianie się cech w wyniku zmienności somaklonalnej, których nie udawało się wcześniej uzyskać na zasadzie indukowanej mutagenezy. Tak było na przykład z genami gametofitowej niezgodności (S) u pomidora, decydującymi o oddziaływaniach pomiędzy pyłkiem a słupkiem u różnych form tej rośliny, z zasady obcopylnej. Badając niezbyt wielką liczbę skomaklonów wykryto formy o zmienionej charakterystyce sterylności warunkowanej przez geny S. Nie zdołano natomiast nigdy uzyskać takiego efektu przy pomocy typowych mutagenów. Stwierdzono ponadto, że wśród wariantów somaklonalnych stosunkowo często znajduje się osobniki wykazujące mutacje o charakterze dominującym. W wyniku zmienności somaklonalnej takie zmiany zachodzą około 10 razy rzadziej niż pojawianie sie mutacji recesywnych, ale to i tak bardzo często w porównaniu z częstością jedna mutacja dominująca na 100 mutacji ustępujących, obserwowaną w przypadku indukowanej mutagenezy. Ponadto przypuszcza się, że liczba mutantów homozygotycznych pod względem zmutowanego genu jest w przypadku zmienności somaklonalnej dziwnie wysoka. Wysunięto hipotezę, że przyczyną tego zjawiska jest mitotyczna rekombinacja (= somatyczny crossing over, czyli crossing over zachodzący w komórkach dzielących się mitotycznie).
O poziomie zmienności somaklonalnej decydują głównie następujące czynniki: gatunek + genotyp („tło genetyczne”), rodzaj eksplantatu, typ hodowli (np. u marchwi w hodowlach zawiesinowych obserwowano zmienność somaklonalną częściej niż na pożywkach agarowych), skład pożywki, całkowita długość okresu utrzymywania rośliny czy tkanki w hodowli in vitro i częstość pasażowania. Zmienność somaklonalna występuje zwłaszcza w przypadkach gdy rozmnażanie roślin poprzedzone jest powstawaniem kalusa (pośrednia organogeneza pędowa i pośrednia somatyczna embriogeneza). Zazwyczaj w wyniku zmienności somaklonalnej zdolności kalusa do regeneracji roślin stopniowo obniżają się. Zachodzeniu mutacji sprzyja obecność w pożywce indukcyjnej wysokich stężeń silnych, syntetycznych auksyn, a zwłaszcza 2,4-D. Na natężenie zmienności somaklonalnej wpływa także gatunek rośliny i jej genotyp.
Zaburzenia związane ze zmiennością somaklonalną są dosyć trwałe, losowe i nieprzewidywalne. Nikt nie potrafi z góry powiedzieć który spośród tysięcy genów zmutuje pod wpływem jakiegoś czynnika środowiskowego. Jeśli jednak już do określonej mutacji dojdzie, zostaje ona przekazana organizmom potomnym tworzonym w procesie rozmnażania generatywnego. Zmiany epigenetyczne z kolei raczej nie ulegają dziedziczeniu u potomków generatywnych (uważa się, że w procesie płciowego rozmnażania stan epigenetyczny komórek ulega jakby wyzerowaniu), ale mogą być przekazywane zupełnie wiernie potomkom powstającym na zasadzie rozmnażania wegetatywnego. Kolejne pokolenia takich roślin oznaczane są symbolami R1, R2 itd. (od „regenerant” = odtworzona roślina). Wyszukanie rośliny wyróżniającej się w wyniku zmienności somaklonalnej zapoczątkowuje pokolenie S1, a kolejne pokolenia roślin regenerowanych z tej formy wyjściowej oznaczane są jako S2, S3 itd.
W przypadku gdy eksplantat użyty do hodowli zawiera komórki generatywne, a nie tylko somatyczne, komórki te wykazują zwykle znaczną zmienność rekombinacyjną, związaną z działaniem czynników wymienionych na wstępie tego rozdziału. W takim razie rośliny otrzymywane z takich eksplantatów z zasady wręcz nie będą jednakowe. Na zmienność rekombinacyjną nałożyć się mogą jednak dodatkowe zaburzenia o charakterze mutacji lub modyfikacji epigenetycznych, podobnych do wspomnianych wyżej. Jeśli jednak zachodzą one w tkankach generatywnych, wywołaną przez nie zmienność nazywamy gametoklonalną.
Poza zaburzeniami dość nieprzewidywalnymi, losowymi, jakimi są mutacje i modyfikacje epigenetyczne, w kulturach in vitro zaznaczyć się mogą także inne nieprawidłowości, bardziej fizjologiczne niż genetyczne, nie ulegające dziedziczeniu i na ogół cofające się, gdy tylko zostaną ulepszone warunki hodowli. Takich nietrwałych, niedziedzicznych i nieprzypadkowych zmian nie zalicza się raczej do zmienności somaklonalnej (piszemy tak ostrożnie, bo terminologia dotycząca zmienności somaklonalnej i zjawisk pokrewnych nie jest jeszcze bardzo skrystalizowana). Wyróżnikiem takich zaburzeń fizjologicznych – o charakterze bardziej deterministycznym niż losowym - jest wysoka częstość ich występowania w danym typie hodowli (czasami obserwuje się je we wszystkich hodowlach prowadzonych na określonej pożywce i w danych warunkach).
Typowym przykładem tego typu zaburzeń jest witryfikacja (inaczej szklistość), czyli nadmierne uwodnienie tkanek roślinnych, stających się mniej lub bardziej przezroczystymi; szklistości często towarzyszy słaby rozwój blaszki liściowej, słabe wykształcenie miękiszu, tkanek przewodzących, kutykuli; niewielka liczba i nietypowe rozmieszczenie aparatów szparkowych, obniżona zawartość chlorofilu w liściach. Nieprawidłowościom w gospodarce wodnej i fotosyntezie u roślin hodowanych in vitro próbuje się czasem zaradzić ulepszając wentylację naczyń hodowlanych (powietrze przechodzi przez filtry mikrobiologiczne w pokrywkach tych naczyń), stabilizując poziom dwutlenku węgla np. przy pomocy roztworu KHCO3 i K2HCO3, obniżając temperaturę (lub zwiększając dobowe wahania temperatury), obniżając zawartość cytokinin w pożywce, dodając do pożywki soli wapnia (glukonian, chlorek lub azotan), testując różne stężenia i rodzaje cukru i agaru (lub innych czynników żelujących). Typowe zaburzenia fizjologiczne w rozwoju hodowanych in vitro roślin polegają także na zachwianiu korelacji wzrostowych, np. przeroście pędu lub korzenia, nieprawidłowej budowie zarodka (wieloliścieniowość, liścienie zrośnięte w rurkę itp). Dość częstym mankamentem fizjologicznym roślin regenerowanych in vitro jest słaby rozwój systemu korzeniowego, utrudniający oczywiście przeniesienie takich roślin do uprawy ex vitro.
3.1 Zastosowanie kultur in vitro do otrzymywania mieszańców generatywnych. Zapylenie in vitro i ratowanie zarodków
Zapylenie in vitro jest szczególną formą sztucznego (kontrolowanego) zapylenia roślin, które praktykowano już od paru tysięcy lat, jako sposób na zwiększanie plonów roślin (zwiększanie częstości zapylenia, częściowe uniezależnienie plonowania od pogody i oblotu owadów zapylaczy), a także na otrzymywanie pożądanych form roślin, a więc jako element intuicyjnej początkowo hodowli (krzyżowanie różnych form, albo przeciwnie - wymuszanie samozapylenia).
Sztuczne zapylenie w najprostszej postaci polega na tym, że rozchyla się płatki korony nie rozwiniętych jeszcze kwiatów, odcina pylniki aby zapobiec samozapyleniu (zabieg określany terminem kastracja), po czym związuje się płatki korony, albo zakłada się na kwiaty izolatory w postaci papierowych lub foliowych torebek, uniemożliwiających przypadkowe zapylenie pyłkiem innych kwiatów tej samej rośliny lub pobliskich roślin. Po 1 - 2 dniach, w czasie kiedy kwiat osiąga pełnię kwitnienia, na znamię słupka nanosi się pyłek odpowiednio dobranej rośliny, za pomocą pędzelka albo dotykając bezpośrednio słupka pylnikiem. W przypadku wymuszonego samozapylenia otrzymuje się rośliny o mniej zmiennym genotypie, w kolejnych pokoleniach coraz wierniej przekazujące potomstwu swoje właściwości biologiczne i uprawowe. Powtarzanie samozapylenia w kilku (około ośmiu) kolejnych pokoleniach roślin prowadzi do otrzymania czystych linii. Czysta linia roślin to potomstwo wysoce homozygotycznej rośliny poddanej samozapyleniu; tworzą ją więc osobniki o tym samym genotypie, wiernie przekazujące swój genotyp następnym pokoleniom. U roślin stanowiących czyste linie, fenotyp jest silnie powiązany z genotypem (nie ma efektu maskowania recesywnych alleli przez ich dominujące odpowiedniki). Łatwiej też przewidywać wynik krzyżowania dwóch (różnych) czystych linii w porównaniu z krzyżowaniem roślin w znacznym stopniu heterozygotycznych. Z obu tych powodów hodowcy chętnie wykorzystują czyste linie w pracach nad nowymi odmianami.
Zazwyczaj krzyżowane rośliny należą do tego samego gatunku. Krzyżowanie międzygatunkowe lub międzyrodzajowe, zwane krzyżowaniem form oddalonych jest dużo trudniejsze. Czasami zachodzi wprawdzie spontanicznie, lecz zdarza się to bardzo rzadko (choć częściej niż u zwierząt). Hodowcy wykorzystują takie spontaniczne mieszańce, potrafią je też sztucznie otrzymywać. Celem krzyżowania form oddalonych może być nadanie roślinom uprawnym jakiejś użytecznej cechy, właściwej ich dzikim krewniakom, np. odporności na patogeny i stresy abiotyczne (np. susza, chłód), czy korzystnego pokroju. W takich pracach zakłada się, że pożądana roślina powinna odziedziczyć zdecydowaną większość cech po jednym z rodziców (gatunku uprawnym), a tylko jedną lub kilka cech przejąć od drugiego rodzica (dzikiej rośliny). W tym celu potomstwo z krzyżowania oddalonego jest wielokrotnie krzyżowane z formą uprawną - biorcą kilku genów formy dzikiej. Zabieg ten nazywa się krzyżowaniem wstecznym lub backcrossem. W wyniku wielokrotnego krzyżowania wstecznego następuje stopniowe wypieranie genów jednego z rodziców. Oczywiście dobierając rośliny do kolejnego krzyżowania wstecznego, trzeba upewnić się, że nadal zawierają te nieliczne, interesujące hodowcę geny formy dzikiej, a nie utraciły ich w wyniku rekombinacji i losowego doboru gamet. Czasami pierwotny produkt krzyżowania oddalonego wykazuje cechy pośrednie, odbiegające wyraźnie od właściwości obu rodziców, lecz z praktycznego punktu widzenia atrakcyjne. W takim przypadku otrzymana roślina może być wprowadzona do uprawy jako nowy, syntetyczny gatunek. Najbardziej znanym przykładem rośliny uprawnej stanowiącej syntetyczny gatunek jest pszenżyto. Mieszańcami form oddalonych są też m.in.: bratek ogrodowy, goździk szklarniowy, petunia, begonia bulwiasta i in. Mieszańcowy charakter tych roślin może być zaznaczony w ich nazwie naukowej, przez włączenie do niej członu "x hybrida" (np. "Petunia x hybrida") lub podanie nazw obu form wyjściowych, połączonych znakiem mnożenia - np. bratek ogrodowy to Viola tricolor x V. lutea. Dodajmy od razu, że spotyka się także zapis, w którym nazwy gatunkowe dwóch rodziców mieszańca połączone są znakiem dodawania, a nie mnożenia. Oznacza to, że roślina nie jest mieszańcem generatywnym (otrzymanym w wyniku zapylenia i zapłodnienia), ale somatycznym - otrzymanym w wyniku sztucznie indukowanego zlania się komórek somatycznych. O mieszańcach somatycznych więcej danych przedstawia Rozdział 4.
