Wydział Chemiczny Politechniki Gda
ń
skiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe ro
ś
lin i zwierz
ą
t
Mikrorozmna
Ŝ
anie ro
ś
lin prowadzonych w kulturach in vitro
Wst
ę
p.
Mikrorozmna
Ŝ
anie jest metod
ą
rozmna
Ŝ
ania wegetatywnego w kulturze
in vitro, u
Ŝ
ywan
ą
do masowego mno
Ŝ
enia ro
ś
lin na skal
ę
produkcyjn
ą
. Dynamicznie
rosn
ą
ce
komercyjne
znaczenie
tej
gał
ę
zi
produkcji
ro
ś
linnej
znajduje
odzwierciedlenie w jej współczesnej nazwie: przemysł in vitro (ang. in vitro industry,
the micropropagation industry).
Metoda kultury in vitro była doskonalona od pocz
ą
tku XX wieku,
lecz rozmna
Ŝ
anie ro
ś
lin na skal
ę
produkcyjn
ą
z jej zastosowaniem stało si
ę
mo
Ŝ
liwe
dopiero od 1965 roku, kiedy to Murashige w USA opracował sposób klonalnego
rozmna
Ŝ
ania storczyków. Metod
ę
t
ę
zaadoptowano do rozmna
Ŝ
ania innych wa
Ŝ
nych
gospodarczo ro
ś
lin, głównie ozdobnych i sadowniczych. Obecnie jest ona najszerzej
wykorzystywan
ą
technik
ą
w biotechnologii. Znalazła zastosowanie przede wszystkim
w produkcji takich ro
ś
lin, które trudno rozmna
Ŝ
aj
ą
si
ę
wegetatywnie za pomoc
ą
metod tradycyjnych (ro
ś
liny ozdobne, drzewa le
ś
ne, odmiany heterozygotyczne),
oraz ro
ś
lin elitarnych, o du
Ŝ
ej warto
ś
ci jednostkowej. Tylko w niewielkim stopniu
słu
Ŝ
y ona dotychczas w rozmna
Ŝ
aniu ro
ś
lin rolniczych (ziemniaków, zbó
Ŝ
, ro
ś
lin
tropikalnych. Mikrorozmna
Ŝ
anie mo
Ŝ
na te
Ŝ
wykorzysta
ć
do rozmna
Ŝ
ania form
poliploidalnych czy aneuploidalnych, których rozmna
Ŝ
anie generatywne daje
niejednolite potomstwo).
Liczba gatunków rozmna
Ŝ
anych za pomoc
ą
kultury in vitro wynosi obecnie
około 300, natomiast na
ś
wiecie produkuje si
ę
za pomoc
ą
kultury in vitro około
800 mln sztuk ro
ś
lin, z czego 90% stanowi
ą
ro
ś
liny ozdobne. Ocenia si
ę
,
Ŝ
e produkcja europejska wynosi około 200 mln sztuk rocznie, a najwa
Ŝ
niejszym
producentem europejskim jest Holandia (62 mln sztuk rocznie), nast
ę
pnie Francja,
Polska, Włochy i Niemcy. Oprócz krajów europejskich, czołowymi producentami
ro
ś
lin w laboratoriach in vitro s
ą
USA (110 mln szt.) i Indie (130 mln szt.). W krajach
tych głównym produktem mikrorozmna
Ŝ
ania s
ą
ozdobne ro
ś
liny doniczkowe
o dekoracyjnym ulistnieniu, a tak
Ŝ
e ro
ś
liny wa
Ŝ
ne gospodarczo np. ziemniaki, byliny,
ro
ś
liny przyprawowe.
W Polsce działa obecnie około 20 laboratoriów zajmuj
ą
cych si
ę
mikrorozmna
Ŝ
aniem, głównie ro
ś
lin ozdobnych (gerbera, ró
Ŝ
anecznik, azalia,
storczyk, fikus, lilia, chryzantema, gloksynia, go
ź
dzik, papro
ć
, primula), a tak
Ŝ
e
borówki wysokiej, truskawki,
Ŝ
urawiny i je
Ŝ
yny.
