1. Fotometria absorpcyjna

Wiele rozpuszczalnych związków chemicznych pochłania promieniowanie elektromagnetyczne zakresie długości fal 200-900 nm (UV, światło widzialne, podczerwień).

Pochłanianie osłabia intensywność promieniowania (ekstynkcja).

Zakres pochłaniania przez dany związek zmienia się wraz z długością fali.

Dla każdego związku istnieją charakterystyczne długości fal przy których występuje najsilniejsze pochłanianie (tzw. maksimum absorbcji).

Gdy pochłanianie światła przez dany związek zostanie zmierzone monochromatycznie w zakresie długości fal odpowiadającej maksimum absorpcji to wielkość ekstynkcji jest proporcjonalna do stężenia tego związku.

Fotometrię absorpcyjną wykorzystuje się w następujących rodzajach pomiarów:

a) Fotometria bezpośrednia – wykorzystuje własne maksimum absorpcji danego związku.

b)Oznaczenie stężenia danego związku po reakcji chemicznej – bada zmianę ekstynkcji osiąganą przez stechiometryczną reakcję chemiczną oznaczanej substancji z danym odczynnikiem. W toku reakcji powstają nowe związki pochłaniające światło o określonej długości fali (np.oznaczanie białka metodą biuretową, ozn. bilirubiny).

c)Reakcje katalizowane przez enzymy – powstanie nowego produktu lub zużycie substratu prowadzi do zmian ekstynkcji proporcjonalnych do zmian stężenia oznaczanej substancji.

Reakcje katalizowane przez enzymy:

Wykorzystywane są w następujących typach oznaczeń:

Oznaczanie substratów po reakcji chemicznej katalizowanej przez enzym (np. oznaczanie mleczanu).

Pomiar aktywności enzymu (np. oznaczanie aktywności LDH).

Reakcje złożone (np. oznaczanie aktywności CK, stężenia trójglicerydów).

2. Emisyjna fotometria płomieniowa.

W płomieniach emisyjnego fotometru płomieniowego jony są przekształcane między innymi w atomy metalu. Część z nich jest pobudzona termicznie. Przy powrocie pobudzonych atomów do stanu podstawowego pobrana energia zostaje oddana w postaci energii świetlnej (widmo liniowe).

Intensywność emitowanego światła jest proporcjonalna do stężenia jonów (np.Na+, K+) w badanej próbce.

3. Absorpcyjna spektrometria atomowa.

W spektrometrze absorpcji atomowej pierwiastek ulega dysocjacji na wolne atomy.

Atomy pochłaniają światło o charakterystycznej długości fali.

Absorpcja w określonym zakresie długości fali

jest proporcjonalna do stężenia oznaczanych pierwiastków.

Przykład: oznaczanie stężenia pierwiastków śladowych (manganu, miedzi selenu)

4. Chromatografia.

Jest to metoda rozdziału mieszanin substancji. Stosowana jest do:

•jakościowe badanie składu mieszanin;

•ilościowa ocena pojedynczych lub licznych składników mieszanin;

•uzyskiwanie pojedynczych składników mieszanin;

•badanie czystości substancji.

Chromatografia wymaga zastosowania dwóch faz:

FAZA STACJONARNA (substancje stałe lub płynne)

FAZA RUCHOMA (substancje płynne lub gazowe)

Rozdzielane składniki mieszaniny oddziaływują z tymi fazami.

Im silniejsze jest oddziaływanie z fazą stacjonarną i im słabsze z fazą ruchomą tym dłużej składnik jest zatrzymywany. Prowadzi to do rozdzielenia składników o różnym powinowactwie do fazy stacjonarnej.

Przykłady stosowanych technik chromatograficznych:

A.Chromatografia adsorpcyjna – oznaczanie np. białka, lipidy, węglowodany.

B.Chromatografia podziałowa – oznaczanie np. lipidy oraz węglowodany.

