11. Metody oznaczania aktywności enzymów. jednostki aktywności, aktywność ogólna, aktywność właściwa.
(1)spektrofotometryczne-pochłaniają światło (substraty lub produkty)
W zakresie światła widzialnego lub UV Są to najczęściej związki posiadające wiązanie podwójne lub są to związki aromatyczne lub ich pochodne. Kuweta do pomiaru powinna być termostatowana w temperaturze badanego roztworu.
(2)fluorescencyjne-są to metody bardzo czułe. Wyznaczamy aktywność bardzo niewielkiej ilości enzymów. Związki które wykorzystujemy to np. umbelifeol. Metoda ta prowadzona jest w płytkach Elisa, które składają się ze studzienek, a w nich około 50 µl mieszaniny reakcyjnej. Mierzymy na fluoroskanie, absorbancję odpowiednich związków. Metoda ta jednak jest bardzo kosztowna.
(3)met. manometryczna-stosujemy ją tylko wtedy, gdy komponent reakcji jest w stanie gazowym np. oznaczenie aktywności oksydaz (substratem jest O2) oraz dekarboksylazy (produkt CO2). Pomiary przeprowadzamy w aparacie Wartburga, oznaczając ilość uwolnionego gazu.
(4)met potencjometryczna-metoda oparta na pomiarze pH badanego roztworu. Stosuje się tu metodę ciągłego miareczkowania w pH-stacie.
(5)z odbiorem prób (np. kolorymetryczne) jest to chemiczny pomiar ubytku substratu lub przyrostu produktu, np. nieorganiczny fosfor, oznaczając tym samym aktywność fosfataz i fosforylaz.
(6)wiskozymetryczna-oparta na zmianie lepkości podczas reakcji enzymatycznej, spowodowanej rozkładem wielkocząsteczkowych substratów. Np. aktyw.enzymów proteolitycznych-rozkład pektyny. Mierzymy lepkość wyjściowego roztworu, a następnie lepkość po przeprowadzeniu reakcji enzymatycznej. Taki pomiar umożliwia pomiar szybkości początkowej.
(7)polarymetryczne-są stosowane, gdy nieaktywny optycznie substrat przekształca się w aktywny optycznie produkt lub gdy mamy różnicę w skręcalności płaszczyzny światła, np. rozkład sacharozy na fruktozę i glukozę.
Aktywność enzymów podaje się w jednostkach aktywności enzymatycznej [U] - jest to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu w ciągu 1 minuty, w standardowych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującym max szybkość reakcji. Mianem jednostki standardowej jest więc [µmol/min.]. Równie często stosowana jest jednostka zwana katalem. Określa ona tą aktywność (ilość lub wielkość aktywnośći), która przekształca 1 mol substratu w czasie 1 sekundy, czyli katal to [mol/s]. Wartością charakteryzującą preparat enzymatyczny jest aktywność właściwa wyrażana w liczbie jednostek aktywności enzymatycznej na mg białka preparatu [U/mg].
12. Metody dezintegracji komórek i tkanek. Zarówno do badania budowy jak i funkcji musimy posiadać homogeny enzym. Metody:
(1)mechaniczne
- ucieranie biomasy, tkanki z materiałem ściernym (piasek chemicznie czysty; szkiełko nakrywkowe utłoczone; wodorotlenek glinu-żel aluminiowy; kuleczki szklane-balkiny-wykonywane ze szkła organicznego o różnych średnicach; w homogenizerach z nożami tnącymi). Podczas izolacji dobrze dodać koktajl inhibitorów proteinaz.
- wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie biomasy (wstępnie utarta lub zdeintegrowana w homogenizerze szybko się zamraża, np z etanolem), ulega zamrożeniu zarówno woda wewn jak i zewn. Kryształy, które powstają powodują uszkodzenie błony kom., następnie powoli rozmraża się taką biomasę i wówczas płyn komórkowy wycieka. Często powtarza się to wielokrotnie.
- dezintegracja przy stosowaniu prasy francuskiej-pod bardzo wysokim ciśnieniem przepuszcza się zamrożoną biomasę przez szczeliny, które są mniejsze niż średnica komórek; ciśnienie powyżej 4000 Atm.(zwykle dla drobnoustrojów).
(2)chemiczne
- działanie lizozymem (bakterie G(+)).
- działanie rozpuszczalnikami organicznymi, np. poluenizacja-rozpuszczenie lipidów i treść komórkowa jest łatwiej dostępna.
Najtrudniej wyizolować enzymy błonowe, gdyż wykorzystują stabilność w kompleksie z błoną, a po oddzieleniu od błony tracą stabilność i ulegają denaturacji. Niektóre można wyizolować stosując detergenty niejonowe. Procedurę izolacji enzymu prowadzimy w temp do 4st.C. najpierw trzeba uzyskać frakcję samych białek przez wysalanie białek lub przez ich wytrącnie rozpuszczalnikami organicznymi (etanol, izopropanol, aceton-silnie schłodzony do ok.
[-20st.C] - [-25st.C]. proces przeprowadza się w kriostacie, prowadzi się go krótko 1-2 godz., aby jak największa część białka uległa denaturacji i należy tak działać, aby wytrącony osad dał się rozpuścić). W przypadku białek wysolonych roztwór trzeba odsączyć przez dializę lub filtrację żelową na sitach molekularnych.