Celem krzyżowania form oddalonych może być odtworzenie drogi powstawania jakiejś rośliny uprawnej. Chodzi tu o sprawdzenie hipotezy, że przodkami danego gatunku uprawnego były określone dziko żyjące gatunki. W ten sposób wykazano doświadczalnie, że rzepak (Brassica napus) rozwinął się najprawdopodobniej jako mieszaniec kapusty polnej (inaczej rzepiku) i kapusty warzywnej (czyli jest mieszańcem Brassica rapa x B. oleracea). Oczywiście, obecnie próby krzyżowania form oddalonych odgrywają w takich badaniach rolę pomocniczą, a pierwszorzędne znaczenie mają analizy markerów molekularnych u hipotetycznych form wyjściowych i rośliny, której filogeneza jest odtwarzana. Resyntetyza gatunków przyczynia się do wyjaśnienia ciekawych kwestii poznawczych, a ponadto może dostarczyć form roślin stanowiących cenny materiał wyjściowy do hodowli nowych odmian uprawnych. Czasami łatwiej jest wprowadzić obcy gen do jednego z dzikich rodziców, a potem odtworzyć roślinę uprawną, raczej niż wprowadzać użyteczny gen bezpośrednio do rośliny uprawnej.
Nie zawsze sztuczne zapylenie kończy się powodzeniem, tj. wytworzeniem nasion, a z nich odpowiednich roślin potomnych. Przyczyną trudności w krzyżowaniu roślin mogą być zbyt duże różnice genetyczne pomiędzy obydwoma rodzicami (np. przy krzyżowaniu międzygatunkowym albo międzyrodzajowym, bardziej egzotycznym układom kojarzenia raczej nie daje się żadnych szans) albo zbyt małe różnice u roślin obcopylnych. Ich powstawaniu przeciwdziałają bariery krzyżowalności. Przyjęło się dzielić je na dwie kategorie: przedzygotyczne (lub przedzapłodnieniowe) - tj. te, które zapobiegają powstaniu zygoty, czyli uniemożliwiają zapłodnienie komórki jajowej oraz pozygotyczne (pozapłodnieniowe) - które nie utrudniają wprawdzie zapłodnienia, ale przejawiają swoje istnienie zaburzeniami w rozwoju zygoty, albo niepłodnością mieszańców (czasami pierwsze pokolenie mieszańców jest płodne, ale w dalszych pokoleniach występuje bezpłodność). W warunkach naturalnych bariery przedzygotyczne mogą polegać na izolacji geograficznej (gatunki nie krzyżują się w naturze, gdyż występują w różnych rejonach geograficznych) lub biotopowej (rośliny mogą wprawdzie występować na tym samym obszarze geograficznym, ale nie dochodzi do ich kontaktu bo zajmują różne typy siedlisk), czasowej (pory roku lub pory dnia, np. gdy u dwóch gatunków kwiaty otwierają się o różnych porach doby), lub etologicznej (izolacja gatunków związana z zachowaniem owadów zapylaczy, z ich wiernością w stosunku do niektórych gatunków roślin; np. olejki eteryczne niektórych kwiatów zawierają substancje o aktywności owadzich feromonów; ubarwienie korony kwiatów, obecność i odpowiedni układ włosków, mogą upodabniać kwiaty - zwłaszcza storczyków - do samic owadów zapylaczy, co skłania samce do prób kopulacji i prowadzi do zapylenia kwiatów; tego typu wybiórcze oddziaływania mogą powodować że kwiaty jednego gatunku rośliny zapylane są przez jeden gatunek owadów). Oczywiście przy sztucznym zapyleniu powyższe bariery nie mają żadnego znaczenia, natomiast pewne trudności może stwarzać izolacja mechaniczna (związana z budową kwiatów, zwłaszcza gdy za długa szyjka słupka uniemożliwia łagiewkom pyłkowym dotarcie do zalążków) lub fizjologiczna (zwana barierą sterylności, polegająca na tym że pyłek na znamieniu obcego słupka nie tworzy łagiewki pyłkowej, albo łagiewka zamiera, albo nie jest w stanie dotrzeć do komórki jajowej). Barierę fizjologiczną, utrudniającą krzyżowanie form oddalonych, nazywamy też niezgodnością pyłku. U niektórych roślin występuje niezgodność wewnątrzgatunkowa (samoniezgodność) - zjawisko, które jest przyczyną obligatoryjnej obcopylności. Różne odmiany tego samego gatunku rośliny mogą się różnić występowaniem wspomnianych barier krzyżowania. Na przykład u rzepaku niektóre genotypy są samoniezgodne (czyli nie tworzą nasion w wyniku samozapylenia, albo tworzą ich bardzo mało), inne linie są samozgodne (samozapylenie prowadzi do wytworzenia nasion).
Pokonywanie przedzygotycznych barier krzyżowania nie zawsze wymaga uciekania się do hodowli in vitro, niemniej kultury in vitro często są w tym celu wykorzystywane. W razie trudności w pobieraniu przez pyłek wody ze znamienia słupka, korzystne może okazać się zapylanie w atmosferze o wysokiej wilgotności. Przyczyną trudności obcego pyłku w kiełkowaniu na znamieniu słupka może być jego niezdolność do tworzenia i uwalniania białek charakterystycznych dla pyłku zgodnego, warunkujących rozpoznanie pyłku przez znamię słupka. W takim przypadku rozwiązaniem może być zastosowanie "pyłku przewodnika" (ang. mentor pollen), tzn. zastosowanie mieszaniny pyłku - oprócz niezgodnego, dodawany jest pyłek zgodny (naturalnie kiełkujący) który został wcześniej unieczynniony (w wyniku naświetlania promieniami UV, zamrożenia i ogrzania lub traktowania metanolem) tak że jest on źródłem odpowiednich białek, ale sam nie może kiełkować, albo kiełkuje, ale nie uczestniczy w zapłodnieniu. Podejmowano również próby zastępowania "pyłku przewodnika" roztworem ekstrahowanych z niego białek, w którym zawieszano pyłek niezgodny, a także przemywania znamion słupka gorącą wodą lub rozpuszczalnikami organicznymi (heksan, octan etylu) w celu pozbawienia ich zdolności do wybiórczego rozpoznawania pyłku. We wszystkich powyższych doświadczeniach wykorzystywano słupki kwiatów, pozostawione na roślinie (in vivo) lub odcięte i hodowane in vitro. Ponieważ zdolność do rozpoznania zgodnego pyłku mają głównie komórki znamienia, krzyżowanie roślin może być łatwiejsze gdy znamię słupka zostanie usunięte, a pyłek naniesiony na przeciętą szyjkę słupka lub wprost do zalążni (mówi się wtedy o zapyleniu wewnątrzzalążniowym). Sporadycznie opisywano też przeszczepianie szyjki słupka (wraz ze znamieniem i kiełkującym na nim pyłkiem) - po około dobie od zapylenia, szyjkę słupka odcinano tuż ponad zalążnią i mocowano (odrobiną agaru) do zalążni podobnie przeciętego słupka innej rośliny. Wyłącznie w warunkach in vitro może się udać zapylenie zalążków (uwolnionych z zalążni). Okazuje się jednak, że zalążki niektórych roślin dużo lepiej się rozwijają (tworząc nasiona), gdy z pożywką stykają się nie bezpośrednio, ale za pomocą łożyska - fragmentu zalążni, do którego zalążki przyrośnięte są wyrostkami zwanymi sznureczkiem i z którego pobierają substancje odżywcze. Zapylenie tak hodowanych zalążków nazywane jest zapyleniem placentowym (łożyskowym; łożysko = placenta). Metodą, która bardzo skutecznie wymusza połączenie gamet krzyżowanych roślin jest fuzjonowanie ich protoplastów. Wymaga to izolowania nie samych zalążków i ziaren pyłku, ale tworzących się wewnątrz nich gamet, które następnie trzeba pozbawić ściany komórkowej i poddać działaniu czynników destabilizujących błonę komórkową, a tym samym sprzyjających zlewaniu, łączeniu się (a mówiąc jeszcze bardziej fachowo - fuzjonowaniu) komórek. Ta technika stosowana jest jednak najczęściej do łączenia (fuzjonowania) protoplastów komórek somatycznych i dokładniej przedstawiona jest w Rozdziale 4.
Bariery pozygotyczne krzyżowalności roślin polegają na tym, że do zapłodnienia wprawdzie dochodzi i powstaje zygota, ale tworzący się z niej zarodek mieszańcowy albo wkrótce zamiera (z powodu niedorozwoju bielma i niedożywienia zarodka), albo przekształca się w roślinę o normalnie wprawdzie rozwiniętych organach wegetatywnych lecz bezpłodną (jest to swego rodzaju roślinny odpowiednik muła). Zdarza się też, że pierwsze pokolenie roślin mieszańcowych jest płodne, ale w dalszych pokoleniach zaznacza się degeneracja (zaburzenia rozwojowe) lub bezpłodność.
Metodą, która może pozwolić na pokonanie pozygotycznych barier krzyżowania, objawiających się zaburzeniami embriogenezy jest hodowla in vitro izolowanych zarodków. Izoluje się je gdy są jeszcze na wczesnym etapie rozwoju (zarodki sercowate) i hoduje się je na pożywce zastępującej prawidłowo wykształcone bielmo. Opisano też przeszczepianie zarodków mieszańcowych do hodowanego in vitro bielma izolowanego z zalążków poddanych zapyleniu pyłkiem zgodnym (i dzięki temu zawierających dobrze rozwinięte bielmo). Oczywiście, w takim przypadku zarodek będący wynikiem zapylenia pyłkiem zgodnym jest najpierw usuwany z bielma i zastępowany właśnie zarodkiem mieszańcowym. W przypadku gdy zarodki są bardzo drobne i trudne do izolowania, wystarczającym rozwiązaniem może okazać się hodowla zalążków izolowanych z zapylonych kwiatów, lub skrawków zalążni zawierających takie zalążki. Ponieważ podczas hodowli zalążki i zarodki powiększają się, a ich wymagania pokarmowe stają się coraz prostsze, czasami zaczyna się doświadczenie od hodowli in vitro zalążni (z zapylonych kwiatów), po pewnym czasie przechodzi się do hodowli zalążków, a później do hodowli izolowanych zarodków. Powyższe metody pozwalają na uratowanie mieszańcowych zarodków przed obumieraniem (zwanym aborcją) i stąd bywają ogólnie określane mianem techniki ratowania zarodków (ang. embryo rescue). Technika ta stosowana jest już od kilkudziesięciu lat i pozwoliła otrzymać mieszańce np. różnych gatunków lnu, koniczyny, ogórka, słonecznika, roślin kapustnych, lilii, tulipanów i innych.
Metody zapylenia in vitro oraz ratowania zarodków wymagają od eksperymentatora szczegółowej znajomości dynamiki procesów zapylenia i zapłodnienia u danego gatunku i dobrania najlepszego momentu do przeprowadzenia zabiegu. Na przykład w próbach krzyżowania międzygatunkowego lilii stwierdzono, że najkorzystniej jest hodować in vitro zalążki przez 30 - 45 dni po zapyleniu, by później hodować ich skrawki, albo izolowane zarodki.