C.Chromatografia jonowymienna – oznaczanie np.. Aminokwasy, peptydy, białka, nukleotydy, oligonukleotydy, kwasy nukleinowe

D.Chromatografia żelowa – oczyszczanie, rozdział i identyfikacja białek, enzymów, hormonów, przeciwciał, polisacharydów, kwasów nukleinowych, wirusów.

E.Chromatografia powinowactwa – oczyszczanie, identyfikacja i oznaczanie ilościowe białek, enzymów, immunoglobulin, receptorów, kwasów nukleinowych, nukleotydów.

F.Sączenie molekularne – wykorzystywane do rozdzielenia polisacharydów, enzymów, białek oraz przeciwciał.

G.Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) – aminokwasy, peptydy, lipidy, cukry, steroidy, leki i ich metabolity, badania przesiewowe na obecność we krwi narkotyków.

H.Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) – białka peptydy, lipidy, kwasy tłuszczowe, hormony, witaminy, katecholaminy i inne.

I.Chromatografia gazowa (GLC) – np. kwasy tłuszczowe, leki i ich metabolity, kwasy organiczne, lipidy.

5. Elektroforeza.

Rozdział naładowanych elektrycznie składników w polu elektrycznym na podstawie różnic w ładunku i wielkości cząsteczki.

ZASTOSOWANIE:

między innymi identyfikacja i oznaczanie białek, lipoprotein, przeciwciał, izoenzymów, kwasów nukleinowych

Przykłady stosowanych rodzajów elektroforezy:

a.Elektroforeza na octanie celulozy – rozdział białek surowicy na frakcje

b.Elektroforeza na żelach – rozdział i identyfikacja białek, lipoprotein, kwasów nukleinowych

c.SDS elektroforeza na żelu poliakrylamidowym – rozdział, identyfikacja i oznaczanie ilościowe białek

d.Ogniskowanie izoelektryczne – rozdział, identyfikacja i oznaczanie ilościowe białek

6. Metody zmętnieniowe turbidymetria i nefelometria

Metody te służą do ilościowego pomiaru substancji nierozpuszczalnych wywołujących zmętnienie.

Zastosowanie:

diagnostyka laboratoryjna białek specyficznych np. białko C-reaktywne (CRP)

7. Fluorymetria

Technika wykorzystująca zjawisko emitowania energii świetlnej przez daną substancję po uprzednim naświetleniu jej falą o krótszej długości fali niż fala emitowana.

Zastosowanie:

np. pomiar stężenia końcowych produktów glikacji białek

8. Metody immunologiczne

Podstawą metod immunologicznych jest wykrywanie reakcji antygen-przeciwciało.

Wykrywane są zarówno przeciwciała jak i antygeny.

Pozwalają wykrywać śladowe ilości analitów.

Przykłady stosowanych metod immunologicznych: A. Stosowane do bezpośredniego wykrywania antygenów i przeciwciał:

-Aglutynacja – cząsteczkowe antygeny są aglutynowane przez przeciwciała; zastosowanie: oznaczanie grup krwi, serodiagnostyka zakażeń bakteryjnych.

-Immunoprecypitacja – rozpuszczalne antygeny są wytrącane przez przeciwciała w postaci osadu;

Przykłady metod immunoprecypitacyjnych:

•immunoelektroforeza – gammapatie monoklonalne

•Immunoturbidymetria – białka specyficzne surowicy

•Immunonefelometria – białka specyficzne surowicy

B. Stosowane do pośredniego wykrywania antygenów i przeciwciał:

-Substraty reakcji są osadzone na cząsteczkach nośnikowych:

np. aglutynacja lateksowa i hemaglutynacja

-Wykrywanie antygenów lub przeciwciał poprzez znakowanie:

a.Immunofluorescencja bezpośrednia i pośrednia

b.Immunologiczne metody ligandowe: radioimmunologiczne (RIA, IRMA) oraz immunoenzymatyczne (EIA, ELISA)

c.Metody immunochemiluminescencyjne

Metody immunoenzymatyczne i immunochemiczne w diagnostyce laboratoryjnej

Przeciwciała

-Są białkami wytwarzanymi in vivo przez organizm eksponowany na obce antygeny.

