BIOTECHNOLOGIA ROŚLIN

1. Organizacja genomu eukariotów i metody jego analizy

GENOM - kompletny zestaw informacji genetycznej danego organizmu

GENOM – całkowity DNA, który wchodzi w skład organizmu. Zawiera wszystkie geny kodujące RNA i białka wymagane do wygenerowania funkcjonalnego organizmu, a także DNA niekodujący. Może stanowić pojedynczy chromosom lub może być rozdzielony na wiele chromosomów. U eukariontów może być dodatkowo podzielony na genomy: jądrowy, mitochondrialny i chloroplastowy – Biologia molekularna. Krótkie wykłady.

Eukariotyczne genomy jądrowe – zbiór liniowych cząsteczek DNA znajdujących się w chromosomach; liczba chromosomów nie ma związku z właściwościami biologicznymi organizmu ( jego złożonością) ani z wielkością genomu.

Wielkość genomów eukariotycznych od 10 Mb do 100 000 Mb np. Arabidopsis thaliana 125Mb

Organizacja genomu:

Podwójna helisa + Oktamer histonowy → Nukleosom + Histon łącznikowy (np. H1) → Chromatosom + Łącznikowy DNA → Nukleofilament (sznur koralików, włókno 11 nm) → Solenoid (włókno 30 nm) →Pętla chromosomowa (pętla Laemmliego) → Chromatyna interfazowa → Chromosom metafazowy

1. Nukleosom – to nawinięta helisa DNA na rdzeń zbudowany z oktameru (8) histonów (2x H2A + 2x H2B + 2X H3 + 2x H4). Histony rozmieszczone są regularnie co ok. 200 par zasad.

• Z cząsteczką nukleosomu wiąże się 140-150 par zasad ( zależnie od gatunku ), a oddzielone są one od siebie 50-70 parami zasad DNA łącznikowego

• Histony zawierają dużo naładowanych dodatnio aminokwasów (np. lizyna) które łączą się z ujemnie naładowanym DNA.

• Histony są stosunkowo małymi białkami zasadowymi (bogatymi w lizynę i argininę), są najbardziej konserwatywnymi spośród znanych białek – pomiędzy histonami różnych organizmów istnieje bardzo mało różnic w budowie.

1. Chromatosom– utworzony w wyniku przyłączenia do nukleosomu dodatkowych histonów H1 tzw. łącznikowych (stanowią największe i najbardziej zasadowe spośród tej rodziny białek). Zapobiegają one oddzielaniu się zwoju DNA od nukleosomu.

2. Nukleofilament – chromatosomy połączone łącznikowym DNA

3. Solenoid – [ włókna 30nm] – składa się ze zwiniętego w lewoskrętną helisę nukleofilamentu. Na każdy skręt solenoidu przypada 6 chromatosomów.

4. Pętla chromosomowa – utworzona ze zwiniętego solenoidu wraz z macierzą jądrową.

- macierz jądrowa – matriks jądrowa, szkielet jądrowy – sieć włókien białkowych tworzących wewnętrzny szkielet jądra komórkowego odpowiedzialny za utrzymanie struktury przestrzennej chromatyny

1. Chromatyna – w rzeczywistości występuje w formie bardziej upakowanej – jest to prawdopodobnie główny typ chromatyny w czasie interfazy:

- euchromatyna – typ luźny

- heterochromatyna – bardziej skondensowana

1. Chromosom metafazowy – powstają na skutek silnej kondensacji chromatyny podczas podziałów – formują się one po zajściu replikacji DNA – każdy ma 2 kopie DNA. Chromatydy siostrzane są utrzymywane razem na obszarze centromeru ( wyznacza on długość ramion i ich położenie względem zlokalizowanych na końcach ramion telomerów. W centromerze zlokalizowany jest kinetochor czyli miejsce przytwierdzania mikrotubul, które ciągną podzielone chromosomy do jąder potomnych.

- telomery - Końce chromosomów tworzą telomery. Telomer zawiera setki kopii powtórzonej (5’-TTAGGG-3’ – człowiek) syntetyzowanej przez telomerazę w sposób niezależny od zwykłej replikacji DNA – co przeciwdziała stopniowemu skracaniu telomerów w trakcie replikacji liniowej cząsteczki DNA. Telomerowy DNA tworzy strukturę drugorzędową, która zabezpiecza końce chromosomów przed degradacją.

- telomery umożliwiają komórce odróżnieneie prawdziwych koców chromosomów od tych które powstają w wyniku pękania chromosomów

- dwa specjalne białka wiążą się z telomerami : TRF1 – które pomaga rehulować ich długość i TRF2- które utrzymuje wystające odcinki jednoniciowe- zapobiega to powstawaniu wiązań kowalencyjnych między polinukleotydami

Analiza genomu:

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych – zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasów nukleinowych (DNA z DNA, RNA z RNA lub DNA z RNA). Komplementarne nici kwasów nukleinowych ulegają rozdzieleniu (tzw. denaturacji) pod wpływem wysokiej temperatury lub substancji chemicznych, takich jak formamid lub mocznik. Po usunięciu wpływu czynnika denaturującego, nici łączą się ponownie. Szybkość hybrydyzacji zależy między innymi od długości fragmentów kwasów nukleinowych, podobieństwa i różnorodności sekwencji w próbce poddanej hybrydyzacji.

Zjawisko hybrydyzacji znalazło szereg użytecznych zastosowań w technikach biologii molekularnej. W szczególności, hybrydyzacji z użyciem znakowanego izotopowo lub chemicznie fragmentu kwasu nukleinowego (tzw. sondy molekularnej) używa się do detekcji homologicznych fragmentów podczas:

• poszukiwania nowych genów poprzez proces (klonowania genów), w przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.

• do oszacowania poziomu ekspresji genów poprzez specyficzną detekcję cząsteczek mRNA w technice northern.

• do globalnej analizy różnic w ekspresji genów pomiędzy dwiema próbkami z wykorzystaniem macierzy genowych.

• do wizualizacji regionów ekspresji genu w organizmie w technice hybrydyzacji in situ.

