Wrocław, 27.11.2012
Agata Hnatczuk
Katarzyna Kazimierczak
Marta Matuszewska
Enzymy
Enzymy są białkami o właściwościach katalitycznych. Ich funkcja polega na zwiększaniu szybkości przebiegu reakcji mechanicznych. Mechanizm reakcji enzymatycznych polega na powstawaniu pośrednich kompleksów enzym – substrat, które rozpadają się na enzym i produkt. Szybkość reakcji enzymatycznej zależna jest od czynników takich jak: pH i potencjał oksydacyjno – redukujący środowiska, temperatura, stężenie enzymu, substratów, konfaktorów (koenzymów i aktywatorów), inhibitorów.
Enzymy charakteryzują się znaczną swoistością działania. Swoistość enzymów odnosi się do typu reakcji i budowy substratu. Specyficzność substratowa może być częściowa, dotycząca grupy związków o podobnej budowie, lub absolutna, gdy działanie enzymu ogranicza się do jednego określonego substratu
Liczne enzymy dla osiągnięcia pełnej aktywności, wymagają między innymi obecności niskocząsteczkowych związków, które współdziałają z enzymem. Związki te łączą się z białkiem enzymatycznym, tworząc kompleksy łatwo lub trudno dysocjujące. Część białkowa enzymu decyduje o funkcjach katalitycznych enzymu i o swoistości substratowej, natomiast część niskocząsteczkowa decyduje o typie reakcji katalizowanej. Właściwości chemiczne i fizyczne pokrywają się z właściwościami białek.
Stężenie enzymów w tkankach jest bardzo małe. Wykrywanie i oznaczanie enzymów nie polega na pomiarze ich stężenia, lecz na określaniu ich działania, czyli aktywności
Cel : wykrycie w tkance roślinnej niektórych enzymów.
6.3 Dehydrogenaza
Obserwacje: W probówce nr 1 znajduje się nieugotowany walec z bulwy ziemniaka, a w drugiej ugotowany. Po dodaniu 1% roztworu formaldehydu i 0,001% roztworu błękitu metylowego możemy zaobserwować następujące zmiany. W probówce nr 2 nie obserwujemy istotnych zmian w zabarwieniu substancji, natomiast w probówce nr 1 obserwujemy zmianę zabarwienia z ciemno niebieskiego na stalowy niebieski lekko rozwodniony.
Wnioski:
Dehydrogenaza uległa denaturacji podczas obróbki termicznej, dlatego kolor błękitu metylowego nie zmienił znacząco zabarwienia.
Dehydrogenaza przenosi protony i elektrony między substratami, w tym wypadku z formaldehydu na błękit metylowy
6.5 Katalaza
Obserwacje: W probówce nr 1 znajduje się nieugotowana bulwa ziemniaka w postaci 2cm walca. W probówce nr 2 znajduje się ugotowana bulwa ziemniaka w postaci 2 cm walca. Do probówek dodajemy H2O2 o stężeniu 0,01%. W probówce nr 2 nie obserwujemy istotnych zmian, zaś w probówce nr 1 obserwujemy wydzielanie się pęcherzyków gazu.
Wnioski:
Katalaza ulega destrukcji pod wpływem temperatury.
Katalaza rozkłada szkodliwy nadtlenek wodoru H2O2, na wodę i tlen, który ulatnia się w postaci pęcherzyków gazu.
6.6 Oksydaza polifenolowa
Obserwacje: Na bibule znajduje się 9 plastrów z bulwy ziemniaka, dwa z nich są ugotowane. Tak jak na poniższym schemacie:
Po około 30 minutach od momentu dodania odczynników obserwujemy zmianę zabarwienia plastrów surowych.
Wnioski:
Oksydaza polifenolowa jest enzymem, który uczestniczy w utlenianiu powietrzem substancji zawierających ugrupowania polifenolowe.
W pierwszej fazie utleniania powstają słabo zabarwione chinony, które z niezmienionym fenolem dają intensywnie barwne kompleksy z przeniesieniem ładunku
Ćwiczenie nr 8
Kinetyka reakcji enzymatycznych zajmuje się badaniem szybkości reakcji w zależności od stężenia substratu, stężenia enzymu, temperatury i pH. Szybkość reakcji mierzy się ilością substratu, który przereagował lub ilością produktu, który powstał w określonej jednostce czasu.
Cel: Znalezienie zależności między szybkością reakcji enzymatycznej w zależności od stężenia substratu.
8.1 Wyznaczanie stałej Michaelisa-Menten (Km)
| Nr probówki | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0,1mol*dm-3 bufor octanowy [cm3] | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 |
| 7,5mol*dm-3 roztwór 4-NPP[cm3] | 0 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 |
| Woda destylowana [cm3] | 2,5 | 2,3 | 2,1 | 1,9 | 1,7 | 1,5 |
Wnioski:
-1/Km= -29,2
Km=0,034
| Nr probówki | Stężenie substratu [mol*dm-3] | Stężenie uwolnionego 4-nitrofenolu [mol*dm-3] | Szybkość uwalniania 4-NP. |
|---|---|---|---|
| S | 1/S | Absorbancja A420 | |
| 1 | 0,3 *10-3 | 3333,3 | 0,3 |
| 2 | 0,6 *10-3 | 1666,7 | 0,32 |
| 3 | 0,9*10-3 | 1111,1 | 0,74 |
| 4 | 1,2 *10-3 | 833,4 | 1,4 |
| 5 | 1,5*10-3 | 666,67 | 1,8 |
8.2 Wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji.
| Nr probówki | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0,1mol*dm-3 bufor octanowy [cm3] | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 |
| Wyciąg enzymatyczny [cm3] | 0 | 0,5 | 1 | 1,5 | 2,0 | 2,5 |
| Woda destylowana [cm3] | 2,5 | 2,0 | 1,5 | 1,0 | 0,5 | 0,0 |
| Absorbacja420nm | 0 | 0,23 | 0,37 | 0,66 | 0,71 | 0,84 |
Wnioski:
Im większe jest stężenie enzymu tym szybkość reakcji jest większa. Maksymalna prędkość badanej reakcji enzymatycznej odczytuje się z wykresu 8.2 i wynosi ona:
1/Vmax=15,9
Vmax=0,062 [mol*dm-3*min-1]
8.3 Przygotowanie krzywej wzorcowej dla 4-nitrofenolu
| Nr probówki | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0,2*10-3 mol*dm-3 roztwór 4NP [cm3] | 0 | 0,5 | 1 | 1,5 | 2,0 | 2,5 |
| Woda destylowana [cm3] | 2,5 | 2,0 | 1,5 | 1,0 | 0,5 | 0,0 |
| Nr probówki | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
|---|---|---|---|---|---|
| Stężenie 4-NP [mol*dm3] | 0,04*10-3 | 0,08*10-3 | 0,12*10-3 | 0,16*10-3 | 0,2*10-3 |
| Absorbancja [420nm] | 0,36 | 0,73 | 0,96 | 1,3 | 1,5 |