-Posiadają zdolność do rozpoznania i eliminowania antygenów przeciwko którym zostały wytworzone.

-Zdolność tę posiadają zarówno w warunkach in vivo jak i in vitro.

Przeciwciała jako odczynnik

Wykorzystanie in vitro zdolności do swoistego rozpoznawania antygenów i tworzenia z nimi kompleksów oraz niespecyficznego wiązania z innymi cząsteczkami.

Przeciwciała:

Poliklonalne:

Wytwarzane przez liczne klony komórek typu B przeciwko pełnemu zestawowi epitopów na antygenie bądź antygenach.

Monoklonalne:

Są homogeniczną populacją przeciwciał wytwarzaną przez jeden klon komórek B. Jeden klon przeciwciał monoklonalnych jest złożony z identycznych łańcuchów ciężkich i lekkich. Jest specyficzny względem tego samego epitopu i wiąże się do niego z takim samym powinowactwem.

Powinowactwo przeciwciał:

-Jest to siła wiązania pomiędzy antygenem a przeciwciałem.

-Zależy od siły wiązania antygenu z przeciwciałem oraz szybkości tworzenia wiązań.

Awidność przeciwciał:

-Oznacza całkowitą siłę wiązania wielowartościowego antygenu przez zespół różnych przeciwciał.

Swoistość (specyficzność) przeciwciał: Zdolność do selektywnego łączenia się przeciwciała z danym antygenem.

Swoistość przeciwciał monoklonalnych –

To zdolność rozpoznawania i wiązania się przeciwciała z pojedynczą determinantą antygenu

Swoistość przeciwciał poliklonalnych –

Jest zależna od swoistości zbioru przeciwciał wytworzonych przez klony komórek B pobudzone antygenem wielowartościowym.

Reaktywność krzyżowa

Reagować krzyżowo – to rozpoznawać ten sam lub zmodyfikowany pod względem strukturalnym epitop na różnych antygenach.

-Reaktywność krzyżowa związana jest z ograniczoną swoistością przeciwciał.

Testy immunoenzymatyczne fazy stałej

Faza stała testu to powierzchnia wiążąca, która umożliwia immobilizowanie antygenów lub przeciwciał, będących składnikami reakcji.

-Najczęściej stosuje się następujące materiały:

-Polistyren

-Nitroceluloza

-Nylon

-Difluorek poliwinylu

Co może być fazą stałą w metodach immunologicznych:

-Ścianki probówki reakcyjnej

-Studzienki mikropłyki

-Kulki szklane

-Kulki plastikowe

-Cząsteczki paramagnetyczne (kulki, opiłki żelaza)

-Matryca włókna szklanego

-Podłoża żelowe

-Bibuła

ELISA enzyme linked immunosorbent assay (immunoenzymatyczne testy fazy stałej.)

-Immunologiczna metoda oznaczania przeciwciał lub rozpuszczalnych antygenów w materiale biologicznym.

-Pozwalają na wykrywanie antygenu i pomiar jego stężenia w materiale badanym, w sytuacji gdy stężenie jego jest zbyt małe, aby wytworzyć precypitat w wyniku reakcji z przeciwciałem.

-Do oznaczania haptenów jednowartościowych, które w ogóle nie posiadają zdolności tworzenie precypitatów z przeciwciałami.

W teście wykorzystuje się przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne skoniugowane z odpowiednim enzymem.

-W celu uwidocznienia reakcji immunologicznej dodawany jest substrat, specyficzny dla użytego enzymu.

-Reakcja enzymatyczna prowadzi do zmiany barwy roztworu.

-Natężenie barwy mierzone jest kolorymetrycznie przy zastosowaniu odpowiedniej długości fali.

Opłaszczanie i blokowanie fazy stałej

-Każdy test immunoenzymatyczny wymaga opłaszczenia fazy stałej przeciwciałem lub antygenem.