• do detekcji specyficznych fragmentów DNA w technice Southerna, np. w celu ustalenia ilości kopii danego genu w genomie, ustalenia wzoru polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP). Techniki RFLP używa się m.in. celu ustalenia ojcostwa.

PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy

Metoda powielania łańcuchów DNA polegająca wielokrotnym podgrzewaniu i oziębianiu próbki.

Znajduje ona wiele zastosowań, między innymi w badaniach nad genomem, charakteryzowaniu ekspresji genów, klonowaniugenów, diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, kryminalistyce, paleontologii.

Skład mieszaniny reakcyjnej :

• matrycowy DNA, którego fragment ma być powielony

• mieszankę nukleotydów dNTP (czyli trifosforanów deoksyrybonukleozydów)

• startery (primery), czyli krótkie (zwykle około 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do fragmentów matrycy znajdujących się na obu końcach interesującego nas genu. Wyróżniamy dwa typy starterów: starter przedni (forward)^[1] – jego sekwencja musi być taka sama jak sekwencja powielana; starter wsteczny (reverse)^[1] – jego sekwencja musi być komplementarna do powielanej.

• termostabilną polimerazę DNA. Używanym do reakcji enzymem może być na przykład polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus

• bufor z MgCl₂ - jony magnezu są kofaktorami polimerazy i warunkują jej aktywność

Jeden cykl PCR składa się z następujących etapów:

• Denaturacja matrycowego DNA – rozplecenie podwójnej helisy. Wysoka temperatura (zwykle około 95^oC) powoduje pękanie wiązań wodorowych w wyniku czego otrzymujemy pojedyncze łańcuchy ssDNA

• Annealing (hybrydyzacja primerów) – w temperaturze około 45 - 60^oC dochodzi do łączenia starterów z sekwencjami homologicznymi w matrycowym DNA

• Elongacja – w temperaturze 72^oC polimeraza syntetyzuje nić komplementarną do matrycy, zaczynając od końca 3’.

Po zakończeniu etapu wydłużania primerów dochodzi do ponownej denaturacji przez ogrzanie mieszaniny reakcyjnej powyżej 90^oC i cykl rozpoczyna się od początku. Liczba cykli zależy od zakładanej ilości materiału genetycznego jaką chcemy uzyskać

Elektroforeza

•jest podstawową techniką wizualizacji kwasów nukleinowych, pozwala bezpośrednio identyfikować cząsteczki DNA i jest stosunkowo czuła

•jest techniką rozdzielania fragmentów DNA według ich wielkości

•pozwala na określenie wielkości cząsteczek przez porównanie drogi migracji z fragmentami o znanej wielkości (tzw. markerów)

•jest techniką oczyszczania DNA

Podział:

•Agarozowa (horyzontalna) - elektroforezę w żelu agarozowym stosuje się do rozdzielania dużych cząsteczek DNA

-w stałym polu elektrycznym

-w zmiennym polu (PFGE)

•Akrylamidowa (wertykalna) - elektroforezę w żelu poliakrylamidowym stosuje się do rozdzielania małych fragmentów DNA

-denaturująca

-niedenaturująca

Techniki elektroforetyczne wykorzystywane są do rozdziału cząsteczek na podstawie szybkości poruszania się w polu elektrycznym. Szybkość ta powiązana jest z ich ładunkiem i masą. Kwasy nukleinowe w buforach o pH bliskim neutralnego obdarzone są ładunkiem ujemnym i poruszają się w stronę dodatniej anody. Rozdział następuje więc na podstawie masy odpowiednich fragmentów co pozwala na ustalenie ich wielkości, ustalenie degradacji preparatu oraz określenie ewentualnych zanieczyszczeń (białko, RNA). Do rozdziału kwasów nukleinowych wykorzystuje się dwa typy żelów: agarozowy i poliakrylamidowy. Elektroforeza poliakrylamidowa (PAGE) umożliwia rozdział mniejszych cząstek od 5 – 1000 pz, natomiast przy użyciu elektroforezy na żelu agarozowym możliwy jest rozdział fragmentów nawet do 20 kpz.

Przykładowe substancje wybarwiające DNA:

• bromek etydyny

• coomassie blue

Sekwencjonowanie DNA

Technika odczytywania sekwencji, czyli kolejności par nukleotydowych w cząsteczce DNA.

W wyniku sekwencjonowanie otrzymujemy sekwencje nukleotydowe które porównujemy z tymi które są umieszczone w bazach danych.

Mikromacierze (Chipy DNA, DNA miccroarray ) to sondy DNA upakowane na podłożu stałym - szklane, plastikowe lub krzemowe płytki, membrany nylonowe i nitrocelulozowe. Zawierają różniące się od siebie sekwencją tysiące fragmentów DNA, które pełnią rolę sond i w wyniku reakcji hybrydyzacji wykrywają komplementarne do siebie odcinki DNA lub RNA. Mają one wiele zastosowań, z których najczęstsze to określanie ekspresji tysięcy genów w jednym eksperymencie. W zależności od długości możemy podzielić je na cDNA oraz oligonukleotydowe.

2. Zmienność genetyczna i techniki jej indukowania

Zmienność genetyczna – naturalne różnice sekwencji DNA (genotypu) organizmów jednego gatunku. Różnice te mogą powodować zmiany w budowie białek lub czasie i miejscu ich wytwarzania, w efekcie prowadząc do różnic w fenotypie, np. inne ubarwienie sierści, różna odporność na zmiany temperatury, zdolność (lub jej brak) do trawienia laktozy. Wiele cech, które są zróżnicowane genetycznie prawdopodobnie nie ma wpływu na przeżycie organizmów (np. kolor oczu u ludzi), ale zmienność genetyczna cech, które mogą wpłynąć na przystosowanie organizmów, to „paliwo” ewolucji. Organizmy mogą się też różnić nie kodującymi sekwencjami DNA. Takie różnice nie mają znanego nam wpływu na fenotyp, ale są użyteczne w analizie zmienności genetycznej przez biologów.