13. Rodzaje chromatografii kolumnowej, stosowanie w preparatyce białek enzymatycznych.
Metody chromatograficzne:
(1)sączenie molekularne na sitach molekularnych. Stosuje się tu Sephandex (jest dekstranem podatnym na denaturację, jest produkowany w postaci suchych ziaren i chłonie dużo wody,np. G-2 chłonie 0,2g wody) i Bio-Gel (poliakryloamid spolaryzowany-odporny na zakażenia). Proces rozdziału trzeba prowadzić pod stałym ciśnieniem. Układ jest zamknięty, stosuje się pompy perystaltyczne, za pomocą których podaję się płyn. Należy zrównoważyć kolumnę buforem czyli równoważyć pH buforu wprowadzonego do kolumny i pH roztworu w kolumnie. Błękit dekstranowy stosowany jest do pomiaru objętości pustej kolumny. Nanosimy białko do kolumny i odbieramy równomierne frakcje, w których oznacza się absorbancję przy 280 nm (aminokwasy, aromatyczne) i przedstawiamy zależność E280 w kolejnych frakcjach od numeru frakcji (otrzymujemy wykres w postaci pików-wysokość pików odpowiada objętości eluacyjnej). Możemy oznaczyć aktywność enzymu w każdej frakcji lub aktywność sumaryczną i wtedy znajdujemy pik z tym konkretnym enzymem.
(2)chromatografia jonowymienna na roślinach naturalnych i syntetycznych. Złoże jest kationem czyli naładowane (+). Na zasadzie oddziaływań Kulombowskich. Białka mogą wiązać się słabiej lub mocniej, w przypadku kationów wiążą się białka w formie anionowej. Białka muszą posiadać pH>pI. Nanosimy białka w odpowiednim buforze, a potem je wyekludujemy. Białka, które są związane musimy wyprzeć z kolumny, więc stosujemy ekluenty o wyższej sile jonowej czyli bufory o wyższej sile jonowej.
(3)chromatografia hydrofobowa na zasadzie oddziaływań-na kolumnę nanosisię roztwór białka w soli NH4SO4 o dużych stężeniach. Białka mają powinowactwo do nośnika. Eluację prowadzimy w malejącym gradiencie soli.
(4)chromatografia przez powinowactwo-zachodzi tu specjalna sorpcja. Ligandem może być inhibitor kompetencyjny. Może to być analog substratu (wykazuje powinowactwo do centrum aktywnego). To może być Co-enzym np. NAD, FAD. W przypadku białek allosterycznych ligand może dopasowywać się do centrum aktywnego i allosterycznego. Jest to bardzo efektywna metoda. Tu kolumny zawierają jopny Ni, które kompleksją z resztami histydyny. Aby oddzielić białko możemy wprowadzić do jego geny metkę histydynową na N lub C końcu. Takie strategie stosuje się w przypadku enzymów rekombinatowych. To ułatwia jego izolację i szybszą biosyntezę. Tworzy się sorpcja z jonami N.
(5)chromatografia kowalencyjna-kowalencyjne wiązanie białka dzięki występowaniu mostków disiarczkowych. Rozdzielamy grupy tiulowe w białku, bardzo wydajna technika.
(6)chromatografia adsorpcyjna,
(7)chromatografia na matrycach ze związanymi jonami metali ciężkich.
14. Kryteria doboru metod oczyszczania białek enzymatycznych. Do rozdzielania wykorzystuje się jedną lub więcej z następujących właściwości białka: rozpuszczalność, masa cząsteczkowa, ładunek lub specyficzne dla danego białka powinowactwo wiązania. W tym celu stosuje się techniki chromatograficzne, takie jak chromatografia jonowymienna, filtracja żelowa lub chromatografia powinowactwa, chromatografia oddziaływań hydrofobowych lub techniki elektroforetyczne, takie jak ogniskowanie izoelektryczne. Inne metody elektroforetyczne, głównie elektroforezę w żelu poliakryloamidowym w obecności dodecylosiarczanu sodu, ale także PAGE stosuje się do kontroli stopnia oczyszczenia i do wyznaczenia masy cząsteczkowej oraz budowy podjednostkowej oczyszczonego białka.
15. Kryteria jednorodności białek enzymatycznych. Najbardziej użytecznym kryterium jednorodności jest elektroforeza w żelu poliakryloamidowym. Jest to najbardziej selektywna i bardzo czuła metoda. Pozwala ona jednocześnie na precyzyjne oznaczenie masy cząsteczkowej białek, jeżeli równolegle przeprowadzi się elektroforezę odpowiednich białek wzorcowych o znanej masie. Innym kryterium elektroforetycznym jest elektroogniskowanie w żelu poliakryloamidowym. O jednorodności lub niejednorodności danego preparatu enzymatycznego wnioskuje się po ilości prążków zarejestrowanych w żelu przez zabarwienie. Obecność tylko jednego prążka białkowego stanowi mocną przesłankę jednorodności danego preparatu. Niektóre enzymy można również uwidocznić w żelu wykorzystując ich aktywność katalityczną. Występowanie więcej niż jednego pasma równolegle w obu żelach wskazuje na obecność izoenzymów, natomiast obecność jednego „pasma aktywności” i więcej niż jednego pasma białkowego dowodzi zanieczyszczenia enzymu innymi białkami. Dobrym kryterium jednorodności białek jest kryterium immunologiczne. Dowodem homogenności preparatu enzymatycznego jest występowanie pojedynczego łuku precypitacyjnego immunodyfuzji lub immunoelektroforezie tego preparatu z surowicą zawierającą odpowiednie przeciwciała. Metoda ta jest jednak stosunkowo rzadko używana ze względu na znaczną ilość preparatu potrzebną do immunizacji zwierząt oraz długi czas eksperymentu.