-Jako fazy stałej używa się zwykle płytek polistyrenowych lub pleksiglasowych ze studzienkami (dołkami – 96 dołków/płytkę), do których można dodawać niewielkie ilości roztworów.

-Każda studzienka pełni funkcję mikroprobówki.

Opłaszczanie płytki ELISA przeprowadza się przez dodanie do studzienki przeciwciała lub antygenu przeznaczonego do umieszczenia na fazie stałej i inkubację przez określony czas w stałej temperaturze (zwykle 37°C i 4°C).

Blokowanie płytki ELISA po opłaszczeniu miejsca niezajęte przez przeciwciało lub antygen są blokowane za pomocą czynników blokujących.

-Blokowanie zapobiega nieselektywnemu przyłączaniu się białek do fazy stałej podczas następnych etapów testu.

Najczęściej stosowane czynniki blokujące:

• albumina surowicy bydlęcej

• kazeina

• żelatyna

Koniugaty i znaczniki w testach ELISA

-KONIUGAT – to przeciwciało lub antygen (również awidyna) trwale połączone (sprzężone) ze znacznikiem.

-ZNACZNIK – to substancja, której ilość lub aktywność możemy zmierzyć in vitro. Jej zadaniem jest uwidocznienie kompleksu antygen/przeciwciało.

znacznik	chromogen
Fosfataza zasadowa	P-nitrofenylofosforan sodu (pNPP)
Peroksydaza chrzanowa	o-fenylenodiamina (OFD) + H2O2

układ biotyna – streptawidyna (awidyna) BIOTYNA –niskocząsteczkowa witamina H, na drodze chemicznej łatwo można sprzęgać ją z cząsteczkami o różnej wielkości (białka, cukry, nukleotydy, kwasy nukleinowe).

STREPTAWIDYNA – białko wyizolowane ze Streptomyces avidinii o wysokim powinowactwie do biotyny i cząsteczek biotynylowanych. Streptawidyna łatwo poddaje się znakowaniu np. enzymem. Wykorzystywana jest także do opłaszczania ścianek dołków testowych, gdy istnieje potrzeba związania cząstek trudno poddających się adsorpcji.

Wiązanie biotyna - srteptawidyna

- Silne powinowactwo obu cząstek daje bardzo stabilne wiązanie w szerokim zakresie pH (2-11).

Formaty oznaczeń w testach ELISA

A.Test bezpośredni

B.Test pośredni z podwójnym przeciwciałem detekcyjnym

C.Test kanapkowy z przeciwciałem wychwytującym i detekcyjnym

D.Test pośredni kanapkowy z przeciwciałem wychwytującym i podwójnym przeciwciałem detekcyjnym

E.Test konkurencyjny

Test bezpośredni (direct ELISA)

-Antygen jest bezpośrednio immobilizowany na płytce i wykrywany za pomocą znakowanego przeciwciała swoistego.

- Jest mało czuły i mało swoisty.

Test pośredni z podwójnym przeciwciałem detekcyjnym

- Zwiększa czułość testu bezpośredniego.

- Przeciwciało pierwszorzędowe jest wysoko swoistym przeciwciałem dla badanego antygenu.

- Przeciwciało drugorzędowe jest przeciwciałem wykrywającym klasę immunoglobulin przeciwciała pierwszorzędowego. Jest to przeciwciało znakowane.

Test kanapkowy – podwójnego wiązania - z przeciwciałem wychwytującym i detekcyjnym

- Wykorzystuje dwa przeciwciała, które rozpoznają różne determinanty antygenu badanego.

- Duża czułość i swoistość testu.

- Ograniczenie reakcji krzyżowych – dzięki zastosowaniu dwóch przeciwciał tworzących kompleks z jednym antygenem.

Test pośredni kanapkowy z przeciwciałem wychwytującym i podwójnym przeciwciałem detekcyjnym

- Zastosowanie podwójnego przeciwciała detekcyjnego wzmacnia reakcję – poprawia swoistość testu.