Zróżnicowanie genetyczne jest ważne dla odporności danego gatunku na pasożyty - jeśli dany gatunek jest w niedużym stopniu zmienny, to pasożyt (np. wirus, bakteria) musi przystosować się do niewielu genotypów gospodarzy i może łatwo odnieść sukces. Z tego powodu monokultury uprawne łatwiej ulegają atakowi pasożytów, a przy ochronie gatunków zagrożonych wyginięciem trzeba zachować pewną minimalną pulę genową zapewniającą zmienność genetyczną.

Stopień zmienności genetycznej różnych gatunków pozwala wysnuć wnioski co do ich przeszłości - wiadomo np., że gepardy przeżyły bardzo silne zredukowanie liczebności i odrodziły się z niewielkiej grupy osobników, gdyż są w niewielkim stopniu zmienne. Ludzie również są stosunkowo mało zróżnicowanym genetycznie gatunkiem. Badaniem zmienności genetycznej zajmuje się genetyka populacyjna.

Źródłem zmienności genetycznej są mutacje, powodujące pojawianie się nowych wariantów sekwencji DNA. Dzięki zaś rekombinacji DNA powstają nowe zestawienia różnic genetycznych - Polska i angielska Wiki

Przyczyny:

Rekombinacja homologiczna Mutacje genetyczne Transformacja genetyczna	Migracja organizmu Poliploidalność

Ad. 1. Rekombinacja homologiczna – W czasie mejozy (pachyten) dochodzi do zjawiska crossing-over – homologiczne chromosomy (jeden od ojca, drugi od matki) tworzą chiazmy między chromatydami, po czym są one rozrywane, w taki sposób, że następuje wymiana odcinków chromatyd. Skutkuje to rozszczepieniem genów sprzężonych i powstania nowych sprzężeń. Częstość tego procesu zależy od odległości między genami.

Ad. 2. Mutacje genetyczne (Nagłe, skokowe, losowe zmiany w materiale genetycznym. Mogą być dziedziczone.)

Powstawanie mutacji:

• spontanicznie: błedy polimerazy DNA

• indukowane: na skutek działania czynników mutagennych/mutagenów (promieniownie jonizujące X lub gamma, promieniowanie niejonizujące UV, substancje chemiczne – kwas azotowy, związki aromatyczne, amin)

Rodzaje mutacji:

a) Genowe:

• substytucja (zastępowanie jednej zasady azotowej inną)

  • tranzycja: A → G (puryna → puryna); C → T (pirymidyna → pirymidyna)

  • transwersja: A/G → T/C (puryna → pirymidyna)

• delecja (wypadnięcie jednej lub kilku par nukleotydów)

• insercja (wstawienie jednej lub kilku dodatkowych par nukleotydów)

b) Chromosomowe:

• deficjencja (utrata fragmentu chromosomu)

• duplikacja (podwojenie fragmentu chromosomu)

• inwersja (obrócenie fragmentu chromosomu o 180*)

• translokacja (frag chromosomu zostaje przeniesiony na inny, nie homologiczny)

c) Zmiany liczbowe:

• aneuploidie (są jednym z kilku zaburzeń ilości materiału genetycznego i oznacza, że jego ilość w komórkach nie jest wielokrotnością zawartości DNA w jednym garniturze chromosomów typowym dla danego osobnika lub gatunku (euploidia), ale ma wartość pośrednią.)

  • nullisomia (2n-2) – brak jednej pary chromosomów,

  • monosomia (2n-1) – jedna kopia danego chromosomu,

  • disomia (2n) – dwie kopie danego chromosomu

  • trisomia (2n+1) – trzy kopie jednego chromosomu.

• Poliploidie ( obecność więcej niż 2 kompletnych haploidalnych zestawów chromosomów)

  • triploidia – 3n chromosomów,

  • tetraploidia – 4n chromosomów; itd

Ad.3. Transformacja genetyczna – Wprowadzanie do organizmu materiału genetycznego – transgenu. Transgen modyfikuje funkcjonowanie danego organizmu, zwykle nadaje mu nowe korzystniejsze cechy, np. odporność na szkodniki, itp.

Metody transformacji:

+ bezwektorowe

Mikrowstrzeliwanie chemicznie elektroporacja makroiniekcja mikroiniekcja liposomy elektroforeza wytrząsanie z węglikiem krzemu

+ wektorowe

Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium rhizogenes

Wirusy

Ad.4. Migracje – Organizmy przemieszczając się w środowisku i krzyżując z gatunkami autochtonicznymi zwiększają zmienność genetyczną potomstwa.

Ad.5. Poliploidalność – Im organizm bardziej poliploidalny, tym większa szansa na zajście crossing-over, a więc większa zmienność u potomstwa tego organizmu.

3. Mechanizm interferencji RNA i jego znaczenie w regulacji ekspresji genów

Interferencja RNA (RNAi) – Mechanizm wyciszania, wyłączania ekspresji genu przy wykorzystaniu dwuniciowego RNA o budowie i sekwencji zbliżonej do sekwencji DNA wyciszanego genu. Jest procesem, w którym dochodzi do degradacji w komórce wybranych cząsteczek RNA.

Mechanizm interferencji RNA:

Etap 1 – inicjacyjny przebiega w cytoplazmie.

Cząsteczka dsRNA zostaje pocięta przez enzym o nazwie Dicer na fragmenty o długości 21-23 nukleotydów, nazywane małymi interferującymi RNA (siRNA).

Etap 2 – efektorowy zachodzi w jądrze lub cytoplazmie.

siRNA przyłącza się do kompleksu białek RISC (RNA-Induced Silencing Complex) i ulega rozpleceniu do jednoniciowych siRNA. Jedna nić jest eliminowana, druga pozostaje w kompleksie RISC i służy jako sonda rozpoznająca komplementarne cząsteczki RNA. Jeśli taki aktywny kompleks RISC (złożony z jednoniciowego siRNA i białek) pozostaje w cytoplazmie, to wiąże się na zasadzie regionów komplementarnych z mRNA. Jeżeli ta komplemetarność jest pełna, to dochodzi do cięcia tego kompleksu w połowie utworzonego dupleksu mRNA/ siRNA przez białko Argonauta wchodzące w skład kompleksu RISC. W efekcie cała pula mRNA zostaje wyeliminowana. Jako, że taki stan uniemożliwia dalszy przepływ informacji genetyczniej z mRNA do białka, proces ten nazwano potranskrypcyjnym wyciszaniem genów (PTGS – Post Transcripctional Gene Silencing).