Krajowa produkcja sadzonek in vitro jest jedn
ą
z najwi
ę
kszych w Europie i
szacunkowo wynosi około 70 – 100 mln sztuk na rok. Zaspokaja ona potrzeby
rynkowe naszego kraju, ale w wi
ę
kszo
ś
ci jest eksportowana do Holandii, Anglii,
Izraela, W
ę
gier, Czech, Białorusi, Bułgarii, Turcji, USA oraz na Ukrain
ę
, Litw
ę
i
Łotw
ę
.
Laboratoria włoskie dostarczaj
ą
na rynek około 20 mln sztuk ro
ś
lin
sadowniczych, szczególnie winoro
ś
li i brzoskwi
ń
. Laboratoria belgijskie specjalizuj
ą
si
ę
w produkcji ozdobnych ro
ś
lin drzewiastych (Rhododendron).
Rozmna
Ŝ
anie wegetatywne ro
ś
lin w kulturach in vitro mo
Ŝ
na prowadzi
ć
w
oparciu o:
a) pobudzanie rozwoju p
ą
ków bocznych (metoda najlepiej poznana)
b) formowanie p
ą
ków przybyszowych bezpo
ś
rednio lub po
ś
rednio przez kalus
c) embriogenez
ę
somatyczn
ą
Embriogeneza somatyczna to proces biologiczny, podczas którego w
warunkach in vitro formuj
ą
si
ę
zarodki z komórek wegetatywnych. Otrzymane w ten
sposób zarodki mog
ą
posłu
Ŝ
y
ć
do produkcji sztucznych nasion.
Sztuczne nasiona to specjalnie spreparowane zarodki somatyczne (komórki
somatyczne, zacz
ą
tki ro
ś
liny) zdolne do regeneracji na skal
ę
komercyjn
ą
,
umieszczone w osłonce ochronno – od
Ŝ
ywczej.
Sposób prowadzenia kultury
.
Bardzo istotne znaczenie w procesie mikrorozmna
Ŝ
ania ro
ś
lin ma skład
po
Ŝ
ywki (głównie zawarto
ść
hormonów) oraz jej rodzaj (stała czy płynna). Najcz
ęś
ciej
stosuje si
ę
po
Ŝ
ywk
ę
według Murashige’a i Skooga (1962) lub jej modyfikacj
ę
,
rzadziej po
Ŝ
ywk
ę
B
5
według Gamborga i in. (1968).
W procesie mikrorozmna
Ŝ
ania mo
Ŝ
na wyró
Ŝ
ni
ć
nast
ę
puj
ą
ce etapy:
1. zało
Ŝ
enie kultury – obejmuje wyło
Ŝ
enie sterylnych eksplantatów pierwotnych
na po
Ŝ
ywk
ę
stymuluj
ą
c
ą
wytwarzanie p
ą
ków lub cebulek przybyszowych.
2. namna
Ŝ
anie – najcz
ęś
ciej prowadzi si
ę
na po
Ŝ
ywkach z wysok
ą
zawarto
ś
ci
ą
cytokinin indukuj
ą
cych tworzenie nowych p
ę
dów (mikrocebulek). Wytworzone
p
ę
dy mog
ą
by
ć
ponownie wykładane na tak
ą
sam
ą
po
Ŝ
ywk
ę
, gdzie proces ten
si
ę
powtarza. Subkultur
ę
najcz
ęś
ciej zakłada si
ę
co 4 tygodnie i przeprowadza
od 10 do 15 razy.
3. ukorzenianie p
ę
dów – przeprowadza si
ę
w zale
Ŝ
no
ś
ci od gatunku ro
ś
liny
zarówno in vitro, jak i in vivo. Stosuje si
ę
cz
ę
sto po
Ŝ
ywki z wysokim st
ęŜ
eniem
auksyn, obni
Ŝ
on
ą
zawarto
ś
ci
ą
soli mineralnych oraz dodatkiem w
ę
gla
aktywnego.