Test ELISA konkurencyjny – współzawodnictwa

- W kompetycyjnych (rywalizacyjnych) testach ELISA wykorzystuje się mieszankę znakowanego antygenu lub przeciwciała, które są dodawane do badanego materiału.

- Antygen znakowany współzawodniczy z antygenem zawartym w próbie o miejsce wiązania na przeciwciele swoistym opłaszczonym na ściankach płytki

Oznaczanie antygenów lub przeciwciał kompetycyjnym testem ELISA

-Na płytkę opłaszczoną przeciwciałem nanosi się jednocześnie materiał badany i antygeny znakowane o znanym stężeniu. -Obydwa rodzaje antygenów konkurują o miejsce wiązania na przeciwciele. -Im większe jest stężenie antygenu w próbie, tym mniej znakowanego antygenu przyłączy się do przeciwciała w fazie stałej.	-Na płytkę opłaszczoną antygenem nanosi się jednocześnie materiał badany i przeciwciała znakowane o znanym mianie. -Obydwa rodzaje przeciwciał konkurują o wiązanie z antygenem. -Im większe jest stężenie przeciwciał w próbie, tym mniej przeciwciał znakowanych przyłączy się do antygenu w fazie stałej.

Zależność natężenia barwy od stężenia

Natężenie barwy jest wprost proporcjonalne do stężenia badanego antygenu/przeciwciała	Natężenie barwy jest odwrotnie proporcjonalne do stężenia badanego antygenu/przeciwciała

Zastosowanie testów ELISA w diagnostyce medycznej

Oznaczanie antygenów testem ELISA

-Najczęściej spotykany model z wykorzystaniem procedury testów kanapkowych z podwójnym przeciwciałem.

-Cząsteczka antygenu musi mieć co najmniej dwie różne determinanty antygenowe – co umożliwia wiązanie dwóch rodzajów przeciwciał.

Wykrywanie swoistych przeciwciał testem ELISA cel: m. in. diagnostyka chorób zakaźnych i autoimmunologicznych, alergologia

- Faza stała opłaszczona może być antygenem swoistym lub przeciwciałem przeciwko określonemu ludzkiemu przeciwciału.

Oznaczanie aktywności enzymów testem ELISA

- Enzymy katalizujące reakcje barwne nie wymagają stosowania znakowanych enzymem przeciwciał. - Enzym oznaczany w materiale badanym wiąże się z opłaszczonymi na ściankach przeciwciałami swoistymi dla tego enzymu.

- Dodanie specyficznego dla enzymu substratu prowadzi do reakcji barwnej.

- Natężenie barwy jest proporcjonalne do aktywności oznaczanego enzymu.

Metody radioimmunologiczne

Metody oparte na pomiarze radioaktywności substancji znakowanej izotopem promieniotwórczym wchodzącej w skład reakcji antygen-przeciwciało.

-Mierzy się intensywność promieniowania beta lub gamma po ilościowej reakcji immunologicznej.

Stosowane znaczniki:

Izotopy jodu (125I lub 131I) - Są emiterami promieni gamma - Stosowane zwykle do znakowania antygenów białkowych.	Izotop węgla (14C) Tryt (3H) - Są emiterami promieni beta - Stosowane zwykle do znakowania związków drobnocząsteczkowych.

Metody immunofluorescencyjne

Wykorzystują przeciwciała znakowane substancją o właściwościach fluorescencyjnych - fluoroforem.

- Znacznikami zwykle są:

• Fluoresceina

• Chelaty pierwiastków ziem rzadkich (lantanowców)

• Rodamina

• Umbeliferon

Metody immunochemiluminescencyjne

Chemiluminescencja – to emisja światła, które jest wytwarzane w czasie reakcji chemicznych

Pomiar stężenia badanego analitu dokonywany jest w oparciu o reakcję immunologiczną ze znakowanym przeciwciałem lub antygenem, które znakowane są chemiluminoforem.

- Emisja światła ze znacznika chemiluminescencyjnego jest wynikiem jego utleniania.

- Najczęściej używane znaczniki chemiluminescencyjne: izoluminol i estry akrydyny.