Jeżeli jednak mRNA jest tylko częściowo komplementarne do nici siRNA związanej z kompleksem RISC, wtedy nie ulega ono zniszczeniu, ale pozostaje związane z tym kompleksem, co stanowi blokadę dla mRNA, które nie może służyć jako matryca do syntezy białek. W takiej sytuacji dochodzi do wyciszania genów na poziomie translacji. Dodatkowo kompleks RISC może przedostać się do jądra komórkowego i oddziaływać z komplementarnymi do nici siRNA fragmentami genomu, w wyniku czego dochodzi do RNA zależnej metylacji DNA. Efektem tego jest przekształcanie euchromatyny w heterochromatynę i zablokowanie aktywności genu – transkrypcyjne wyciszanie genów (TGS – Transcripctional Gene Silencing).

Znaczenie i praktyczne wykorzystanie interferencji RNA:

• RNAi ma udział w patofizjologii zakażeń wirusowych wywoływanych przez wirusy z rodziny Retroviridae, np. HIV. Dowiedziono, że miRNA hamuje replikację wirusa HIV w obwodowych jednojądrzastych komórkach krwi ludzkiej pochodzącej od zainfekowanych dawców oraz w zakażonych liniach komórkowych. Jednakże wirus HIV ma zdolność hamowania ekspresji pewnej cząsteczki miRNA, co jest potrzebne do jego efektywnej replikacji.

• Zjawisko RNAi pozwala bronić się przed infekcjami wirusowymi u ludzi, zwierząt i roślin. Za silnych induktorów tego zjawiska uważa się wirusy RNA (np. HPV typu C i B), retrowirusy, i wirusy DNA (wirus cytomegalii). Dowiedziono jednak, że wirusy mogą zapanować nad procesami komórkowymi produkując własne miRNA. Z drugiej strony w genomie gospodarza może być kodowane miRNA odpowiedzialne za hamowanie replikacji wirusa.

• Wykorzystanie miRNA w terapii chorób wirusowych: dsRNA wprowadzone we wczesnym etapie infekcji mogłoby skutecznie redukować ilość cząsteczek wirusa w zainfekowanym organizmie do momentu, w którym odpowiedź immunologiczna gospodarza mogłaby skutecznie niszczyć wirusa i zapobiegać rozwojowi choroby. Przykład – miRNA są w stanie obniżać skutecznie poziom wirusa grypy w płucach zakażonych myszy i są zdolne do ochrony myszy przed wysoce patogennym wirusem ptasiej grypy.

• W przyszłości RNAi może stać się obiecującym narzędziem do kontroli wielu infekcji wirusowych u zwierząt domowych i hodowlanych.

• Wykorzystanie siRNA do wyciszania ekspresji genów nowotworowych oraz miRNA w terapii chorób nowotworowych: inhibicja miRNA prowadzi in vitro do obniżenia proliferacji komórek nowotworowych w przypadku raka prostaty oraz raka szyjki macicy.

• Na podstawie poziomu ekspresji miRNA można diagnozować liczne choroby nowotworowe, np.. nowotwory płuc – wzrost ekspresji miRNA-155 i miRNA-17-92, rak piersi spadek ekspresji miRNA125-1, miRNA125-2, miRNA-145 i wzrost miRNA-21.

• Dzięki odkryciu zjawiska RNAi udało się wyciszyć u myszy gen odpowiedzialny za podwyższony poziom cholesterolu, a być może w przyszłości uda się je wprowadzić u ludzi, zapobiegając w ten sposób chorobom serca.

• Ksenotransplantologia – w celu eliminowania świńskich endogennych patogenów wirusowych, co zapobiegłoby przenoszeniu się ich do organizmu biorcy.

• Trwają badania nad wykorzystaniem siRNA do produkcji farmaceutyków do leczenia np. grypy, astmy, przewlekłych infekcji płuc, choroby Parkinsona, Huntingtona, mukowiscydozy i chorób skóry.

• Ochrona genomu przed transpozonami

• Udział w rozwoju, proliferacji, różnicowaniu komórek, apoptozie, embriogenezie i organogenezie.

miRNA rośliny - Regulacja degradacji mRNA:

RISC może wywoływać cięcie gotowej cząsteczki mRNA – Roślinne miRNA posiada jedynie możliwość niezachowania komplementarności w stosunku do celowego mRNA na od 0 do 5 zasadach, stąd największa znana liczba genów wyciszanych wg. tego mechanizmu przez jedną cząsteczkę miRNA wynosi 10 - Z wykładów Rapacza

miRNA zwierzęta - translacyjne wyciszanie genów - represja translacji przez kompleks zwany miRNP (micro RNA-NucleoProtein):

zwierzęce miRNA typowo powoduje zatrzymanie translacii mRNA w stosunku, do którego jest jedynie częściowo komplementarne, ponieważ wystarcza komplementarność jedynie zasad 2 – 8 miRNA. Stąd jedna cząsteczka wyciszać może dziesiątki, czy nawet setki genów - Z wykładów Rapacza

siRNA - Transkrypcyjne wyciszanie genów (Transcriptional Gene Silencing).

Kiedy krótki odcinek RNA przyłączy się wraz z RISC do nici DNA, następuje w tym miejscu przyłączenie i uaktywnienie metylotransferazy, która metyluje lizynę 9 białka histonowego H3, co "zwabia" białko remodelujące chromatynę, które przekształca dany odcinek genomu w heterochromatynę (nie podlegającą transkrypcji, bo niedostępną dla białek) – Z wykładów Rapacza

4. Organizmy modelowe w badaniach genetycznych i biotechnologicznych- najważniejsze odkrycia naukowe z ich udziałem w ciągu ostatniego 10-lecia

Organizmy modelowe są to organizmy inne niż ludzkie, posiadające jedną lub więcej cech, które umożliwiają wykorzystanie ich w badaniach laboratoryjnych ze względu na:

- szybki rozwój

- mały rozmiar osobników dorosłych

- dostępność

- ustępliwość

w nadziei możliwości odniesienia uzyskanych danych także do innych organizmów.