Szanse na to, że otrzymane mieszańce będą płodne, można częściowo ocenić biorąc pod uwagę liczbę chromosomów w komórkach obu krzyżowanych roślin. Wiadomo, że z reguły obie gamety przekazują potomstwu cały swój zestaw chromosomów, a więc komórki somatyczne mieszańca mają liczbę 2n równą sumie liczb chromosomów obu gamet, które rozpatrywanej roślinie dały początek. Na przykład krzyżując koniczynę białą (Trifolium repens) o 2n = 32 z koniczyną czerwoną (T. pratense) o 2n = 14 musimy oczekiwać, że mieszaniec będzie miał w komórkach somatycznych 2n = 23 chromosomy (16 pochodzących od T. repens i 7 od T. pratense). Najprawdopodobniej będzie więc bezpłodny, bo nie da się 23 chromosomów podzielić na dwa równe zestawy i przekazać tworzącym się gametom. U takiego mieszańca w gametogenezie wystąpią zaburzenia, które najprawdopodobniej spowodują jego bezpłodność. Czy tak jest w istocie, rozstrzygnąć musi jednak doświadczenie, bo przyroda ożywiona nie trzyma się zbyt sztywno swych praw. Bezpłodność mieszańców jest, jak już wspomniano, barierą krzyżowalności typu pozygotycznego. Sposobem na jej pokonanie może być podwojenie liczby chromosomów u mieszańca. W naszym przykładzie mieszaniec, zawierający początkowo 2n = 2x = 23 chromosomów w wyniku tego zabiegu zawierałby 2n = 4x = 46 chromosomów (symbol 2n stosujemy tu, bo nadal dla "aparatu mejotycznego" komórek jest to zestaw, który należy podzielić na dwie połowy; symbolem 4x zaznaczamy, że występujące tam chromosomy mogłyby utworzyć cztery autonomiczne, w pełni funkcjonalne, genomy komórek haploidalnych; ten zapis przypomina nam, że rozpatrywany organizm jest tetraploidem, a dokładniej allotetraploidem, bo jego genom zawiera zestawy chromosomów pochodzące z różnych gatunków).
Podwojenie liczby chromosomów zachodzi czasem spontanicznie (zwłaszcza w kulturach in vitro), ale w praktyce wywołuje się je sztucznie, poddając rośliny (młode, dobrze rozwinięte siewki lub wierzchołki pędów) przez kilka godzin działaniu mutagenów (czas powinien być tak dobrany, żeby nie przekraczał długości cyklu komórkowego). Takim najczęściej stosowanym mutagenem zaburzającym kariokinezę (podział materiału jądrowego), jest protoalkaloid kolchicyna (z zimowita jesiennego Colchicum autumnale), rzadziej oryzalina. Sporadycznie wspomina się też o możliwości zastosowania do tego celu podtlenku azotu. Ponieważ skuteczność czynników podwajających genom nie jest stuprocentowa, konieczne jest sprawdzenie stopnia ploidalności komórek regenerowanych roślin. Wstępnie można o nim wnioskować na podstawie takich parametrów pomocniczych jak wielkość ziaren pyłku, długość aparatów szparkowych lub liczba chloroplastów w komórkach szparkowych. Dokładniejszej oceny dokonuje się licząc chromosomy na mikroskopowych preparatach merystemów, albo wykorzystując metodę cytometrii przepływowej, omówioną w dalszej części skryptu.
3.2 Haploidy i podwojone haploidy
Wynikiem krzyżowania form oddalonych może być tworzenie się niestabilnych układów chromosomów, w wyniku czego w rozwijającym się zarodku chromosomy jednego z rodziców podczas kolejnych podziałów komórkowych ulegają eliminacji. Otrzymuje się więc rośliny, które zawierają jądrowy materiał genetyczny tylko jednego z rodziców i to w ilości gametycznej. Jeśli więc ten rodzic był diploidem, to roślina potomna będzie haploidem, tzn. jej komórki somatyczne zawierać będą liczbę chromosomów typową u tego gatunku dla gamet. Ta metoda otrzymywania haploidów jest stosunkowo często stosowana w przypadku zbóż. Słynna już niemal stała się metoda bulbosum ("bulbozowa?"), polegająca na krzyżowaniu jęczmienia zwyczajnego Hordeum vulgare z Hordeum bulbosum (jako dawcą pyłku). W wyniku eliminacji chromosomów w tym systemie kojarzenia otrzymuje się haploida zawierającego tylko chromosomy Hordeum vulgare. Również w celu otrzymania haploidów przeprowadza się czasem krzyżowanie żyta z Hordeum bulbosum, pszenicy z kukurydzą lub pszenicy linii Salmon z kozieńcem Aegilops caudata.
W tych doświadczeniach zapylenie przeprowadzane jest w warunkach ex vitro (kłosy poddaje się tylko kastracji dla uniemożliwienia niekontrolowanego zapylenia), natomiast po 16 - 18 dniach od zapylenia izoluje się zarodki i umieszcza na jałowej pożywce.
Krzyżowanie międzygatunkowe lub międzyrodzajowe nie zawsze dostarcza haploidów, ale też nie jest jedyną metodą ich otrzymywania. Haploidy otrzymywano także przeprowadzając opóźnione zapylenie (u pszenicy 9-20 dni po usunięciu pylników z pąków kwiatowych), a także w wyniku zapylania kwiatów pyłkiem naświetlonym promieniami X, naświetlania słupków promieniami X lub UV albo w wyniku traktowania słupków substancjami takimi jak kwas maleinowy lub błękit toluidyny. W następstwie tych zabiegów, nie wymagających stosowania kultur in vitro, rozwijają się zarodki partenogenetyczne (z niezapłodnionych komórek jajowych), rzadziej apogamiczne (z innych niż gameta komórek gametofitu, zwykle z synergid). Z kulturami in vitro natomiast ściśle wiążą się dwie następne metody otrzymywania haploidów, stosunkowo często wykorzystywane: a.) regeneracja roślin z hodowanych in vitro pylników, albo z izolowanych mikrospor, czyli niedojrzałych ziaren pyłkowych (androgeneza) b.) hodowla in vitro izolowanych (i niezapłodnionych) zalążków - gynogeneza.
Efektywność androgenezy podnosi się czasami pod wpływem stresów, w związku z tym np. u gatunków rodzaju Brassica pylniki traktuje się przez 16-48 godzin temperaturą 35°C, natomiast pylniki gorczycy, rzodkiewnika, ziemniaka, tytoniu, przed rozpoczęciem właściwej hodowli traktowane są przez kilka dni temperaturą około 6°C. Do regeneracji haploidów często stosuje się pożywkę Murashigego i Skooga (ewentualnie nieznacznie zmodyfikowaną jako Linsmaiera Skooga), czasami B5 Gamborga oraz pożywkę Nitsch i Nitsch. Na wydajność androgenezy wpływa też genotyp rośliny i jej właściwości gatunkowe. Opisano jednak doświadczenia, w których ze 100 pylników otrzymywano nawet do 1000 roślin. U zbóż rośliny otrzymywane w wyniku androgenezy wykazują jednak często zaburzenia syntezy chlorofilu, które nazywamy albinizmem. Jest to jeden z typowych przejawów zmienności gametoklonalnej - odpowiednika zmienności somaklonalnej, występującego w roślinach klonowanych z komórek rozrodczych. Oczywiście na ogół albinizm jest cechą niepożądaną, utrudniającą prawidłowy rozwój roślin, a jednocześnie trudną do kontrolowania.
Gynogeneza natomiast z reguły charakteryzuje się dużo niższą wydajnością niż androgeneza, bo jak wiadomo, kwiaty zawierają znacznie mniej zalążków niż ziaren pyłku. Dotychczas uzyskano to zjawisko u kilkunastu gatunków roślin, wśród których jest np. modrzew, burak, gerbera, tytoń, ryż. Praktyczne znaczenie ma ta metoda głównie u tych gatunków, u których nie udało się uzyskać z zadowalającą wydajnością androgenezy, np. u gerbery i buraka cukrowego.
Haploidy budzą duże zainteresowanie hodowców, między innymi jako materiał do mutagenezy. Łatwiej można u nich wykryć i scharakteryzować mutacje niż u diploidów, u których każdemu zmutowanemu genowi towarzyszy jego niezmieniony allel (allel typu dzikiego). Głównym jednak zastosowaniem haploidów jest otrzymywanie z nich podwojonych haploidów, w wyniku kolchicynowania (działania kolchicyną, por. wyżej) lub działania innymi mutagenami podwajającymi materiał genetyczny. Podwojone haploidy zawierają w komórkach somatycznych diploidalną liczbę chromosomów, ale od zwykłych diploidów istotnie się różnią - są homozygotyczne pod względem wszystkich występujących w nich genów (bo powstają w wyniku wiernej replikacji genomu haploidalnego). Skoro każdy gen wysępuje w nich w dwóch identycznych kopiach, to poddane rozmnażaniu generatywnemu (przez samozapylenie), nie wykazują rozszczepienia cech i wiernie przekazują swoje właściwości potomstwu. Linie podwojonych haploidów wykazują więc właściwości typowe dla ulubionych przez hodowców czystych linii, a przy tym dają się otrzymać w czasie znacznie krótszym, niż w metodzie chowu wsobnego (wielokrotnie powtarzanego samozapylenia). Populacja podwojonych haploidów (różnych linii) wykazuje podobny zakres zmienności fenotypowej jak populacja diploidów, z których je wyprowadzono, jest jednak znacznie mniej zróżnicowana pod względem genotypowym (odpadają wszystkie heterozygoty). Łatwiej jest więc znaleźć interesujący, rzadki genotyp w populacji podwojonych haploidów niż (zwykłych) diploidów, bo jego częstość wśród podwojonych haploidów musi być większa. Uzmysławia to poniższy schemat.
Genotypy potomstwa rośliny heterozygotycznej, poddanej samozapyleniu (dla uproszczenia skupiamy tu uwagę na tylko dwóch spośród kilkudziesięciu tysięcy genów; w populacji podwojonych haploidów otrzymanej z tej rośliny wystąpią tylko te genotypy, które wyróżniono kolorem; im więcej genów się rozpatruje, tym większa jest różnica w liczebności genotypów pomiędzy diploidami a podwojonymi haploidami).
| gamety ♂(i haploidy) | |||
|---|---|---|---|
| Rodzic: AaBb samozapylenie |
Ab | AB | ab |
| potomstwo | |||
| gamety ♀ (i haploidy) | Ab | AAbb | |
| AB | AABb | ||
| ab | Aabb | ||
| aB | AaBb |
Dzięki wykorzystaniu podwojonych haploidów w hodowli roślin, czas niezbędny do otrzymania nowej odmiany uległ skróceniu, bo skrócił się okres wyprowadzania czystych linii (można to obecnie osiągnąć w ciągu roku). Pozostaje jednak konieczność przeprowadzenia agrobotanicznej oceny wyselekcjonowanych form i to w kilku pokoleniach, w związku z tym cykl hodowany nadal trwa kilka lat (np. 4), lecz nie około dziesięciu, jak to jest przy stosowaniu metod bardziej tradycyjnych.