Reakcja typu MEIA

wykorzystuje opłaszczone (np. antygen, przeciwciało, cząsteczka wirusa) mikrocząsteczki lateksowe zawieszone w roztworze

- pomiar stężenia analitu oparty jest o odczyt fluorescencyjny

- metoda stosowana np. w aparatach IMx, Axym,

- do oznaczania stężenia hormonów (fT3, fT4, total T3, total T4, estradiol, FSH, TSH, prokalcytonina), markerów nowotworowych, markerów kardiologicznych, diagnostyki zakażeń wirusowych.

Przebieg reakcji MEIA

ETAP 1

• Do naczyńka reakcyjnego przenoszone są opłaszczone odpowiednią substancją mikrocząsteczki oraz materiał badany.

• Podczas inkubacji dochodzi do tworzenia kompleksów immunologicznych antygen-przeciwciało.

• Mieszanina jest przenoszona na celkę matrycową.

ETAP 2 Utworzone kompleksy wiążą się z matrycą z włókna szklanego Niezwiązane składniki reakcji są wypłukiwane z matrycy

ETAP 3

• Do naczyńka dodawany jest koniugat znakowany fosfatazą zasadową

• Koniugat wiąże się z antygenem badanym związanym w kompleksie immunologicznym.

• Matryca jest ponownie płukana celem usunięcia nadmiaru koniugatu

ETAP 4

• Do celki matrycy dodawany jest substrat dla fosfatazy zasadowej (fosforan 4-metylumbeliferylu {MUP}).

• MUP jest przekształcany do MU (4-metylumbeliferon)

• Detekcja fluorescencyjna, natężenie fluorescencji proporcjonalne do stężenia badanego analitu.

Reakcja typu CMIA

Dwustopniowa metoda immunochemiczna z użyciem mikrocząsteczek i znacznika chemiluminescencyjnego.

Wykorzystywana w analizatorze ARCHITECT.

Do oznaczania np.. fT3, fT4, TSH.

ETAP 1

A.Mieszanie: badana próbka, paramagnetyczne mikrocząsteczki opłaszczone swoistymi przeciwciałami (np. anty-T3, anty-T4, anty-TSH).

B.Wiązanie badanych antygenów ze swoistymi przeciwciałami na mikrocząsteczkach.

ETAP 2 wersja kanapkowa np. oznaczanie TSH Po przemyciu dodawany jest koniugat zawierający przeciwciało przeciwko badanemu antygenowi znakowane akrydyną.

ETAP 2 wersja kompetycyjna np. oznaczanie fT3 i fT4 Po przemyciu dodawany jest koniugat zawierający antygen znakowany akrydyną.

ETAP 3 Po usunięciu niezwiązanych składników reakcji do celki reakcyjnej dodawany jest roztwór przygotowawczy i roztwór wyzwalający reakcję.

Natężenie wywołanej reakcjami chemiluminescencji mierzone jest w relatywnych jednostkach świecenia (RLU).

w wersji kanapkowej istnieje proporcjonalna zależność pomiędzy ilością badanego antygenu a natężeniem świecenia.	w wersji kompetycyjnej istnieje odwrotna zależność pomiędzy ilością badanego antygenu a natężeniem świecenia.

Reakcja typu ECLIA

Reakcja elektrochemiluminescencyjna jest oparta o reakcje utleniania i redukcji na powierzchni elektrody.

- W technice ECLIA przeciwciało opłaszczające immobilizowane jest na kulce magnetycznej poprzez mostek biotyna-streptawidyna.

Kulka magnetyczna na której związany jest kompleks immunologiczny wiązana jest polem magnetycznym do powierzchni elektrody.

- Impuls elektryczny z elektrody wywołuje luminescencję znacznika.

- Intensywność świecenia jest proporcjonalna do stężenia badanego analitu.

Reakcja typu FPIA

Jest połączeniem techniki kompetycyjnej i fluorescencji spolaryzowanej.