Cechy:

- małe rozmiary i proste odżywianie – hodowla nie wymaga dużo miejsca, jest łatwa i tania w utrzymaniu

- duża liczba potomstwa – pozwala na wiarygodną analizę statystyczną wzorów dziedziczenia

- krótki cykl życiowy – umożliwia obserwacje wzorców dziedziczenia w kolejnych pokoleniach

- mały genom, duże chromosomy – mała ilość DNA do analizy; łatwiej badać chromosomy w mikroskopie świetlnym

- złożony rozwój – pozwala na analizę złożonych procesów rozwojowych

- dostępność informacji i technik badawczych – znajomość sekwencji genomu; dostępność wielu mutantów do analiz

wirusy	jednokomórkowe organizmy modelowe	zwierzęta modelowe	rośliny modelowe
bakteriofag lambda, bakteriofag ΦX174, wirus mozaiki tytoniu	bakterie: Escherichia coli, Bacillus subtilis	- Muszka owocowa Drosophila melanogaster, - Nicień Caenorhabditis elegant, - Jeżowce, - Kura domowa, - Szympans, - Mysz, - Platana szponiasta Xenopus laevis, - Danio pręgowane Danio rerio - Homo sapiens,	- Rzodkiewnik pospolity Arabidopsis thaliana, - Tytoń szlachetny Nicotiana tabacum, - Groch zwyczajny Pisum sativum - Ryż siewny Oryza sativa - Wyżlin większy Antirrhinum majus;
	archeony: Sulfolobus
	drożdże: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe

Najważniejsze organizmy modelowe ostatnich 10 lat:

1. Orzęsek (Tetrahymena thermophila):

• 2009r. – Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny – Elisabeth Blackburn, Carol Greider, Jack Szostak – okrycie telomerazy

1. Nicień (Caenorhabditis elegans):

• 2006r. – Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny – Creig Mello, Andrew Fire – mechanizm interferencji RNA

• Badania nad tym organizmem umożliwiły zrozumienie procesu programowanej śmieci komórki czyli apoptozy

• W 2002 roku za odkrycia dotyczące "udziału genów w regulacji rozwoju narządów i programowanej śmierci komórek, czyli apoptozy" w których organizmem modelowym był właśnie C.elegans przyznana została Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny i fizjologii. Wyróżnieni naukowcy zidentyfikowali najważniejsze geny regulujące procesy rozwoju narządów i programowanej śmierci komórki i wykazali, że odpowiedniki tych genów istnieją w bardziej złożonych organizmach, w tym również u człowieka. Ich odkrycia mają duże znaczenie dla badań medycznych, przyczyniając się do wyjaśnienia podłoża wielu chorób.

1. Mysz (Mus musculus):

• Najważniejszy modelowy ssak

• Przydatna w badaniach chorób szczególnie o podłożu genetycznym (AIDS – zhumanizowanie myszy z ludzkim genem CD4 lub Hu – SCDI -> brak własnego funkcjonującego systemu immunologicznego – wyposażone w ludzkie komórki podatne na zakażenia AIDS)

• Opanowano rutynowe metody uzyskiwania i hodowli in vitro mysich zarodkowych komórek macierzystych

• Uzyskuje się też myszy ze zmianami genetycznymi (knock out, knock in, mutacje)

• 2007r. – Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny – Olivier Smithies, Martine Evans, Mario Capecchi – odkrycie zasad użycia zarodkowych komórek macierzystych do modyfikacji genetycznych myszy

• 2011r. – Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny – Bruce Beutler, Jules Hoffmann – aktywacja odporności wrodzonej

1. Szczur (Rattus norvegicus):

• Model w badaniach toksykologicznych, chorób i fizjologii w tym związanych z funkcjami serca i naczyń, drogami oddechowymi, metabolizmem, neurologiczną kontrolą, wiekiem i różnicami związanymi z płcią

• 2004r. – Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny – Linda B. Buck, Richard Axel – mechanizm rozpoznawania i zapamiętywania zapachów przez ssaczy mózg

1. Żaba szponiasta (Xenopus laevis):

• Badania genomiczne i dotyczące rozwoju , charakterystyka jajników, komórek jajowych i zarodków poddawanych manipulacjom

• 2012r. – Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny – Johna Gurdon, Shin’ya Yamanaka – przeprogramowanie dorosłych komórek tak, aby stały się pluripotentne

1. Ryż (Oryza sativa):

• Roślina modelowa z grupy zbóż

• Wykorzytywany w badaniach genomicznych ze względu na niewielką zawartość jądrowego DNA

• 2004r. – wyhodowanie „złotego ryżu” syntetyzującego β-karoten (prekursor witaminy A) w bielmie nasion

1. Pałeczka okrężnicy (Escherichia coli):

• Bakteria ta żyje normalnie w jelicie ludzi i innych kręgowców, ale łatwo można ją hodować na prostej pożywce poza organizmem

• Dobrze radzi sobie z różnymi warunkami chemicznymi otoczenia i szybko się mnoży

• Jej materiał genetyczny stanowi kolista dwuniciowa cząsteczka DNA długości 4,6 mln pz, kodująca 4300 różnych białek

• Pod względem molekularnym rozumiemy działanie E.coli o wiele lepiej niż jakiegokolwiek innego organizmu

• Z badań nad ta bakterią pochodzi większość naszej wiedzy o podstawowych mechanizmach życia, takich jak replikacja DNA czy odczytywanie instrukcji genetycznych

• W 1976 r. w komórkach E. coli pierwszy raz wytworzono białko zwierzęce

• Obecnie bakterie te wykorzystywane są min. do syntezy ludzkiego hormonu wzrostu. Sklonowanie genu kodującego ten hormon oraz jego cDNA umożliwiło wprowadzenie sekwencji kodujących go do wektora zawierającego promotor aktywny w E. coli. Po wprowadzeniu do komórek E. coli zrekombinowanego DNA wektora powiela się on, dając komórki z dużą liczbą cząsteczek wektora. W każdej z nich gen ludzkiego hormonu wzrostu może ulec ekspresji. Jeśli takim komórkom pozwoli się rosnąć i dzielić, tworzą one ogromną populację, w której każda komórka produkuje ludzki hormon wzrostu.