3.3 Triploidy
Zainteresowanie hodowców i ogrodników mogą budzić także triploidy - rośliny, których komórki somatyczne zawierają trzy haploidalne genomy, typowe dla gamet danego gatunku. Ponieważ trzy zestawy chromosomów trudno jest równomiernie podzielić i przekazać komórkom potomnym w procesie gametogenezy, rośliny te są z reguły bezpłodne, co może stanowić ich zaletę. Triploidami są odmiany dostarczające beznasiennych owoców - bananów, jabłek, arbuzów, winogron. Niektóre triploidy znalazły zastosowanie ze względu na inne korzystne cechy użytkowe, takie jak efektowny wygląd (petunie), czy właściwości technologiczne drewna (topole). Triploidy można otrzymywać bez pomocy kultur in vitro, krzyżując diploida z tetraploidem (gdy hodowca ma do dyspozycji takie formy danego gatunku). Często jednak wykorzystuje się w tym celu technikę regeneracji roślin z hodowanych in vitro komórek bielma. Ta tkanka spichrzowa rozwija się w nasionach zdecydowanej większości roślin - u okrytonasiennych nie tworzą jej tylko przedstawiciele trzech rodzin: Orchidaceae (storczyki), Podostemaceae i Trapaceae (kotewkowate), jakkolwiek i u innych roślin w miarę rozwoju zarodka tkanka ta może zanikać. U 81% gatunków okrytonasiennych bielmo jest triploidalne, bo powstaje w wyniku połączenia się dwóch komórek gametofitu żeńskiego (komórek biegunowych woreczka zaląźkowego) i jednej męskiego (plemnika). Jest to jednorodna masa tkanki parenchymatycznej, a jej komórki wykazują totipotencję. U niektórych gatunków bielmo jest właściwie tkanką miksoploidalną, na przykład u kukurydzy zawiera również komórki, wyposażone w 6, 12 lub 24 zestawów chromosomów, ale dominują komórki triploidalne. Pewnym problemem może być rozmnażanie triploidów, bo jak już wspominaliśmy, rośliny te z reguły są bezpłodne. Jest to więc kolejny obszar do zastosowania wydajnych metod rozmnażania wegetatywnego, opartych na roślinnych kulturach in vitro.
3.4 Inne zastosowania hodowli organów generatywnych
W warunkach in vitro prowadzi się czasem hodowle zalążni w celu poznania mechanizmów rozwoju owocu. W ten sposób otrzymano na przykład dojrzałe, normalnie wybarwione (choć zapewne drobne) owoce pomidora. Wystarczająca do tego okazała się stosunkowo prosta pożywka White'a. Podobnie, hodowle izolowanych zalążków (z zapylonych kwiatów) mogą być wykorzystane do badania rozwoju nasion. Hodowle zarodków (dojrzałych, pochodzących z krzyżowań zgodnych) mogą być wykorzystane do badania uwarunkowań ich spoczynku. U gatunków, których nasiona długo pozostają w spoczynku, na przykład u kosaćca, doświadczenia takie mogą służyć także całkiem praktycznemu celowi pobudzenia wzrostu zarodków. Dojrzałe zarodki dają się hodować na stosunkowo prostych pożywkach zawierających sole mineralne i węglowodany, niedojrzałe mają większe wymagania pokarmowe, czasami poza witaminami, aminokwasami i regulatorami wzrostu stosowane są wyciągi z bielma (często mleczko kokosowe, będące płynnym bielmem) albo konieczne jest wykładanie na pożywkę nie dokładnie wyizolowanego zarodka, ale zarodka wraz z bielmem. Stadia sercowate zarodków hodowane są na pożywce zawierającej stosunkowo dużo cukru, co zapobiega ich przedwczesnemu wzrostowi. Z zarodków globularnych praktycznie nie daje się zregenerować roślin, jakkolwiek można z nich otrzymać kalus.
Bardzo interesujące są badania wymagań pokarmowych zarodków u roślin pasożytniczych oraz nawiązujących mykoryzę (to ostatnie zwłaszcza u storczyków). U storczyków zdołano dzięki odpowiednio dobranym pożywkom zapewnić rozwój i kiełkowanie zarodków, bez udziału występującego w warunkach naturalnych partnera symbiotycznego.
3.5 Terminologia dotycząca stopnia ploidalności komórek - przypomnienia i uzupełnienia
Diploid to organizm, którego komórki somatyczne mają liczbę chromosomów charakterystyczną u danego gatunku dla sporofitu, a haploid - dla gametofitu (pyłku, albo komórek woreczka zalążkowego) - czyli odpowiednio - dla komórek będących przed mejozą i po niej. Podwojenie liczby chromosomów haploida, spontaniczne, albo wywołane działaniem kolchicyną prowadzi do powstania podwojonego haploida, który od zwykłego diploida różni się tym, że jest praktycznie w 100% homozygotą (tj. homozygotą pod względem wszystkich genów).
Euhaploid - organizm, którego komórki somatyczne zawierają liczbę chromosomów dokładnie odpowiadającą liczbie gametycznej (liczbie chromosomów typowej dla gamet). Organizm, którego komórki zawierają chromosomy w liczbie zbliżonej do gametycznej liczby u tego gatunku, lecz nieco od niej odbiejagającej to aneuhaploid. Haploid disomiczny przypomina odpowiedni euhaploid, ale jeden z chromosomów występuje w jego komórkach w dwóch egzemplarzach; taką samą liczbę chromosomów ma haploid addycyjny, ale ten jeden dodatkowy chromosom w jego komórkach pochodzi z genomu innego gatunku rośliny niż pozostałe chromosomy; haploid nullisomiczny ma o jeden chromosom mniej w porównaniu z odpowiednim euhaploidem. Aneuhaploid, którego komórki mają typową dla euhaploida liczbę chromosomów, z tym jednak, że jeden z chromosomów pochodzi z genomu innego gatunki niż pozostałe, to haploid substytucyjny. Wszelkie inne aneuhapolidy można ogólnie nazywać aneuhaploidami nieregularnymi. Polihaploid - haploid organizmu poliploidalnego (zawiera więcej niż jeden genom), np. dihaploid jest haploidem organizmu tetraploidalnego i zawiera dwa podstawowe genomy. Dla odróżnienia takich haploidów od haploidów których komórki zawierają tylko jeden genom, te ostatnie nazywa się monohaplodiami (lub monoploidami). Polihaploidy zawierają więc co najmniej dwa genomy; jeśli są to genomy identyczne (tego samego gatunku) to polihaploid jest autopolihaploidem, w przeciwnym razie jest allopolihaploidem (zawiera genomy różnych gatunków roślin).
Wiele gatunków roślin jest poliploidami, prawdopodobnie nawet rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana), który słynie z niewielkiej zawartości DNA w komórkach.
Do przeanalizowania tych terminologicznych niuansów wdzięcznym obiektem są komórki ziemniaka (Solanum tuberosum). Zawierają 2n = 4x = 48 chromosomów. Krzyżując ziemniaka z Solanum phureja otrzymać można rośliny mające 1n = 2x = 24 chromosomy. Z hodowli pylników takich roślin udaje się czasami zregenerować rośliny zawierające 1n = 1x = 12 chromosomów. Tak więc u normalnego ziemniaka haploid (1n) jest właściwie dihaploidem (2x; dzięki występowaniu dwóch podstawowych genomów ten haploid może być płodny), ale wcale nie podwojonym haploidem. Diploid zaś (2n) zwykle nie jest wcale podwojonym haploidem, za to jest właściwie tetraploidem (4x).
Allopoliploidy to rośliny, których komórki zawierają kilka genomów różnych gatunków. Autopoliploidy natomiast zawierają w komórkach po kilka kopii tego samego genomu. Chromosomy różnych gatunków mogą się "spotkać" w genomie jednego organizmu w wyniku krzyżowania form oddalonych. Planowe, zamierzone wprowadzanie jakiegoś chromosomu lub jego fragmentu do genomu wybranego organizmu (w wyniku odpowiednich krzyżowań i ewentualnie działania mutagenami, powodującymi pękanie chromosomów) nazywa się czasem inżynierią chromosomową. Zarówno poliploidy, jak i mieszańce międzygatunkowe powstają u roślin znacznie częściej niż u zwierząt.
4.1 Izolowanie protoplastów
Protoplast obejmuje wszystkie składniki komórki roślinnej lub drobnoustroju oprócz ściany komórkowej. Otoczony jest więc tylko białkowo-lipidową błoną cytoplazmatyczną. Skrótowo możemy to przedstawić równaniem: protoplast = komórka - ściana komórkowa.
Trzymając się tej algebraicznej konwencji, przypomnijmy też, że:
| protoplast - wakuola = protoplazma | |
|---|---|
| protoplazma - jądro komórkowe = cytoplazma | |
| cytoplazma - (mitochondria, plastydy, RE, aparat Golgiego, sferosomy i inne struktury błoniaste) = cytoplazma podstawowa |
Komórki roślinne występujące w organach i tkankach mają zwykle kształt wielościanów, będący wynikiem działania turgoru, wytrzymałości ścian komórkowych i naporu sąsiednich komórek. W zawiesinie natomiast pojedyncze komórki przyjmują często kształt owalny czy rogalikowaty, wynikający ze zróżnicowanej elastyczności różnych obszarów ściany komórkowej. Izolowane protoplasty z kolei mają kształt niemal idealnie kulisty. Kulisty kształt przyjmują komórki jeszcze zanim ich ściany zostaną całkowicie usunięte. Takie komórki, kuliste lecz nie w pełni pozbawione ściany komórkowej nazywa się sferoplastami. Od izolowanych protoplastów można je odróżnić stosując obserwacje mikroskopowe uwidaczniające celulozę, np. w mikroskopie fluorescencyjnym widać wzbudzaną światłem nadfioletowym niebieską fluorescencję celulozy. Oczywiście, widać ją w przypadku sferoplastów, ale nie właściwych protoplastów, które celulozy zupełnie już nie zawierają.
Podczas izolowania protoplastów w znacznym stopniu zanika stan strukturalnego i fizjologicznego spolaryzowania (zróżnicowania, biegunowości) komórek. Izolowane protoplasty stanowią niezwykle jednorodny zbiór pojedynczych komórek (ścianę komórkową są w stanie w krótkim czasie odbudować), a dzięki temu są doskonałym materiałem do analizowania zdolności rozwojowych komórek. Ponieważ plazmodesmy, łączące sąsiednie komórki, podczas izolacji protoplastów ulegają zerwaniu, izolowane protoplasty znajdują zastosowanie do badania zakażeń wirusami w ściśle kontrolowanych warunkach (w bardziej złożonych układach doświadczalnych plazmodesmy ułatwiają wirusom rozprzestrzenianie się w tkance, a ponieważ rozmieszczenie plazmodesm trudno jest dokładnie prześledzić, pojawiają się trudności w zapewnieniu kotrolowanych warunków i powtarzalności doświadczeń). Dzięki zastosowaniu izolowanych protoplastów uzyskuje się większą częstość zakażeń i ich częściową synchronizację. Protoplasty są też doskonałym materiałem do prac z zakresu indukowanej mutagenezy, bo badaczowi bardzo zależy w tych doświadczeniach na wyselekcjonowaniu klonów komórek różniących się genotypem, a te najłatwiej znaleźć wśród komórek maksymalnie zbliżonych pod względem fizjologicznym. Zastosowanie protoplastów pozwala też na ograniczenie ryzyka regenerowania roślin mozaikowych (chimer), jakie powstają gdy jedną roślinę współtworzą komórki o różnym genotypie (np. gdy zawiązek pędu powstaje ze skupiska zawierającego zarówno komórki zmutowane jak i dzikiego typu). Dzięki odsłonięciu błony cytoplazmatycznej izolowane protoplasty świetnie nadają się do badania budowy tej ważnej komórkowej struktury, a także do badania mechanizmów odtwarzania ściany komórkowej. Usunięcie ściany komórkowej ułatwia izolowanie delikatnych składników komórek, na przykład wielkoczasteczkowego DNA, a z drugiej strony pozwala na wprowadzanie do komórki obcych elementów, na przykład cząsteczek DNA, białek, albo całych organelli. Zwłaszcza do wprowadzania obcego DNA protoplasty wykorzystywane są dość często. Możliwe jest też pobudzanie łączenia się (zlewania) dwóch lub więcej protoplastów. Proces ten, zwany fuzjonowaniem protoplastów prowadzi do powstawania komórek mieszańcowych, a można go uzyskać posługując się zarówno protoplastami komórek rozrodczych (generatywnych), jak i somatycznych. Fuzjonowanie protoplastów komórek generatywnych jest jedną z dróg pokonywania barier krzyżowalności roślin, jakkolwiek metodą dość skomplikowaną i kosztowną więc stosowaną niezbyt często. Z protoplastów komórek somatycznych, w wyniku ich łączenia, uzyskuje się mieszańce zwane somatycznymi, albo - tę nazwę stosuje się znacznie rzadziej - paraseksualnymi. Fuzjonowanie protoplastów komórek somatycznych bywa też nazywane somatyczną hybrydyzacją.
