Monika Kuś środa, godz.8:30, 14.12.2011r.

Aneta Latacz prowadzący: dr Dariusz Latowski

Paulina Oklejewicz

SPRAWOZDANIE nr. 8

Elektroforeza. Rozdział elektroforetyczny białek.

Elektroforeza to jedna z najpowszechniejszych w biochemii metod rozdziału związków. Można wyróżnić wiele jej odmian i modyfikacji. W elektroforezie wykorzystuje się zjawisko zróżnicowanego ruchu jonów w polu elektromagnetycznym.

Podczas ćwiczeń przeprowadzono doświadczenie za pomocą tzw. elektroforezy natywnej.

Warunki jej prowadzenia są tak dobrane aby rozdzielane białka nie uległy denaturacji i zachowały swoją aktywność biologiczną. Umożliwia to identyfikację po rozdziale prążka białka enzymatycznego na podstawie reakcji enzymatycznej prowadzonej w żelu poliakrylamidowym.

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia było zaobserwowanie zróżnicowanej aktywności diaforetycznej białek zawartych w 3 różnych roślinach: pszenicy, bilbergii, kukurydzy i trzykrotki

Sposób wykonania

Złożony aparat do elektroforezy napełniono buforem rozdzielającym o pH= 8,8.

Następnie pobrano 4 różne próbki roślinne i każdą z nich umieszczono w moździerzu zawierającym bufor zagęszczający o pH=6,8. Składniki roztarto na jednolitą masę, umieszczono w probówkach Eppendorfa, odwirowano i przechowywano w lodówce.

Żel przygotowano poprzez zmieszanie ze sobą następujących substancji:

- 2,15 ml wody

- 3,35 ml akrylamidu (tworzy polimery)

-2,5 ml buforu (który pozwala na przepływ prądu)

- 100 µl nadsiarczanu i 10 µl TMD (katalizują polimeryzację)

Pipetą nanoszono próbki do studzienek (po 3 i 10 µl). Elektroforezę prowadzono do momentu, gdy błękit znalazł się 0,5 cm od dolnej krawędzi żelu.

Żel wyciągnięto i poddano barwieniu histochemicznemu na obecność diaforaz zależnych od NADPH. Barwienie wykonano w ciemności, by uwidocznić prążki.

Wyniki

Zdj. 1 – Otrzymany układ prążków.

Na wybarwionym żelu zaobserwowano różnice w aktywności białek na podstawie różnego położenia prążków zależności od gatunku z którego pochodził analizowany materiał roślinny.

Prążki są tutaj odpowiednikami izoenzymów.

• 1,2 - pszenica : 5 prążków = 5 izoenzymów

• 3,4 - bilbergia : 2 prążki = 2 izoenzymy

• 5,6 - kukurydza: 3 prążki = 3 izoenzymy

• 7,8 - trzykrotka : 2 prążki = 2 izoenzymy

Wnioski

Na tej postawie można było wnioskować o różnym składzie białkowym badanych próbek.

Dzięki swoim właściwościom metoda ma szerokie zastosowanie w systematyce, ponieważ pomaga w ustalaniu taksonomicznej przynależności gatunkowej roślin. Można zatem stwierdzić, że rośliny, które użyto w doświadczeniu nie są ze sobą spokrewnione, na co wskazuje inny układ prążków dla każdej z roślin. Układ tych prążków wskazuje również na inne izoenzymy występujące w tych roślinach.