Celem mikrorozmna
Ŝ
ania jest uzyskanie du
Ŝ
ej liczby genetycznie
jednolitych ro
ś
lin. W trakcie trwania kultury in vitro mo
Ŝ
e by
ć
zachowana stabilno
ść
genetyczna materiału ro
ś
linnego lub mo
Ŝ
e wyst
ą
pi
ć
spontaniczna zmienno
ść
(tzw.
zmienno
ść
somaklonalna), w wyniku której regenerowane ro
ś
liny mog
ą
wykazywa
ć
,
na pewien czas lub na trwałe, inne cechy ni
Ŝ
wyj
ś
ciowy materiał rodzicielski.
W mikrorozmna
Ŝ
aniu zmienno
ść
jest wad
ą
, ale stwierdzono,
Ŝ
e mo
Ŝ
e ona by
ć
nowym
ź
ródłem zmienno
ś
ci genetycznej mo
Ŝ
liwym do wykorzystania w hodowli
twórczej. Zmienno
ść
somaklonalna pozwala znacznie poszerzy
ć
zakres zmienno
ś
ci
genetycznej ro
ś
lin uprawnych, co jest szczególnie wa
Ŝ
ne przy ograniczonej puli
genowej lub w przypadku gatunków u
Ŝ
ytkowych, które utraciły zdolno
ść
do
rozmna
Ŝ
ania generatywnego. Zmiany w kulturach in vitro mog
ą
dotyczy
ć
tak
Ŝ
e
takich wła
ś
ciwo
ś
ci ro
ś
lin, których nie mo
Ŝ
na osi
ą
gn
ąć
na drodze konwencjonalnej.
Zalet
ą
zmienno
ś
ci somaklonalnej jest tak
Ŝ
e mo
Ŝ
liwo
ść
uzyskania ro
ś
lin ró
Ŝ
ni
ą
cych
si
ę
tylko jedn
ą
cech
ą
przy zachowaniu innych cech odmianowych. Jej wykorzystanie
jest równie
Ŝ
ta
ń
sz
ą
od innych metod
ą
manipulacji genetycznej.
Zalety i wady mikrorozmna
Ŝ
ania
.
Podstawow
ą
zalet
ą
stosowania tej techniki jest mo
Ŝ
liwo
ść
uzyskania w krótkim
czasie bardzo du
Ŝ
ej ilo
ś
ci ro
ś
linek z materiału wyj
ś
ciowego. Liczba namno
Ŝ
onych
ro
ś
linek zale
Ŝ
y od odmiany, rodzaju eksplantatu, warunków fizycznych kultury,
składu po
Ŝ
ywki oraz liczby przeprowadzonych subkultur. Np. teoretyczna wydajno
ść
namna
Ŝ
ania ze
ś
redniej wielko
ś
ci cebuli w kulturze wytrz
ą
sanej wynosi 2000
mikrocebulek w ci
ą
gu 45 dni.
Stosowanie do mikrorozmna
Ŝ
ania kultur merysystemów wierzchołkowych
stwarza mo
Ŝ
liwo
ść
uwalniania materiału hodowlanego od wirusów i innych
patogenów. Im mniejszy jest izolowany merystem (0,5 do 1 mm), tym wi
ę
ksza
skuteczno
ść
eliminacji wirusa. W celu zwi
ę
kszenia prawdopodobie
ń
stwa otrzymania
zdrowych ro
ś
lin stosuje si
ę
cz
ę
sto kultur
ę
merysytemów ł
ą
cznie z termoterapi
ą
lub chemoterapi
ą
.
Inn
ą
korzy
ś
ci
ą
stosowania tej techniki jest mo
Ŝ
liwo
ść
przechowywania
zregenerowanych ro
ś
linek przez kilka miesi
ę
cy w obni
Ŝ
onej temperaturze. Pozwala
to na spokojn
ą
, rozło
Ŝ
on
ą
w czasie produkcj
ę
in vitro i wysadzanie ro
ś
lin
w optymalnym terminie. Stosuje si
ę
równie
Ŝ
długoterminowe przechowywanie in vitro
merysystemów lub p
ę
dów przez okres 2-5 lat w banku genów.
Kolejn
ą
zalet
ą
mikrorozmna
Ŝ
ania jest łatwy transport rozmno
Ŝ
onego
materiału. Szacunkowo około 40 000 ro
ś
linek mo
Ŝ
na umie
ś
ci
ć
w paczce wa
Ŝą
cej
15 kg. Ułatwia to transport i mi
ę
dzynarodow
ą
wymian
ę
materiału ro
ś
linnego.