Aby otrzymać izolowane protoplasty wystarczy pozbawić komórki ich celulozowo - pektynowych ścian. W najwcześniejszym okresie rozwoju roślinnych kultur in vitro podejmowano próby mechanicznej izolacji protoplastów - tkankę poddawano plazmolizie, a następnie rozdrabniano przy pomocy skalpela lub igieł preparacyjnych, obserwując ją pod mikroskopem. Można było w ten sposób uzyskać pojedyncze izolowane protoplasty, ale wydajność metody była bardzo niska, a ilość uszkadzanych protoplastów bardzo wysoka, stąd obecnie izolacja mechaniczna stosowana jest zupełnie sporadycznie, natomiast w praktyce protoplasty izoluje się niemal wyłącznie metodą enzymatyczną (opisaną przez Cockinga w 1960 r). W tym celu inkubuje się tkankę roślinną (albo komórki z hodowli zawiesinowej) w roztworze zawierającym enzymy celulolityczne (celulaza, drizelaza) i pektynolityczne (macerozym, maceraza, pektoliaza itp. - różni producenci stosują własne nazwy preparatów enzymatycznych), a także sole mineralne i substancje służące jako regulatory osmotyczne, takie jak mannitol, sorbitol, glukoza, sacharoza (stęż. 0,3 - 0,7 M, potencjał osmotyczny około -1700 kPa do -700kPa). Dzięki obecności regulatorów potencjału osmotycznego, komórki podczas izolacji protoplastów utrzymywane są w stanie plazmolizy, co zmniejsza wrażliwość protoplastów na uszkodzenia. Protoplasty mogą być uszkadzane przez enzymy towarzyszące celulazom czy pektynazom jako ich zanieczyszczenia (enzymy te izolowane są zwykle z kultur grzybów). Takimi szkodliwymi domieszkami mogą być proteazy. Dlatego czasami mieszaniny do izolacji protoplastów zawierają jakieś białko, zwłaszcza albuminę wołową, która współzawodniczy o miejsca aktywne proteaz z białkami błon komórkowych i w ten sposób chroni te białka przed uszkodzeniem. Ponieważ izolacja protoplastów stanowi dla komórek stres, czasami dodaje się do roztworu izolacyjnego przeciwutleniaczy, które zapobiegają nagromadzaniu się aktywnych form tlenu i wywoływaniu w protoplastach zaprogramowanej śmierci. Takim przeciwutleniaczem jest zwykle ditiotreitol. Nierzadko jednak enzymy rozpuszczone są w bardzo prostej pożywce, takiej jak CPW (tabela), uzupełniona 9% mannitolem. Wśród składników mineralnych takich roztworów za szczególnie istotne i charakterystyczne uważa się sole wapnia, ponieważ jony wapnia zwiększają stabilność błon i żywotność protoplastów, a także ułatwiają regenerację ściany komórkowej (w niektórych więc procedurach zamiast pożywki CPW z mannitolem do rozpuszczania enzymów trawiących ściany komórkowe używa się roztworu samego chlorku wapnia z jakimś regulatorem osmotycznym, np. mannitolem). Z drugiej strony roztwory stosowane do izolowania protoplastów z reguły nie zawierają jonów amonowych, ponieważ jony te obniżają przeżywalność protoplastów.
Tabela 1.Pożywka CPW, która często stanowi (po uzupełnieniu regulatorem osmotycznym i enzymami) środowisko reakcji trawienia ściany komórkowej i izolowania protoplastów (Pollard J.W., Walker J.M., 1990. Plant Cell and Tissue Culture. Methods in Molecular Biology, vol. 6, str. 582, Humana Press, Clinton, New Jersey)
| Składnik | Stężenie (mM) | Stężenie (mg/l) |
|---|---|---|
| KH2PO4 | 20 | 27,2 |
| KNO3 | 1 | 101 |
| CaCl2*2H20 | 10 | 1480 |
| MgSO4*7H20 | 1 | 246 |
| KI | 0,001 | 0,16 |
| CuSO4*5H20 | 0,0001 | 0,025 |
| pH 5,8 |
Ważnym czynnikiem wpływającym na wydajność izolacji jest proporcja masy tkanki do objętości mieszaniny trawiącej i stężeń enzymów w mieszaninie. Zwykle 1 g świeżej masy tkanki poddaje się trawieniu w objętości ok. 10 ml roztworu, w którym poszczególne enzymy mają stężenia od ok. 0,5% do 2%. Na ogół enzymy rozpuszczają się dość trudno, więc roztwór trzeba mieszać długo (na przykład dwie godziny) lecz bardzo łagodnie (żeby zapobiec denaturacji enzymów). Odkażanie roztworu enzymatycznego musi oczywiście być przeprowadzone przez filtrację, czasami poprzedza się ją jednak wirowaniem, żeby usunąć nierozpuszczone cząstki białka, które mogłyby łatwo zakleić filtr do odkażania. Materiałem biologicznym wykorzystywanym jako źródło protoplastów może być zawiesina komórkowa, kalus, lub różne fragmenty roślin, zwykle jednak zaleca się, aby był to materiał pochodzący już z hodowli in vitro, tak aby bezpośrednio przed izolacją protoplastów nie trzeba było przeprowadzać odkażania. Korzystny wpływ na wydajność izolacji i zdolności regeneracyjne protoplastów może wywierać etiolacja materiału roślinnego (zmiany fizjologiczne i strukturalne wywołane uprawą w ciemności, na przykład przez dwa tygodnie). W przypadku użycia większych fragmentów tkanki, kroi się je skalpelem na paski o szerokości poniżej 1 mm, co ułatwia dostęp enzymów. Jeśli materiał stanowią liście, można spróbować usunąć epidermę odrywając ją pincetą (nie u wszystkich gatunków jest to łatwe), albo pocierając powierzchnię liścia szczoteczką do rąk, i odsłaniając w ten sposób komórki miękiszu, będące znacznie lepszym niż epiderma źródłem protoplastów, ponieważ miękisz dużo łatwiej ulega maceracji. Izolowanie protoplastów komórek epidermalnych, jakkolwiek nieco mniej wydajne, jest jednak możliwe i stosowane np. do badania fizjologii komórek szparkowych. Etap trawienia enzymatycznego ścian komórkowych może być poprzedzony tzw. preplazmolizą (wstępną plazmolizą), podczas której, materiał biologiczny jest inkubowany (na przykład przez godzinę) w roztworze, który nie zawiera enzymów, ale zawiera wszystkie pozostałe składniki mieszaniny trawiącej (czynnik buforujący, substancję osmotycznie czynną itp). Po wymianie roztworu do preplazmolizy na mieszaninę enzymatyczną zaczyna się właściwa izolacja protoplastów, którą zwykle przeprowadza się w płytce Petriego, łagodnie kołysanej (z szybkością ok. 20 - 100 obr/min, zależnie od gatunku rośliny), na świetle lub w ciemności, przez okres od kilku do kilkudziesięciu godzin, zależnie od wymagań użytego obiektu biologicznego. Wydajność enzymatycznej izolacji protoplastów jest wysoka i wynosi 100 tys. do kilkudziesięciu milionów protoplastów z 1 g tkanki.
Izolowane protoplasty powinny być oddzielone od pozostałości niestrawionej tkanki i szczątków uszkodzonych komórek. Zgrubnie można w tym celu zastosować sączenie przez sitka o znanej porowatości (powyżej 200 μm dla usunięcia dużych fragmentów tkanki, około 50 μm dla oddzielenia komórek i protoplastów od szczątków uszkodzonych komórek i in. drobnych zanieczyszczeń). Do oczyszczania protoplastów stosuje się też często wirowanie. Protoplasty zawieszone są w odpowiednio gęstej pożywce (np. zawierającej dużo sacharozy - ok. 100 g/l) i podczas wirowania pływają w górnej warstwie pożywki, podczas gdy komórki zawierające ścianę komórkową, opadają na dno. Takie przemywanie protoplastów nazywane jest flotacją (podobnie jak każdy inny proces oczyszczania nierozpuszczalnych substancji na podstawie ich zróżnicowanej zdolności do pływania na powierzchni jakiegoś płynu).
Jakość izolowanych protoplastów, ich żywotność, można badać metodami, które przedstawimy dokładniej przy omawianiu hodowli komórkowych (Rozdział 6.5), tj. przy pomocy błękitu Evansa (uwidaczniającego komórki z uszkodzonymi błonami) lub dwuoctanu fluoresceiny (mierzącej aktywność esteraz).
W początkowym okresie (przed regeneracją ściany komórkowej) protoplasty mają duże wymagania pokarmowe i łatwo tracą metabolity, dlatego hodowle prowadzone są w małej objętości płynnej pożywki (tworzącej kilkumilimetrową warstwę, albo krople "siedzące" na dnie szalki, ewentualnie krople "wiszące" na wieczku szalki) albo w cienkiej warstwie miękkiego agaru na płytkach Petriego. Opisano też układ hodowli w agarozowych kulkach. W tym przypadku zawiesina protoplastów mieszana jest z roztworem agarozy, ochłodzonej do 36°C, a następnie pipetowana drobnymi kroplami na dno płytki Petriego. Gdy agaroza się zestali, agarozowe kulki zalewane są niewielką ilością płynnej pożywki.
Do hodowli protoplastów znajduje zastosowanie pożywka Murashigego-Skooga, czasami zmodyfikowana, a często także, znacznie od niej bogatsza, pożywka Kao Michayluka.
Można też wykorzystywać pożywkę przystosowawczą (tj. kondycjonowaną, czyli "oswojoną" przez hodowanie na niej przez krótki czas innej, szybko rosnącej kultury). Możliwe jest też naniesienie zawiesiny protoplastów na błonę stykającą się z szybko rosnącą kulturą tkankową (zwłaszcza kalusem). Taka błona pozwala na przenikanie aminokwasów i witamin z kultury tkankowej do zawiesiny protoplastów, ale pozwala jednocześnie na dokładne oddzielenie tej kultury od mikrokalusów powstających z protoplastów. Pożywka ma podwyższony potencjał osmotyczny, dzięki czemu plazmoliza cofa się.
Pierwszym wynikiem hodowli protoplastów jest regeneracja ściany komórkowej, obserwowana po kilku dniach, później następuje wznowienie podziałów i w niektórych przypadkach (nadal dość nielicznych) - regeneracja roślin. Znacznie trudniejsze do pobudzenia są podziały komórek zregenerowanych z protoplastów roślin jednoliściennych niż dwuliściennych. Stosunkowo łatwo jest pobudzić protoplasty do regenerowania roślin u mszaków. Drobne kolonie otrzymane z protoplastów nazywamy protoklonami lub mikrokalusami. Wydajność wysiewu protoplastów (częstość tworzenia przez nie mikrokalusów) waha się w opublikowanych procedurach, zależnie od rośliny i metody, w zakresie 0,1% do 80%. Rośliny regenerowane z jednego kalusa powinny stanowić klon, a więc wykazywać identyczny genotyp. Dosyć często jednak obserwuje się zmienność somaklonalną, która w tym typie hodowli bywa też nazywana zmiennością protoklonalną.
4.2 Fuzjonowanie protoplastów
W płynnej pożywce protoplasty mogą spontanicznie łączyć się, zlewając się jakby ze sobą. Zjawisko to zachodzi jednak dość trudno, bo błona cytoplazmatyczna komórek zawiera różnego rodzaju kwasy tłuszczowe, które ze względu na obecność grup COO- nadają błonie ładunek ujemny. Tę niechęć protoplastów do wchodzenia we wzajemne kontakty można neutralizować przy pomocy czynników pobudzających fuzję protoplastów, zwanych fuzogenami.