- Do oznaczania stężenia hormonów (fT3, fT4, total T3, total T4, estradiol, FSH, TSH, prokalcytonina), markerów nowotworowych, markerów kardiologicznych, diagnostyki zakażeń wirusowych.

- W wiązaniu kompetycyjnym konkurują ze sobą antygen badany oraz antygen znakowany o znanym stężeniu.

- Jeżeli w próbie badanej jest wysokie stężenie antygenu badanego wiąże się on z przeciwciałem i antygen znakowany pozostaje niezwiązany

- Jeżeli w badanej próbie jest niskie stężenie antygenu badanego, więcej wolnego miejsca pozostaje na związanie antygenu znakowanego.

Do emisji spolaryzowanej fluorescencji ze znacznika może być użyte światło spolaryzowane, którego średnia wartość zależy od szybkości obrotu cząsteczki, co związane jest z jej wielkością.

- Małe niezwiązane cząsteczki obracają się szybciej niż większe kompleksy antygenu z przeciwciałem.

- Mierzone są zmiany w polaryzacji emitowanej fluorescencji w trakcie tworzenia kompleksów antygen-przeciwciało.

Zasada detekcji

- Wskaźnikiem stężenia badanej substancji są zmiany w polaryzacji emitowanej fluorescencji.

- Zmiana w polaryzacji emitowanej fluorescencji jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia badanej substancji.

Co to znaczy?

Jeżeli próbka zawiera wysokie stężenie badanej substancji, wówczas wiele wzorcowych kompleksów: badana substancja-znacznik pozostaje niezwiązanych.

- Wzbudzone przez pionowo spolaryzowane światło te małe cząsteczki fluorescencyjne (znacznik) szybko się poruszają, emitując światło w różnych płaszczyznach.

- Powoduje to zmniejszenie polaryzacji.

Jeżeli badana próbka zawiera niskie stężenie badanej substancji, wówczas wzorcowy kompleks: badana substancja-znacznik wiąże się z przeciwciałem swoistym.

- Powstają duże cząsteczki, które poruszają się wolno.

- Rotacja tych cząsteczek jest na tyle wolna, że umożliwia emitowanie światła w jednej płaszczyźnie.

- Rezultatem jest zwiększona polaryzacja.

Techniki stosowane w testach szybkich, przesiewowych, testach do samodiagnostyki i samokontroli

-Sucha chemia

-Immunochromatografia

Technologia suchej chemii

- Bazuje na suchych testach paskowych

- Suche pola testowe na pasku wysycone są odpowiednimi odczynnikami chemicznymi, które wchodzą w swoiste reakcje chemiczne z analitami zawartymi w badanym materiale biologicznym

- Otrzymujemy barwny wynik reakcji, natężenie barwy jest proporcjonalne do stężenia badanej substancji w próbce

Intensywność zabarwienia pól testowych odczytujemy:

-Według skali barwnej załączonej do opakowania – wzrokowo

-Przy zastosowaniu pomiaru fotometrycznego, techniką reflektometrii odbiciowej, przy pomocy reflektometru

Testy immunochromatograficzne:

Służą do stwierdzenia obecności lub braku określonego analitu, wchodzącego w reakcje immunologiczne, w materiale biologicznym

Jakościowe: odczytywane w oparciu o stwierdzenie obecności lub braku barwnych prążków w polu testowym	Ilościowe: odczytywane w oparciu o pomiar reflektometryczny intensywności zabarwienia prążka powstałego w polu testowym

Jak to działa?

- Immunochromatografia jest połączeniem techniki immunologicznej oraz rozdziału chromatograficznego.

- Oparte są o specyficzną detekcję antygenów lub przeciwciał przemieszczających się wzdłuż porowatego nośnika (np. bibuła) wraz z materiałem biologicznym.

W czasie wędrówki tworzą się kompleksy antygenu z próbki badanej ze znakowanym przeciwciałem, którym nasączone jest podłoże (nośnik, pasek testowy).

- Powstałe kompleksy zostają wychwycone przez swoiste przeciwciała wychwytujące opłaszczone na pasku testowym w polu odczytu wyniku testu.