Trudno
ś
ci, z jakimi spotyka si
ę
w trakcie mikrorozmna
Ŝ
ania:
a) bakteryjne i grzybowe ska
Ŝ
enie eksplantatów pierwotnych;
b) witryfikacja (zeszklenie) zregenerowanych ro
ś
lin;
c) trudno
ś
ci ukorzeniania i adaptacji do warunków normalnej uprawy;
d) wyst
ę
powanie niekorzystnych fizjologicznych modyfikacji w
ś
ród namno
Ŝ
onych
ro
ś
lin (np. słaby wigor tych ro
ś
lin, słaby rozwój systemu korzeniowego,
opó
ź
nienie kwitnienia).
Cz
ęść
praktyczna.
Celem
ć
wiczenia jest mikrorozmna
Ŝ
anie ro
ś
lin, pochodz
ą
cych z hodowli
in
vitro
zało
Ŝ
onych
przez
studentów
na
wcze
ś
niejszym
laboratorium.
Do mikrorozmna
Ŝ
ania wykorzystane zostan
ą
merystemy wierzchołka p
ę
du
i fragmenty łodygi.
Materiał ro
ś
linny:
3 mm eksplantaty wierzchołkowe dowolnej ro
ś
liny
1 – 3 mm fragmenty łodygi
Materiały sterylne:
Płytki Petriego
Penseta, skalpel
Po
Ŝ
ywka MS bez hormonów
Po
Ŝ
ywka MS zawieraj
ą
ca auksyn
ę
(NAA – kwas naftalenooctowy, 0.1 mg/l)
oraz cytokinin
ę
(BAP – 6 –benzyloaminopuryn
ę
, 0.5 mg/l), pH 5.8
Wykonanie
ć
wiczenia:
Ć
wiczenie wykonuje si
ę
pod wyci
ą
giem laminarnym z nawiewem sterylnego
powietrza.
1. Za pomoc
ą
sterylnej pensety, dobrze opalonej w płomieniu palnika, wyj
ąć
ro
ś
lin
ę
ze słoika i umie
ś
ci
ć
j
ą
na płytce Petriego.
2. Odci
ąć
przy pomocy skalpela około 3 mm merystem wierzchołkowy
oraz 1- 3 mm fragment łodygi, a reszt
ę
ro
ś
liny umie
ś
ci
ć
z powrotem w słoiku.
3. U
Ŝ
ywaj
ą
c dobrze opalonej pensety wyło
Ŝ
y
ć
pobrane eksplantaty pierwotne
na po
Ŝ
ywk
ę
MS: merystem wierzchołkowy na po
Ŝ
ywk
ę
MS bez hormonów,
a fragment łodygi na po
Ŝ
ywk
ę
MS z hormonami.
4. Słoiki zabezpieczy
ć
dodatkowo parafilmem, dobrze opisa
ć
i umie
ś
ci
ć
w fitotronie na około 8 tygodni.
5. Obserwowa
ć
wygl
ą
d ro
ś
lin, liczb
ę
ro
ś
lin uzyskanych z eksplantatu, szybko
ść
powi
ę
kszania si
ę
hodowli.
Przygotowanie sprawozdania.
1. Opisa
ć
sposób wykonania
ć
wiczenia.
2. Rola jednego dowolnie wybranego fitohormonu we wzro
ś
cie i rozwoju ro
ś
lin.
3. Wymieni
ć
znane (poza mikrorozmna
Ŝ
aniem) rodzaje kultur in vitro. Opisa
ć
któr
ąś
z nich.
4. Opisa
ć
sposoby uwalniania ro
ś
lin od patogenów.
Literatura uzupełniaj
ą
ca:
1. Biotechnologia ro
ś
lin. S. Malepszy, PWN 2004.
2. Wprowadzenie do biotechnologii w genetyce i hodowli ro
ś
lin. Praca zbiorowa
pod kierownictwem S. Malepszego, Wydawnictwo SGGW-AR, Warszawa
1990.
3.
www.horticentre.pl
- Skierniewicki Portal Ogrodniczy