Można wyróżnić następujące ich rodzaje:
środki chemiczne, a zwłaszcza glikol polietylenowy (PEG, ok. 20%; wykorzystuje się tu formę PEG o masie cząsteczkowej 6000 - 8000Da ) w połączeniu z wysokim pH (ok. 9 - 10) i wysoką zawartością jonów wapnia (ok. 50 mM)
impulsy pola elektrycznego - stosowane są dwuetapowo: I faza - zmienne pole o wysokiej częstotliwości i niskim natężeniu (0,5 - 4 MHz, 100 - 200 V/cm); II faza - krótkotrwały impuls prądu stałego (2 do 30 μs, 1000 - 2000 V/cm) lub kilka takich impulsów w kilkusekundowych odstępach
[ultradźwięki]
[mikromanipulator]
Spośród powyższych fuzogenów czy środków pobudzających fuzjonowanie protoplastów, dwa ostatnie znajdują zastosowanie nieporównanie rzadziej niż metody 1- 2. Fuzogeny powodują przejściowe powstawanie uszkodzeń błony komórkowej, a to ułatwia połączenie się cytoplazmy różnych komórek. Działanie fuzogenami chemicznymi może odbywać się w niewielkiej objętości zawiesiny w zagłębieniu plastykowej mikropłytki (metoda "mikro"), albo w nieco większej objętości, w probówce wirowniczej (metoda "makro"). W metodzie "mikro" protoplasty obu linii komórkowych miesza się delikatnie po czym dodaje się do nich roztwór fuzogena i inkubuje w nim przez około 10 minut. Po tym czasie (w którym nie tylko następuje fuzja, ale też protoplasty opadają na dno komory) pipetą usuwa się ostrożnie większą część roztworu (zawierającego fuzogen) i zastępuje się go roztworem płuczącym. Płukanie powtarzane jest dwukrotnie, po czym roztwór płuczący zastępowany jest pożywką. W metodzie "makro" zawiesiny protoplastów łączy się w probówkach wirowniczych, dodaje do nich fuzogenu i poddaje łagodnemu wirowaniu. Wirowanie przydaje się również do przepłukania produktów fuzji, dokładnego usunięcia fuzogenu i zastąpienia go pożywką.
Nie ma ograniczeń związanych z ewolucyjną odległością łączonych w ten sposób komórek. Na przykład uzyskiwano fuzje pomiędzy protoplastami roślinnymi, a komórkami ludzkimi. W praktyce jednak, jeśli różnica pomiędzy łączonymi komórkami jest większa niż różnica gatunków czy rodzajów, to produkt fuzji nie przechodzi podziałów komórkowych, albo po kilku podziałach zamiera. Do ciekawszych roślin otrzymanych tym sposobem należą mieszańce ziemniak + pomidor nazywane po angielsku topato i pomato (przypominamy, że gdy mowa o mieszańcach somatycznych, formy rodzicielskie łączymy znakiem +, a nie symbolem mnożenia x, jak w przypadku "zwykłych" czyli generatywnych mieszańców).
Częstość zlewania się protoplastów przy stosowaniu fuzogenów wynosi 1-20% , a wśród produktów fuzji tylko niewielką część (np. około 10%) stanowią pożądane kombinacje. Oznacza to zwykle przede wszystkim heterokariocyty (= heterokariony), czyli produkty połączenia dwóch protoplastów różnych genetycznie (na przykład pomidor + ziemniak, w przeciwieństwie do homokariocytów, tj. komórek powstałych z połączenia dwóch protoplastów o tym samym genotypie, np. ziemniak + ziemniak). Heterokariocyty można czasami rozpoznać na podstawie ich wyglądu. Jeśli jedna populacja poddawanych fuzjonowaniu protoplastów powstała z drobnych, zielonych komórek miękiszu asymilacyjnego, a druga z większych, bezbarwnych komórek kalusa (hodowanego w ciemności), to jako heterokariocyty można będzie rozpoznawać komórki duże, zawierające jednak wyraźne, zielone, skupiska chloroplastów. Selekcję wzrokową heterokariocytów można ułatwić sobie, barwiąc przyżyciowo obie populacje fuzjonowanych protoplastów różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Na przykład jedna populacja protoplastów barwiona jest FDA (dwuoctanem fluoresceiny) dającym w nadfiolecie żółtozieloną fluorescencję, a druga izoticoyjanianem rodaminy B, dającym czerwoną fluorescencję. Ostatecznie w mikroskopie fluorescencyjnym wyszukuje się protoplasty, które silnie świecą światłem jednej barwy, ale zawierają też obszar świecący w drugim kolorze. W niektórych przypadkach stosowano selekcję heterokariocytów opartą na ich odporności na antybiotyki (każda linia rodzicielska odporna jest na inny antybiotyk, a heterokariocyty odporne są na oba antybiotyki).
Jeśli protoplasty otrzymano z komórek somatycznych, to wynikiem ich fuzji jest powstanie mieszańców somatycznych. Wyróżnia się następujące ich rodzaje:
symetryczne - zawierają kompletne genomy jądrowe obojga rodziców; dają początek formom allopoliploidalnym
asymetryczne - powstają przy eliminacji niektórych chromosomów lub ich części; eliminacja może dotyczyć tylko jednego genomu lub być niespecyficzną - dotyczyć składników obu genomów
cybrydy (liczba pojed. - cybryda) - mieszańce cytoplazmatyczne; ten termin stosowany jest nieco dwuznacznie: a.) komórki, które posiadają genom jądrowy tylko jednego rodzica, ale ich cytoplazma zawiera plastydy i mitochondria obu form rodzicielskich; b.) komórki zawierające jądro komórkowe jednego rodzica, a cytoplazmę tylko drugiego rodzica (innego niż dawca jądra). Cybrydy pierwszego typu mogą powstawać w wyniku zlania się pełnego protoplastu z cytoplastem, czyli protoplastem pozbawionym jądra komórkowego. Cytoplasty powstają podczas oczyszczania protoplastów metodą wirowania (usunięcie jądra, czyli enukleację, można dodatkowo wywołać traktując protoplaty cytochalazyną B, po czym przeprowadza się gradientowe ich wirowanie). Podobnie powstają mikroprotoplasty i mikroplasty. Mikroprotoplasty to fragmenty protoplastów zawierające tylko jeden lub kilka chromosomów i drobną część komórkowej cytoplazmy, a mikroplasty, to fragmenty protoplastów zawierające tylko drobną część komórkowej cytoplazmy, z błoną cytoplazmatyczną a bez materiału jądrowego. Możliwe jest kontrolowane, wybiórcze unieczynnianie (uszkadzanie) genomu jądrowego lub cytoplazmatycznego w protoplastach. Temu pierwszemu zadaniu służy napromieniowanie komórek promieniami γ, X (ok. 10 - 20 krad), lub nawet UV, natomiast do unieczynnienia cytoplazmatycznego materiału genetycznego znajduje zastosowanie jodooctan (ok. 0,5 - 30 mM) lub rodamina 6G (rhodamine 6G; 0,1 - 0,5 mM). Po kilkunastu minutach inkubacji protoplastów w roztworze unieczynniającym genom cytoplazmatyczny, roztwór ten jest ostrożnie odciągany, a protoplasty kilkakrotnie płukane. Fuzjonowanie protoplastów poddanych działaniu promieni gamma z protoplastami traktowanymi jodooctanem prowadzi do powstania komórek, które możemy nazwać cybrydami w drugim z podanych wyżej znaczeń (b). Podobny wynik daje fuzja cytoplasta z karioplastem. Karioplast jest złożony z jądra komórkowego pozbawionego większości cytoplazmy, otoczonego jedynie cieniutką jej warstwą oraz błoną komórkową.Ogólnie protoplasty, które utraciły genom cytoplazmatyczny lub jądrowy, albo jego część, nazywamy subprotoplastami, zaliczamy więc do nich mikroprotoplasty, karioplasty, mikroplasty i cytoplasty.
Wykorzystując cytoplasty można atrakcyjnej odmianie roślin nadać dodatkową właściwość, zakodowaną w genomie cytoplazmatycznym, nie naruszając struktury jej genomu jądrowego. Na przykład hodowcy często zainteresowani są wprowadzeniem do cennej linii hodowlanej cechy męskiej sterylności (niepłodności pyłku; rośliny takie mogą być łatwo wykorzystane do krzyżowań jako żeńskie linie rodzicielskie; można być pewnym, że nie dojdzie u nich do samozapylenia i nie ma potrzeby pracochłonnego usuwania wszystkich pylników z kwiatów). Cecha męskiej sterylności jest kodowana w genomie cytoplazmatycznym, a dokładniej mitochondrialnym. Wystarczy więc fuzjonować protoplasty wybranej cennej linii hodowlanej z cytoplastami roślin męskosterylnych by przenieść cechę cytoplazmatycznej męskiej sterylności, nie zmieniając przy tym wielu innych ważnych właściwości rośliny, zakodowanych w genomie jądrowym. Otrzymywanie cybryd zawierających pojedynczy genom jądrowy i pojedynczy genom cytoplazmatyczny (cybrydy typu "b" w powyższym opisie) ułatwia też selekcję komórek mieszańcowych. W cybrydach następuje komplementacja (uzupełnianie się, współdziałanie) genomów i dzięki temu mogą one stosunkowo szybko odtwarzać ścianę komórkową i dzielić się. Natomiast inne protoplasty występujące w takim doświadczeniu albo nie są w stanie dzielić się, ze względu na brak genomu jądrowego, albo przechodzą podziały bardzo opóźnione, ze względu na przejściowe unieczynnienie genomu cytoplazmatycznego.
Somatyczne mieszańce otrzymywano stosunkowo często u roślin z rodzin Solanaceae, Brassicaceae, Fabaceae, Poaceae. Uzyskane w ten sposób mieszańce mogą być płodne (zwykle w przypadku krzyżowania blisko spokrewnionych gatunków) lub bezpłodne. W niektórych przypadkach udawało się przywrócić im płodność podwajając ich genom (w wyniku kolchicynowania).
Otrzymanie mieszańca somatycznego jest wstępem do prac hodowlanych, w których nowo wprowadzone cechy użytkowe "komponowane" są z innymi właściwościami roślin; np. po wprowadzeniu odporności na patogeny należy zoptymalizować właściwości smakowe, wartość odżywczą, plenność itp. (jeśli mieszaniec jest płodny to dalsze prace mogą być prowadzone metodami klasycznej hodowli).
Jeśli celem prac jest otrzymanie nie formy pośredniej, wykazującej mniej więcej w tym samym stopniu cechy obu rodziców, ale otrzymanie formy zbliżonej do jednego z rodziców pod względem większości cech, a po drugim rodzicu dziedziczącej tylko jedną czy kilka właściwości, to otrzymany mieszaniec powinien być przez wiele następnych pokoleń krzyżowany z rodzicem, którego właściwości mają w pożądanych roślinach dominować (krzyżowanie wypierające).
6.1 Definicja kultury zawiesinowej
Kulturę zawiesinową można zdefiniować jako zbiór pojedynczych, szybko dzielących się komórek zawieszonych w płynnej pożywce. Definicja ta określa jednak zawiesinę "idealną", jakiej prawie nie daje się zaobserwować. W rzeczywistości bowiem w hodowlach zawiesinowych oprócz pojedynczych komórek występują także różnej wielkości skupiska (agregaty komórkowe). Agregaty komórkowe mogą być mikroskopijne, zbudowane z od kilku do około kilkudziesięciu komórek, lub większe, o średnicy do kilku mm. Pożywka w której prowadzi się hodowlę zawiesinową jest stale wytrząsana lub mieszana, co zapewnia jej dobre napowietrzenie i jednorodność pod względem składu chemicznego, a ponadto przyczynia się do rozproszenia namnażających się komórek.