1. Drożdże (Saccharomyces cerevisiae):

• w porównaniu z innymi komórkami eukariotycznymi genom drożdży jest mały

• Badania genetyczne i biochemiczne nad drożdżami miały zasadnicze znaczenie dla zrozumienia wielu podstawowych mechanizmów działających w komórkach eukariotycznych, włącznie z cyklem podziałów komórkowych.

• Białka uczestniczące w podziale komórek u człowieka i drożdży są do siebie bardzo podobne pod względem sekwencji aminokwasowej.

• Saccharomyces cerevisiae były pierwszym organizmem eukariotycznym dla którego poznano kompletną sekwencję genomu (1997). Powstała wskutek tego projektu baza danych, która jest narzędziem wielu dziedzin nauki, służącym do rozwijania wiedzy o mechanizmach i organizacji komórek eukariotycznych. Wiele białek ludzkich zostało odkryte poprzez wcześniejsze badania ich homologów drożdżowych.

1. Rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana)

• geny zidentyfikowane u Arabidopsis mają swoje odpowiedniki u wszystkich gatunków roślin, w tym roślin uprawnych, badania tego chwastu dają nam wgląd w procesy rozwoju i fizjologii roślin ważnych rolniczo, od których zależy nasze przeżycie.

• Analiza genomu A.thaliana wykazała, że istnieje IV klasa polimeraz RNA – jest ona różna od polimeraz RNA chloroplastów, mitochondriów czy też polimeraz RNA zależnych od RNA. Jest ona specyficzna dla roślin, bierze udział w tworzeniu siRNA zaangażowanych w zależną od RNA metylację DNA, wyciszanie transkrypcji i formowanie heterochromatyny.

1. Muszka owocowa (Drosophila melanogaster)

• To właśnie dzięki badaniom nad tym owadem zbudowano podstawy genetyki klasycznej – na podstawie badań Drospophila melanogaster Tomas Morgan sformułował chromosomową teorię dziedziczenia (mówiącą o tym, że geny znajdują się w chromosomach) za co w 1933 roku dostał Nagrodę Nobla

• Ostatnio celem badań stała się genetyka Drosophila, a zwłaszcza mechanizmy genetyczne leżące u podstaw jej rozwoju zarodkowego i larwalnego. Dzięki pracy nad Drosophila zaczynamy już szczegółowo rozumieć, jak pojedyncza zapłodniona komórka jajowa (zygota) rozwija się w wielokomórkowy organizm obejmujący ogromną liczbę komórek różnych typów, zorganizowanych w dokładnie przewidywalny sposób.

• Mutanty Drosophila, o dziwnie ulokowanych częściach ciała lub nieprawidłowych wzorcach rozmieszczenia komórek umożliwiły identyfikację i scharakteryzowanie genów niezbędnych do powstania prawidłowo zbudowanego osobnika dorosłego. Geny te określają jak każda komórka będzie zachowywać się stosunku do komórek siostrzanych. Co więcej, okazało się że geny Drosophila są niezwykle podobne do genów człowieka, dlatego tez muszka owocowa stosowana jest jako model w badaniach and rozwojem człowieka i jego chorobami , jej genom zawiera odpowiedniki większości genów znanych, jako decydujące w rozwoju chorób człowieka. Jednym z takich genów jest gen "p53" odpowiedzialny za hamowanie rozwoju nowotworów.

5. Zasada działania i zastosowanie technik hybrydyzacji kwasów nukleinowych

Hybrydyzacja – polega ona na specyficznym połączeniu się (za pośrednictwem wiązań wodorowych) zasad azotowych odcinka kwasu nukleinowego, w którym badamy gen, z komplementarnymi zasadami we fragmencie polinukleotydowej sondy molekularnej – tworzy się hybryda. W przypadku cząsteczek dwuniciowych hybrydyzacja musi zostać poprzedzona denaturacją z wykorzystaniem zasad lub wysokiej temperatury. Łącznie z cięciem badanego DNA enzymami restrykcyjnymi, sondowanie umożliwia wykrycie zmiany w sekwencji DNA.

Sonda – to również kwas nukleinowy, a miejsce jej hybrydyzacji do badanego odcinka DNA lub RNA jest widoczne dzięki wyznakowaniu barwnikami fluorescencyjnymi. Niekiedy wykorzystuje się znakowanie immunocytochemiczne z wykorzystaniem przeciwciał dla : biotyny, digoksygeniny.

Początkowo wykorzystywane były też znaczniki izotopowe, ale trudne było wówczas osiągnięcie równocześnie wysokiej czułości i rozdzielczości (ze względu na czułość znacznik powinien mieć wysoką energię emisji – wysoka energia rozprasza sygnał) -> wykrywane poprzez autoradiografie.

Rodzaje hybrydyzacji:

- Southern (1975):

• Pozwala na identyfikację fragmentów o nieznanym rozmiarze (pod warunkiem, że część fragmentu w obrębie sekwencji jest znana lub można ją przewidzieć)

• Polega na przeniesieniu fragmentów po trawieniu restrykcyjnym z żelu agarozowego na membranę nylonową lub nitrocelulozową. Prowadzi to do unieruchomienia fragmentów DNA, które poddaje się hybrydyzacji z sondą (inkubacja kilkugodzinna), płucze się (usuwanie sondy, które niezhybrydyzowała) i wykrywa się sygnał znacznika pochodzącego od sondy.

- Northern:

• Do wykrywania określonej cząsteczki RNA wśród innych cząsteczek RNA

• RNA musi zostać odpowienio przygotowane, alby uniknąć formowania się struktur drugorzędowych, dalej: rozdział cząsteczek RNA przez elektroforezę (w warunkach denaturujących, bez wcześniejszego cięcia enzymami), przeniesienie na membranę nylonową czy nitrocelulozową z oznakowaną sondą (DNA lub RNA) komplementarną do badanej sekwencji. Od metody Southern różni się nieznacznie warunkami. Pozwala na ustalenie liczby genów i rozmiaru fragmentów kodujących, na podstawie ich ekspresji, wykrywa problemy w splicingu.

