BIOLOGIA MOLEKULARNA

ĆWICZENIE VII

TRAWIENIE RESTRYKCYJNE DNA

ANALIZA JAKOŚCIOWA I ILOŚCIOWA 

KWASÓW NUKLEINOWYCH

Agnieszka Mierek-Adamska

Zakład Genetyki

 

 

ENZYMY RESTRYKCYJNE

 Enzymy izolowane z różnych szczepów bakterii mające zdolność do rozpoznawania

   specyficznej sekwencji DNA i przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA

 Nazewnictwo enzymów opiera się na literowych skrótach: pierwsza litera oznacza 

   rodzaj, a dwie następne gatunek bakterii z której pochodzi dany enzym; następna 
   litera oznacza szczep lub typ, a cyfra rzymska kolejne enzymy z danego szczepu
   lub typu

Np. 

E

co

R

I 

– 

pierwszy

 enzym z 

E

scherischa 

co

li szczep 

R

Y13

 Większość enzymów rozpoznaje cztero- lub sześcionukleotydowe palindromowe

    sekwencje (posiadające oś symetrii)

 Enzymy restrykcyjne mogą generować „tępe” lub „lepkie” końce

Np. HaeIII    5’ GGCC 3’                               5’ GG   CC 3’
                      3’ CCGG 5’                               3’ CC   GG 5’            „tępe” końce

       EcoRI     5’ GAATTC 3’                           5’ G   AATTC 3’
                     3’ CTTAAG 5’                           3’ CTTAA   G 5’       „lepkie” końce                 

 

 

ZASADY TRAWIENIA RESTRYKCYJNEGO

Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która trawi 

kompletnie 

1 μg DNA wzorcowego w czasie 1 godziny w warunkach optymalnych.

SKŁAD MIESZANINY DO TRAWIENIA RESTRYKCYNEGO

• DNA (genomowe, plazmidowe)

• odpowiedni bufor (1/10 objętości końcowej; wyjątek YellowTango 2x – 2/10)

• enzym restrykcyjny (objętość nie może przekraczać 1/10 objętości końcowej) 

• sterylna woda (do objętości końcowej)

!!!! Niektóre enzymy posiadają aktywność 

star

 !!!!

Większość enzymów działa w temperaturze 37°C

 

 

10X Buffer B (blue)

10 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 37°C),

                                           

10 mM MgCl2,

                                            

0.1 mg/ml BSA

10X Buffer G (green)

10 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 37°C), 
10 mM MgCl2, 
50 mM NaCl, 

10X Buffer O (orange)

50 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 37°C), 
10 mM MgCl2, 
100 mM NaCl, 

10X Buffer R (red)

10 mM Tris-HCl (pH 8.5 at 37°C), 
10 mM MgCl2, 
100 mM KCl, 

10X Buffer Tango™ (yellow)

33 mM Tris-acetate (pH 7.9 at 37°C), 
10 mM magnesium acetate, 
66 mM potassium acetate,
0.1  mg/ml BSA

 

 

ANALIZA JAKOŚCIOWA KWASÓW NUKLEINOWYCH

ELEKTROFOREZA

w żelach agarozowych

w żelach poliakryloamidowych

• polimer pochodnych galaktozy 

• pory 100-300 nm

• aparaty poziome

0,7 %

0,8-10 kb

0,9 %

0,5-7 kb

1,2 %

0,4-6 kb

2,0 %

0,1-2 kb

• polimer akryloamidu z 
  N,N-metylenobisakryloamidu

• rozdział cząsteczek różniących się 
  wielkością nawet o kilka nukleotydów

• aparaty pionowe

3,5 %

1000-

2000bp

5,0 %

80-500 

bp

12,0 %

400-200 

bp

20,0 %

6-100 bp

 

 

ANALIZA JAKOŚCIOWA KWASÓW NUKLEINOWYCH

ELEKTROFOREZA W ŻELACH AGAROZOWYCH

Bufory do elektroforezy

TAE

TBE

Tris buforowany kwasem octowym 

oraz EDTA

Tris buforowany kwasem borowym

oraz EDTA

TPE

Tris buforowany kwasem fosforowym

oraz EDTA

Wizualizacja DNA w żelu

 

 

DNA genomowe: A-nietrawione, B-trawione

RNA

DNA plazmidowe: 

A,C – nietrawione,

B, D - trawione

A   B   C    D

superzwinięta

forma OC

DNA plazmidowe

liniowa

 

 

ANALIZA ILOŚCIOWA KWASÓW NUKLIENOWYCH

POMIAR SPEKTROFOTOMETRYCZNY

Absorbancja – 0,200 – 1,000

Ratio (stosunek A

260nm

/A

280nm

)

Stężenie DNA (µg/µl)

Stężenie białek (mg/ml)

Czystość (%)

 

 

ZADANIA NA DZISIAJ

• 

strawić restrykcyjne DNA plazmidowe

• przygotować żel agarozowy

• przygotować próby do nałożenia na żel

• przygotować próby do pomiaru stężenia

• nałożyć próby na żel

• zmierzyć stężenia DNA wyizolowanych na poprzednich zajęciach