6.2 Materiał roślinny wykorzystywany do zakładania kultur zawiesinowych
Do otrzymania zawiesin komórkowych wykorzystywane są różnego rodzaju eksplantaty, najczęściej zaś młody, luźny kalus, zmacerowane zarodki oraz drobno pokrojone fragmenty siewek, np. wierzchołki pędu, blaszki liściowej lub korzeni. Jednakże używając eksplantatów pierwotnych wyizolowanych bezpośrednio z roślin, należy liczyć się z tym, że wzrost hodowli zawiesinowej może ulec znacznemu opóźnieniu ze względu na gwałtowną zmianą środowiska i dużą spoistość tkanek roślinnych. Z tych powodów inne niż kalus typy tkanek wykorzystywane są stosunkowo rzadko. Kalus używany do zapoczątkowania hodowli zawiesinowej musi mieć postać miękkiej tkanki z luźno ułożonych komórek, tak by po umieszczeniu w płynnej, wytrząsanej pożywce, uległ rozbiciu na drobne fragmenty lub nawet pojedyncze komórki. Eksplantaty, używane do założenia zawiesiny komórkowej muszą być zupełnie wolne od drobnoustrojów. Również z tego powodu materiał roślinny używany jako eksplantat pochodzi najczęściej już z hodowli in vitro.
6.3 Pożywki dla kultur zawiesinowych
Poszukując składu pożywki najodpowiedniejszego dla hodowli zawiesinowej, często przyjmuje się za punkt wyjścia pożywkę stosowaną do innego rodzaju kultur in vitro u tego samego gatunku, zwłaszcza do hodowli kalusa, bo w obu przypadkach występuje podobny typ wzrostu (nieuorganizowany). Zaleca się jednak uwzględnianie następujących osobliwości kultur zawiesinowych w porównaniu z hodowlami prowadzonymi na podłożach stałych:
kontakt komórek z pożywką jest w zawiesinie ściślejszy, bardziej bezpośredni, należy się zatem spodziewać intensywniejszego pobierania składników pożywki;
skupiska komórek są małe, w związku z czym komórki mają ograniczone możliwości wzajemnego odżywiania się substancjami organicznymi (metabolity "wyciekają" z komórek i ulegają silnemu rozcieńczeniu w całej objętości pożywki).
Teoretycznie pożywka dla kultury zawiesinowej komórek powinna więc zawierać składniki mineralne i hormony w nieco niższym stężeniu niż pożywka stała, natomiast pozostałe substancje organiczne w większej ilości. Koniecznym może się także okazać uzupełnienie składu o dodatkowe witaminy, aminokwasy, itp. Do płynnych pożywek nie dodaje się oczywiście substancji zestalających, takich jak agar. Zakres stosowanego pH waha się w od 5,5 do 6,0, a najczęściej wynosi około 5,8, jest więc podobny jak w pożywkach agarowych. Zaleca się zachowanie odpowiedniego stosunku masy eksplantatu wyjściowego do objętości pożywki (z reguły 1 do kilku gramów na 100 cm3 pożywki) i stosunku objętości hodowli do pojemności naczynia hodowlanego (objętość zawiesiny powinna stanowić około 1/5 do 1/4 pojemności naczynia). Czasami, choć raczej rzadko, w poczatkowym okresie hodowli wykorzystuje się pożywkę przystosowawczą (ang. conditioned), czyli pożywkę, w której przez kilka dni intensywnie rosły komórki innego gatunku. W takiej "oswojonej" pożywce wyjściowe składniki pokarmowe nie są jeszcze wyczerpane, a jest ona wzbogacona o metabolity niezbędne komórkom mniej skłonnym do szybkiego wzrostu.
6.4 Sprzęt do prowadzenia kultur zawiesinowych
Hodowle zawiesinowe prowadzi się najczęściej w różnej pojemności kolbach stożkowych (erlenmajerkach). Rzadziej wykorzystuje się probówki i inne specjalnie przystosowane naczynia (np. kolby z bocznym tubusem ułatwiającym ocenę ilości osadu, kolby z wypustkami ułatwiającymi rozdrobnienie eksplantatów i agregatów komórkowych). W przypadku hodowli komórek na dużą skalę stosuje się różnego rodzaju fermentory (urządzenia podobne do stosowanych w biotechnologii mikrobiologicznej), o automatycznie kontrolowanym działaniu. System hodowli może być:
okresowy (półciągły), z okresową zmianą pożywki czyli przenoszeniem (pasażowaniem) próbki hodowli (inoculum) do świeżej pożywki
ciągły, ze stałym przepływem pożywki; w obrębie zaś hodowli typu ciągłego wyróżnić można systemy:
zamknięty - do naczynia hodowlanego stale wprowadzana jest pożywka świeża, a odprowadzana z niego zużyta; komórki nie są stale odprowadzane, w związku z tym ich biomasa w zawiesinie stopniowo rośnie
otwarty - przyrost komórek równoważony jest odprowadzeniem określonej objętości zawiesiny i dopływem świeżej pożywki, tak że gęstość hodowli (liczba komórek w jednostce objętości) utrzymywana jest na mniej więcej stałym poziomie.
Warunkiem zbudowania systemu ciągłego otwartego hodowli jest stworzenie automatycznego układu analizującego gęstość zawiesiny i dostosowującego do niej szybkość odprowadzania zawiesiny i dodawania świeżej pożywki. Łatwym do zmierzenia wskaźnikiem gęstości hodowli jest stopień jej zmętnienia. Bioreaktory, które mierzą ten parametr i dostosowują do niego warunki hodowli nazywa się turbidostatami. Do pewnego stopnia można kontrolować gęstość zawiesiny precyzyjnie dozując jeden ze składników pożywki, silnie wpływający na częstość podziałów komórkowych. Bioreaktory pracujące na tej zasadzie nazywa się chemostatami.
W zależności od naczyń używanych do prowadzenia kultury zawiesinowej stosuje się różne typy urządzeń zapewniających mieszanie i napowietrzanie zawiesiny. Probówki zamocowuje się pod odpowiednim kątem na obrotowych platformach, kolby umieszcza się na wytrząsarkach (nadających im ruchy eliptyczne z szybkością około 100 do 180 obr./min), natomiast w kulturach prowadzonych w dużej skali wykorzystuje się mieszanie bąbelkowe (typu airlift) - strumieniem powietrza uwalnianego z zanurzonej w pożywce dyszy, albo mechaniczne - przy wykorzystaniu łopatkowych mieszadeł. Szybkość wzrostu hodowli zawiesinowej komórek może różnić się zależnie od wielkości i kształtu naczyń, ich bardziej lub mniej szczelnego zamknięcia itp.
Hodowle komórek roślinnych mogą być prowadzone zarówno na świetle (zwykle o niskim natężeniu, np. 500 - 1000 luksów), jak i w całkowitej ciemności, zwykle w temperaturze około 25 - 28°C.
6.5 Ocena jakościowa i ilościowa kultur zawiesinowych
Przez pierwsze dwa - trzy tygodnie prowadzona jest hodowla wstępna. W tym okresie należy ze szczególną uwagą sprawdzać czy hodowla nie brunatnieje (co może być spowodowane utlenianiem komórkowych fenoli, a powstające toksyczne związki powodują zamieranie hodowli) i czy nie pojawia się mleczne zmętnienie, co może być oznaką zakażenia.
Wszystkie manipulacje w hodowlach komórkowych muszą być przeprowadzane ze szczególną starannością ze względu na dużą podatność zawiesiny na zakażenia, spowodowaną następującymi czynnikami:
koniecznością przeszczepiania znacznie częstszego niż w hodowlach na stałych pożywkach,
ułatwionym szybkim rozprzestrzenieniem się drobnoustroju w całej objętości hodowli w płynnej pożywce
składem pożywek bogatym w związki organiczne, co ułatwia rozwój mikroorganizmów.
Zakażenie może objawiać się zmętnieniem pożywki (głównie w przypadku bakterii) lub - w przypadku pleśni - pojawieniem się watowatych strzępek. Zakażone hodowle można jednoznacznie rozpoznać posiewając niewielkie ich ilości na podłoża mikrobiologiczne. W niektórych przypadkach udaje się uratować zakażoną hodowlę dodając do niej odpowiedni antybiotyk lub fungicyd. Najczęściej jednak zakażone hodowle muszą być po prostu usunięte.
Do dalszej hodowli pobiera się możliwie jednorodną zawiesinę, oddzielając ją od resztek eksplantatu przez sączenie przez jałowe sitka. Pasaże prowadzone są zwykle co jeden do dwóch czy trzech tygodni. Podczas pierwszych pasaży stosuje się niewielkie rozcieńczenia inoculum (do 4 x). W okresie późniejszym, kiedy otrzymamy tzw. ustaloną zawiesinę, charakteryzującą się intensywnym i powtarzalnym w kolejnych pasażach przyrostem komórek, stosujemy rozcieńczenia ok. dziesięciokrotne.
W ocenie stanu zawiesiny pierwszorzędne znaczenie ma określenie szybkości namnażania komórek i ich zagęszczenia. W tym celu można po prostu policzyć komórki w próbce zawiesiny, wykorzystując do tego mikroskop i hemocytometr (szkiełko mikroskopowe z naniesioną siatką linii, przeznaczone głównie do liczenia krwinek). Zastosowanie hemocytometru jest nieco utrudnione przez fakt, że komórki roślinne są na ogół znacznie większe od krwinek, a poza tym jak już wspomniano, mogą tworzyć wielokomórkowe agregaty. W celu możliwie dokładnego policzenia komórek agregaty należy rozbić. Częściowo można to uzyskać pompując zawiesinę wielokrotnie pipetą lub strzykawką. W przypadku większych i bardziej spoistych agregatów konieczna może być maceracja chemiczna przy pomocy kwasu chromowego (20%) lub solnego (1 - 5 M) z ogrzewaniem na łaźni wodnej (60°C, 30 min) trójchlorooctowego (50%, w temp. pokojowej, do 30 min) lub enzymatycznie przy pomocy pektynazy i celulazy (37°C, kilka godzin). W podanych warunkach zwykle nie uzyskuje się całkowitego rozpadu agregatów, ale w drobnych skupiskach złożonych z kilku komórek można je już łatwo policzyć. Ze względu na to, że oznaczanie liczby komórek jest czynnością praco- i czasochłonną, coraz częściej stosuje się parametr uproszczony w postaci liczby jednostek (UN) na 1 cm3, a za jednostkę przyjmuje się zarówno pojedyncze komórki jak i agregaty. Jest to jednak wskaźnik mniej dokładny i wymaga ustalenia średniej liczby komórek na jednostkę. O liczbie komórek w zawiesinie można też wnioskować na podstawie parametrów pomocniczych, takich jak:
świeża masa; zawiesina sączona jest przez filtr, który został wcześniej zważony, albo poddawana wirowaniu w zważonej wcześniej probówce wirowniczej; czasami dodatkowo oznacza się zawartość białka w masie komórek lub objętości hodowli
sucha masa - komórki suszy się do stałej masy w temp. 70 - 120°C
całkowita objętość komórek (ang. packed cell volume; PCV) - określoną objętość zawiesiny, na przykład 10 ml, wiruje się delikatnie w kalibrowanych porbówkach (300 g x 5 min), a następnie odczytuje objętość jaką zajmują komórki (zwykle wyrażając ją w % objętości zawiesiny)
objętość komórek po sedymentacji (ang. sedimented cell volume; SCV) - kolby z hodowlami odstawiane są na krótki czas (np. 15 minut) w bezruchu, lekko pochylone (60°), a potem odczytana jest na odpowiedniej skali objętość osadu (wyraża się ją zwykle w % objętości zawiesiny).