• Wady: jeden gen może być niekiedy źródłem kilku transkryptów; geny ulegają ekspresji w różnych stadiach i warunkach – nie zawsze zostaną zidentyfikowane

- Fluorescencja FISH in situ:

• Technika lokalizacji markerów na chromosomach lub długich cząsteczkach DNA przez ustalenie pozycji, w których hybrydyzują markery fluorescencyjne

• Markerem jest sekwencja DNA, którą uwidacznia się przez hybrydyzację z sondą fluorescencyjną

• In situ – wersja analizy, w której bada się nienaruszone chromosomy

• DNA należy denaturować np. poprzez wysuszenie na szkiełku mikroskopowym i dodanie formamidu. Aby zredukować niespecyficzną hybrydyzację przed użyciem, sondę miesza się z nieznakowanym DNA pochodzącym z badanego organizmu – będzie on hybrydyzował z powtarzalnymi sekwencjami w sondzie, blokując je, a hybrydyzacja in situ zajdzie z unikatowymi sekwencjami

• Wada metod: niska rozdzielczość – barwione są chromosomy metafazowe – bardzo skondensowane

• Żeby zwiększyć rozdzielczość stosuje się modyfikacje:

- mechaniczne rozciąganie chromosomów poprzez wirowanie

- wykorzystanie chromosomów niemetafazowych (mniej skuteczne ze względu na rozluźnienie chromosomów)

- FISH z nićmi (fiber FISH) – zapewnia dużą rozdzielczość markerów – wykorzystuje DNA przygotowane techniką rozciągania w żelu lub przeczesywania molekularnego

• Zastosowanie: badania translokacji, anomalii genetycznych

- GISH:

• Genomowa hybrydyzacja in situ

• Pozwala odróżnić genomy rodzicielskie w jądrach mieszańców międzygatunkowych lub międzyrodzajowych

• Polega na stosowaniu jako sondy całkowitego genomowego DNA jednego z gatunków rodzicielskich. Drugi genomowy DNA dodawany jest do mieszaniny jako tzw. DNA blokujący lub supresyjny, zapobiegając tworzeniu się niespecyficznych hybryd.

• Metoda pozwala na wykrycie allopoliploidów czy translokacji

- Zoo (zoo blotting):

• Sprawdzenie przez hybrydyzację fragmentu DNA z preparatami DNA izolowanego z pokrewnego gatunku pod kątem konkretnego genu

• Zakłada się, że sekwencje genów są silniej konserwatywne niż sekwencje niekodujące i jest większa szansa, że dadzą pozytywny sygnał w hybrydyzacji z DNA pokrewnego gatunku

• Metoda unika wad hybrydyzacji Nouthern

- Allelospecyficzna (ASO – sllele-specific oligonucleotide):

• Zastosowanie sondy oligonukleotydowej do ustalenia, która z dwóch alternatywnych sekwencji występuje w danej cząsteczce DNA

• Sonda hybrydyzuje jednynie z sekwencją zawierającą mutacje

• Metoda czasochłonna lecz skuteczna

- Hybrydyzacja z użyciem oligonukleotydów:

• Do wykrywania SNP

• Sondą jest jednoniciowe DNA (do 50 nukleotydów), jeśli chociaż jeden się nie zgadza – hybrydyzacja nie zachodzi

• Zastosowanie w: mikromacierzach; hybrydyzacji w roztworze

6. Metody analizy ekspresji genów

Gen – odcinek DNA zawierający informację biologiczną, kodującą RNA i/lub białko

Ekspresja genu – seria zdarzeń prowadzących do uwolnienia i ujawnienia (wyrażenia) się w komórce informacji zawartej w genie

Wynikiem ekspresji genu są produkty:

- pierwotne – RNA

- wtórne – białka

Cele badań ekspresji genów:

- w jakim stopniu da się manipulować ekspresją genów aby uzyskać zamierzony cel

- badania mechanizmów regulujących ekspresją genów

- weryfikacja mechanizmów kontrolujących różne drogi metabolizmu roślin

Metody analizy ekspresji genów na poziomie transkryptu (RNA):

1. RT-PCR:

- reverse transcriptase PCR

- odmiana PCR

- matrycją jest mRNA, które w wyniku działania odwrotnej transkryptazy jest przepisywane na cDNA

- kolejnym etapem jest przeprowadzenie zwykłej reakcji PCR z wykorzystaniem polimerazy Taq

1. Real time PCR:

- od „konwencjonalnego PCR” różni się tym, że pozwala na monitorowanie przyrostu produktu, gdy kinetyka reakcji wchodzi w fazę wykładniczego wzrostu

- przyrost produktu można mierzyć w czasie rzeczywistym

- nie trzeba identyfikować produktów amplifikacji przy użyciu elektroforezy co znacznie uatwia uzyskanie wyników i skraca czas ich otrzymania

- produkt można wykrywać 2 metodami:

- polega na zastosowaniu barwników tj. bromek etydyny lub barwniki fluorescencyjne np. SYBR Green 1, które wiążą sie z dwuniciowym DNA emitując fluorescencję

- polega na zastosowaniu sond DNA znakowanych dwoma barwnikami, z których jeden zwykle fluorescencyjny pełni rolę sygnalizatora, a drugi wyciszacza. W momencie gdy sygnalizator znajduje się blisko od wyciszacza wtedy można zaobserwować fluorescencję. Przykładem tego typu sond są sondy TaqMan PCR i Molecular Beacon.

- pomiar ilości uzyskanego produktu jest możliwy dzięki pomiarowi fluorescencji, której intensywność jest proporcjonalna do ilości powstałego produktu PCR.

