Analiza DNA - ćwiczenia 2
Elektroforeza w żelu agarozowym
1)Przygotować 2% żel agarozowy w buforze TBE . Naważkę agarozy rozpuścić w TBEx1, podgrzać
do temperatury 100°C, tak aby agaroza nie tworzyła widocznych agregatów. Ostudzić
przygotowany roztwór.
2)
Wlać roztwór agarozy do uprzednio przygotowanej formy (stolik elektroforetyczny) z
umocowanym grzebieniem formującym studzienki do nanoszenia próbek.
3)
Po zastygnięciu agarozy zalać żel buforem elektroforetycznym TBEx1, powierzchnia buforu
powinna znajdować się około 1 cm ponad górną powierzchnią żelu. Powoli wyjąć grzebień, tak
aby nie uszkodzić studzienek żelu.
4)
Wymieszać w probówce eppendorfa 10 μl wcześniej przygotowanego DNA i 2μl buforu
obciążającego, dokładnie wymieszać, całość nanieść na żel.
5) Podłączyć elektrody aparatu do elektroforezy do zasilacza.
6) Elektroforezę prowadzić przez 1 godz. przy napięciu 80 V.
7) Po zakończeniu elektroforezy żel wybarwić w bromku etydyny (5μg/ml) około 5 min
8) Żel obejrzeć w świetle UV λ= 320 nm
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
1) Przygotować 8% roztwór akrylamidu (stężenie wyjściowe 30%) w buforze TBEx1
2) Umyte i odtłuszczone płyty szklane złożyć (wkładając pomiędzy nie uszczelkę), całość
przymocować klipsami do podstawki do wylewania żelu.
3) Wlać roztwór akrylamidu do momentu wypełnienia całej powierzchni pomiędzy płytami.
4) Włożyć grzebień. Polimeryzacja żelu trwa 30 min, po spolimeryzowaniu wyjąć uszczelkę, umieścić
płyty w aparacie do elektroforezy.
5)
Napełnić aparat buforem TBEx1. Wyjąć grzebień, przepłukać studzienki buforem
elektroforetycznym.
6)
Przygotowane wcześniej próbki DNA zmieszać z buforem obciążającym (15 μl DNA + 3 μl buforu
obciążającego) i nanieść do studzienek.
7) Do jednej studzienki nanieść 3 μl markera (100 bp).
8) Podłączyć elektrody aparatu do elektroforezy do zasilacza.
9) Elektroforezę prowadzić przez 1,5 godz. przy napięciu 80 V/120 mA
10) Po zakończeniu elektroforezy żel wybarwić w bromku etydyny (5μg/ml) przez około 5 min
11) Żel obejrzeć w świetle UV λ= 320 nm .