Do liczenia komórek w zawiesinie można także wykorzystać urządzenia automatyczne, takie jak licznik Coultera i cytometr przepływowy. Licznik Coultera stosowany jest głównie w analizach hematologicznych, a jego wykorzystanie w biotechnologii roślin opisywano dość sporadycznie. Urządzenie wykrywa zmiany oporu elektrycznego pomiędzy dwiema elektrodami omywanymi strumieniem słabego elektrolitu, w którym zawieszone są zliczane komórki. Pojawienie się komórki pomiędzy elektrodami powoduje chwilowy wzrost oporu. Takie elektryczne impulsy zliczane są przez komputer. Urządzenie pozwala nie tylko na oznaczanie liczby komórek, ale także ich objętości (wzrost oporu jest tym większy im większa jest objętość komórki).
Znacznie częściej wykorzystuje się do liczenia komórek cytometrię przepływową. Technika ta opiera się na pomiarach fluorescencji komórek lub ich składników wybarwionych odpowiednimi znacznikami - fluorochromami. Praktycznie każda technika cytochemiczna oparta na pomiarach fluorescencji może być zastosowana do cytometrii przepływowej. Metoda pozwala na zliczanie pojedynczych komórek lub ich składników przepływających w laminarnym (niezaburzonym) strumieniu cieczy nośnej. Odległość, na której przeprowadzany jest pomiar, pojedyncza komórka pokonuje w ciągu 1 do 50 mikrosekund, w zależności od budowy aparatu. Impulsy odbiera odpowiedni detektor (lub fotodetektory) i przekazuje sygnał do elektronicznych układów analizujących. W ciągu sekundy urządzenie może wykryć ponad tysiąc komórek. Cytometria przepływowa bywa stosowana także do oznaczania zawartości DNA w komórkach (a na tej podstawie stopnia ich ploidalności). Poza urządzeniami typowo analitycznymi, istnieją również cytometry przepływowe sortujące, które pozwalają na szybkie segregowanie komórek zależnie od ich zdolności do barwienia się różnymi fluorochromami (krople cieczy nośnej zawierające komórki otrzymują ładunek elektryczny, dobrany zależnie od ich fluorescencji i w ten sposób kierowane są do jednego z kilku naczyń odbiorczych).
Dzięki ułatwionemu pobieraniu składników odżywczych, w kulturach zawiesinowych podziały komórek następują z dużą szybkością i przyrosty biomasy są większe niż na pożywkach agarowych. W hodowli okresowej wyraźnie zwiększające się zagęszczenie komórek prowadzi do stopniowych zmian warunków hodowli - zmniejsza się dostępność składników pokarmowych, a nagromadzają się metabolity uwalniane przez komórki. Zmiany te znajdują odbicie w częstości podziałów komórek, która wykazuje wyraźną okresowość. Odkładając na osi odciętych czas, a na osi rzędnych zagęszczenie komórek lub powiązane z nim parametry pomocnicze (mierzone zwykle co 2-3 dni) otrzymujemy krzywą wzrostu.
Rys. 6.1 Krzywa wzrostu zawiesiny komórek w hodowli okresowej
W przebiegu typowej krzywej wzrostu zawiesiny hodowanej w systemie okresowym wyróżnić można 5 faz:
spoczynkową - przyrost liczby komórek jest minimalny ze względu na efekt silnego rozcieńczenia inoculum świeżą pożywką; przygotowanie do podziałów
wykładniczą - częstość podziałów wyraźnie wzrasta, zagęszczenie komórek jest jeszcze niewielkie, ale szybko się zwiększa; przyrosty liczby komórek na jednostkę czasu są coraz większe
liniową - częstośc podziałów jest w przybliżeniu stała, a liczba komórek wzrasta w jednostajnym tempie - liniowo
obniżonego tempa wzrostu - liczba komórek zbliża się do maksimum, a częstość podziałów zaczyna się obniżać
stacjonarną - liczba komórek utrzymuje się na stałym poziomie lub spada, podziały komórek ustają.
Na podstawie krzywej wzrostu określa się czas podwojenia populacji (ang. doubling time; DT; zwykle wynosi od kilku godzin do kilku dni), jak również ustala najodpowiedniejszy moment do przeszczepienia (pasażowania) zawiesiny lub pobrania próbek do doświadczeń, np. zawiesinę komórek tytoniu linii BY-2 przeszczepia się co 7 dni (co pozwala na utrzymanie dużego tempa podziałów przy ograniczeniu liczby pasaży), a do doświadczeń dotyczących reakcji komórek na stres pobiera się materiał już z 5-6 dniowych hodowli (co zapewnia możliwie najlepszy stan fizjologiczny wyjściowego materiału). Ogólnie zaleca się zwykle pasażowanie zawiesiny pod koniec fazy obniżonego tempa wzrostu lub na samym początku fazy stacjonarnej. Czasami oznacza się średni czas generacji - okres między kolejnymi podziałami komórek; wymaga to jednak użycia hodowli komórek dzielących się synchronicznie i zastosowania metod izotopowych, stąd nie jest to analiza przeprowadzana rutynowo.
Przy mniejszej gęstości wyjściowej zawiesiny i większym rozcieńczeniu inoculum faza spoczynkowa wydłuża się. Nie wszystkie wskaźniki wzrostu zawiesiny dają identyczny obraz zmian. Największy przyrost objętości i świeżej masy komórek może następować w fazie stacjonarnej, kiedy liczba komórek przestaje wzrastać.
Poza szybkością wzrostu zawiesiny interesująca jest także cytofizjologiczna charakterystyka komórek w hodowli, która może być oparta na wyznaczeniu następujących parametrów:
średnia wielkość komórek (PCV/CN = stosunek całkowitej objętości komórek do ich liczby)
indeks mitototyczny MI = liczba komórek w stadium mitozy/ całkowita liczba analizowanych komórek x 100%; zawiesina musi być utrwalona i barwiona; zwykle wynosi do kilkunastu %
liczba chromosomów; ważna ponieważ podczas hodowli może następować zmiana ploidalności komórek; jeśli ponad 50% komórek ma stałą i określoną liczbę chromosomów to wartość tę przyjmujemy jako wskaźnik ploidalności całej hodowli; im bardziej wyrównane pod względem ploidalności są komórki, tym bardziej stabilna genetycznie jest zawiesina; pośrednio można o tym samym wnioskować oznaczając zawartość DNA w komórkach (metoda cytofotometryczna)
stopień agregacji komórek - średnia liczba komórek w agregacie komórkowym
żywotność komórek; określana na podstawie
ogólnej aktywności dehydrogenaz (testu tetrazolowego) - komórki zawiesza się w roztworze czterochlorku trójfenylotetrazolowego i mierzy się szybkość powstawania czerwonego produktu utlenienia tej substancji przez komórkowe enzymy (produkt, zwany formazanem, można rozpuścić w acetonie i zmierzyć jego stężenie kolorymetrycznie)
testu aktywności esteraz - komórki barwione są dwuoctanem fluoresceiny (lub podobnymi barwnikami, np. kalceiną), który pod wpływem esteraz uwalnia fluoresceinę, nadającą komórkom (zawierającym aktywny enzym, a więc żywym) zieloną fluorescencję; częściowo ten test mierzy też integralność (szczelność) błon, bo jeśli błony komórkowe są uszkodzone, to komórki szybko tracą fluoresceinę i związaną z nią fluorescencję
testu integralności błon - komórki barwione są błękitem Evansa (żywe komórki opierają się napływowi do ich wnętrza barwnika, a komórki z uszkodzonymi błonami barwią się na niebiesko)
obserwacji w mikroskopie kontrastowo-fazowym - widoczne ruchy cytoplazmy po mostkach cytoplazmatycznych typowe są dla żywych komórek (jakkolwiek stres może silnie pobudzać te ruchy); widoczna czasem plazmoliza jest typowa dla komórek przechodzących apoptozę (zaprogramowaną śmierć); nekroza - śmierć nie związana z uruchomieniem komórkowego mechanizmu samozagłady nie objawia się plazmolizą
oceny wydajności wysiewu komórek (ang. plating efficiency) - komórki wysiewane są cienką warstwą w płytce Petriego, na powierzchni agarowej pożywki, albo wymieszane z ostudzoną pożywką agarową, przed jej zastygnięciem; pożywka ma zwykle skład taki jak dla zawiesiny, tyle że jest zestalona; ocenia się liczbę i wielkość wytworzonych kolonii w stosunku do liczby wysianych komórek (wyraża się w %; sięga 50%; czasami w uproszczeniu ocenia się plon wysiewu, czyli liczbę kolonii na płytce, bez liczenia wyjściowej liczby komórek; oczywiście ten parametr jest znacznie mniej miarodajny); metoda ta pozwala też na dobranie optymalnej gęstości wysiewu; im lepiej dobrana pożywka dla danego typu komórek, tym mniejsza jest wymagana gęstość wysiewu; w tej samej zawiesinie mogą występować komórki i agregaty komórkowe wyraźnie różniące się wydajnością wysiewu.
Zwiększeniu jednorodności hodowli służy frakcjonowanie komórek. W najprostszej wersji pasażuje się zawiesinę, pobierając najwyższą jej warstwę, po tym jak przez kilka minut była pozostawiona w bezruchu i najcięższe agregaty opadły na dno. Precyzyjniejsze jest sączenie zawiesin przez metalowe lub plastikowe, sterylne sitka o dokładnie znanej wielkości oczek, albo ultrawirowanie różnicowe (w gradiencie sacharozy albo Percolu). Frakcjonowanie komórek pozwala osiągnąć częściową ich synchronizację co do fazy cyklu komórkowego. Pełniejszą synchronizację osiąga się przez okresowe głodzenie hodowli, powodujące, że wszystkie komórki dochodzą do pewnego etapu cyklu komórkowego i pozostają w tej fazie, ponieważ nie są w stanie przejść do następnego etapu cyklu bez brakującego im składnika pożywki. Potem ponownie wprowadza się tę substancje do pożywki, albo przenosi komórki do świeżej pożywki i wszystkie komórki, które tylko na tę okazję czekały przystępują do następnego etapu cyklu mitotycznego. Opisywano synchronizowanie komórek przez głodzenie ich pod względem auksyn, cytokinin, jonów fosforanowych albo azotu. Na przykład brak 2,4-D w pożywce utrzymywał komórki tytoniu i marchwi w fazie G1. Inną metodą synchronizacji jest użycie inhibitorów syntezy DNA, takich jak 5-aminouracyl, tymidyna (w dużym stężeniu), hydroksymocznik. Po pewnym okresie działania inhibitora, komórki są zebrane (sączenie lub wirowanie), przepłukane świeżą pożywką i zawieszone w takiej pożywce (oczywiście już bez inhibitora). Powoduje to, że wiele komórek jednocześnie wkracza w fazę S cyklu mitotycznego.
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Kultury in vitro roslin rozmnazanie klonalne
rozmnazanie in vitro roslin, ogrodnictwo VII semestr, Od Mateusza S, materiały sggw, SGGW materiały
Kultury in vitro roslin rozmnazanie klonalne
Kultury in vitro roślin wyp lab
kultury in vitro Rosliny transgeniczne
1 1 Podstawowe definicje; główne kierunki przemian rozwojowych roślinnych tkanek in vitro(1)
zastosowanie roślinnych kultur in vitro w biotechnologii, architektura krajobrazu
kolokwium in vitro 2006, KULTURY ROŚLIN
Kolokwia,egzaminy, Coll4biot07, Biotechnologia roślin ogrodniczych, kultury in vitro
Mikrorozmnazanie roślin w hodowlach in vitro
Kolokwia,egzaminy, Coll4biotzaoczni07, Biotechnologia roślin ogrodniczych, kultury in vitro
1 1 Podstawowe definicje; główne kierunki przemian rozwojowych roślinnych tkanek in vitro(1)
wprowadzenie do in vitro dowolnej rosliny
in vitro, studia rolnictwo, rok IV
In vitro antitumor actions of extracts
In vitro truskawka id 212540 Nieznany
więcej podobnych podstron