- Nadmiar niezwiązanych przeciwciał znakowanych zostaje unieruchomiony i uwidoczniony w polu kontrolnym testu.

Testy immunochromatograficzne oparte są o reakcje typu:

- kanapkowego np.:

• Testy ciążowe

• Testy wykrywające krew utajoną w kale

•  testy stosowane w diagnostyce biegunek rota lub adenowirusowych

• Testy wykrywające przeciwciała przeciwko Helicobacter pylori

- kompetycyjnego np.:

• Testy wykrywające obecność w moczu leków, narkotyków lub ich metabolitów.

Jak interpretować wyniki?

Sposób interpretacji wyników dodatnich (obecność wykrywanego analitu) lub ujemnych (brak wykrywanego analitu) zależy od rodzaju zastosowanej techniki (kanapkowej lub kompetycyjnej).

Czemu służy obszar kontrolny okienka odczytu wyniku testu?

Pole kontrolne mówi nam o prawidłowości wykonania test lub jego sprawności

Pasek w polu kontrolnym musi być zawsze obecny.

Brak barwnego prążka w polu kontrolnym dyskwalifikuje test (jest o wadliwy lub został źle wykonany)

METODY Z ZASTOSOWANIEM BIOSENSORÓW

Czym są biosensory Bioczujniki (biosensory) to sensory chemiczne składające się z dwóch zasadniczych elementów:

- warstwy receptorowej w postaci materiału biologicznego

- przetwornika elektrycznego lub optycznego

• receptor służy do “rozpoznawania" oznaczanego związku,

• przetwornik do “przetłumaczenia" sygnału biologicznego na parametr mierzalny fizycznie oraz do obróbki tego parametru.

- W części receptorowej sensora informacja chemiczna jest przekształcana w formę energii, która może być mierzona przez przetwornik.

-Reakcja analitu z częścią biologiczną przetwornika generuje w nim sygnał, który może być łatwo zmierzony, wzmocniony i zanotowany.

Receptory to zwykle: - enzymy, najczęściej w postaci unieruchomionej, mikroorganizmy przeciwciała.	Przetworniki to zwykle: - potencjometryczne lub amperometryczne elektrody jonoselektywne, -tranzystory, -termistory, - piezokryształy, -systemy optyczne

Selektywność biosensora

• to zdolność do reagowania na jeden określony związek w obecności innych

• Selektywność biosensora zależy ściśle od użytego materiału biologicznego.

• Połączenie chemicznie selektywnej warstwy z fizyczną częścią sensora ma znaczący wpływ na selektywność całego sensora.

• Sygnał biosensora może być przetwarzany na wiele sposobów i przedstawiany w formie analogowej, odejmowany od sygnału odniesienia, przetwarzany na sygnał cyfrowy

Co możemy oznaczać w praktyce laboratoryjnej z zastosowaniem biosensora?

- glukoza, mleczany, etanol,

- Jak? amperometrycznie za pomocą biosensorów wykorzystujących tlenowe elektrody jako przetworniki i enzymy typu oksydaz (swoiste dla oznaczanego analitu) immobilizowane w membranie.

Metody immunodiagnostyczne oparte o zastosowanie biochipów

• Istotą technologii jest biochip.

• Biochip – matryca o powierzchni 9mmx9mm zawierająca tzw. dyskretne pola testowe

• Swoista modyfikacja powierzchni biochipa pozwala na wiązanie różnych analitów z jednej próbki badanej pacjenta.

• Jeden biochip jest przeznaczony do multianalizy próbki jednego pacjenta.

• Biochipy przeznaczone dla różnych pacjentów umieszczone są w ramie nośnikowej (9 biochipów w jednej ramce).

1. Przy zastosowaniu techniki kanapkowej natężenie świecenia jest wprost proporcjonalne do stężenia badanego analitu.

2. Przy zastosowaniu techniki kompetycyjnej (np. leki) natężenie świecenia jest odwrotnie proporcjonalne do stężenia analitu.