1. RACE-PCR:

- szybka amplifikacja końców cDNA, ang. rapid amplification of the cDNA ends PCR

- odmiana reakcji RT-PCR

- cel – dokładne poznanie sekwencji jednego z końców mRNA

- w zależności od tego, czy analizowany jest koniec czy stosuje się odpowiednio technikę 3’RACE-PRC lub 5’RACE-PCR

- etapy:

1. odwrotna transkrypcja (enzym – odwrotna transkryptaza)

2. degradacja oryginalnej nici mRNA w kompleksach RNA-DNA w wyniku działalności RNazy H

3. reakcja PCR ze specyficznym starterem zewnętrzynym

4. reakcja PCR typu nested ze specyficznym starterem wewnętrznym

1. SAGE:

- serial analysis of gene expression

- polega na konstrukcji przedstawicielstwa całkowitego mRNA, składającego się z krótkich znaczników, charakterystycznych dla każdego genu

- etapy:

1. izolacja mRNA, przytwierdzenie poli(A) do kuleczek magnetycznych

2. cięcie enzymem kotwiczącym

3. ligacja linkerów

4. cięcie enzymem odcinającym (uwalnianie tagów od kueczek)

5. ligacja tagów, powstawanie ditagów

6. PCR ze starterami komplementarymi do sekwencji linkerów

7. odcinanie linkerów, ligacja ditagów, klonowanie w wektorze plazmidowym

8. sekwencjonowanie i liczenie poszczególnych tagów.

1. Mikromacierze:

- technika wykorzystująca mikrochipy z naniesionymi sekwencjami DNA

- wykorzystywane warianty:

- najczęściej stosowane – sondy w obrębie sekwencji mRNA

- mikromacierze eksonowe – sondy do sekwencjonowania eksonów

- mikromacierze pokrywające genom (talling array) – badanie ekspresji obszarów pozagenomowych

- mikromacierze do badania splicingu (splicing array) – badanie ekspresji różnych form splicingowych tego samego genu

- polega na syntezie cDNA, wyznakowaniu i hybrydyzacji z sekwencjami znajdującymi się na chipie. Po hybrydyzacji macierz jest skanowana, a fluorescencja poszczególnych punktów jest oznaczana ilościowo.

Metody analizy ekspresji genu na poziomie proteomu

1. Western blot:

- metoda ta polega na transferze białek z żelu poliakrylamidowego na membranę nitrocelulozową lub poliwinylidenową (PVDF) pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego

- „wyblokowanie” błoy poprzez zanurzenie jej w roztworze innego białka np. odtłuszczonego mleka w proszku, albumyny surowicy bydlęcej lub żelatyny

- inkubacja błony w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego a następnie drugorzędowego związanego ze znacznikiem, czyli barwnikiem fluorescencyjnym lub związkiem proiniotwórczym

- w wyniku tego procesu na membranie zostaje odzwierciedlony obraz rozdziału białe uzyskanego na żelu

1. ELISA:

- metoda enzymatyczno – immunosorbcyjna

- metoda wykorzystuje:

- immunoreagent – przeciciało i antygen

- immunosorbent wiążący immunoreagent

- test wykonuje się w plastikowych studzienkach umieszczonych na mikropłytce

- antygen i przeciwciało wiążą się w stabilny kompleks na powierzchni studzienki. Wizualizacja kompleksu zachodzi w efekcie związania się drugiego przeciwciała

7. Zasady importu białek do różnych lokalizacji komórkowych

Proces syntezy białka, translacji zachodzi w cytoplazmie. Jednak docelowe lokalizacje białek są przeróżne. Mogą być kierowane np. do ER, do błony, do wydzielania, do lizosomów, do jądra, peroksysomu, plastydu, czy mitochondrium.

Sekwencje kierujące do ER, Mitochondriów, chloroplastów to sekwencje sygnałowe – fragmenty przyłączające się do terminalnego N, które po skierowaniu białka zostają usunięte. Peroksysomy mają etykietę przy terminalnym C, zaś jądro ma sekwencję wewnętrzną – obie nie zostają wycinane po tym, jak białko osiągnie cel, ale pozostają na nim. Każda sekwencja ma inną charakterystykę. ER ma rdzeń składający się z 6-12 hydrofobowych aminokwasów, często poprzedzanych przez jeden lub dwa zasadowe. Mitochondrialne to 3-5 reszt argininy lub liziny, często z serotoniną lub treoniną. Nie ma glucyn ani asparagin. Aby skierować do chloroplastu, nie ma jakiejś powszechnej sekwencji.

Import białek do ER - gdy na rybosomie pojawi się sekwencja sygnałowa, jest ona rozpoznawana przez SRP (signal recognition particle) – czynnik złożony z 6 różnych białek i 7 SL RNA (około 300 nukleotydów). Związanie SRP z SS powoduje hamowanie translacji. Sekwencja sygnałowa znajduje się na końcu N białka – jest syntetyzowana jako pierwsza. Może składać się z 12-36 reszt aminokwasowych. Przy końcu N zawiera przynajmniej jedną resztę obdarzoną ładunkiem dodatnim, w centrum występuje 10-15 reszt aminokwasów hydrofobowych. Kompleks SRP-SS-rybosom-mRNA zostaje następnie związany przez receptor SRP znajdujący się w błonie ER. Dzięki przyłączonym do błony rybosomom ER przyjmuje postać szorstką. SRP odłącza się od kompleksu, a rybosom nawiązuje kontakt z białkowym kanałem translokacyjnym w błonie ER (wielopodjednostkowy kompleks białek integralnych i peryferycznych, który wiąże SS). Translacja jest ponawiana, powstający peptyd w postaci pętli jest przenoszony na drugą stronę błony – do wnętrza ER. Białko jest przenoszone w postaci rozwiniętej.

Import białek do jądra komórkowego - import ten następuje już po zakończonej syntezie – potranslacyjnie – i zwinięciu białka. Białka kierowane do jądra mają krótkie motywy sekwencyjne zwane Nuclear Localization. Sequence. Sekwencje NLS są rozpoznawane przez rozpuszczalne białka zwane receptorami importu jądrowego i tworzą one przejściowe kompleksy z przenoszonym białkiem. Kompleksy te przez włókna poru jądrowego są kierowane do wnętrza poru, który się otwiera, umożliwiając aktywne przeniesienie kompleksu do jadra. W jądrze następuje dysocjacja kompleksów, po której importyny są przenoszone z powrotem do cytoplazmy.

Import białek do macierzy mitochondrialnej - tylko niewielka liczba białek mitochondrialnych jest syntetyzowana w tych organellach. Większość z nich jest kodowana w jądrze komórkowym i syntetyzowana w cytoplazmie, skąd podlega kierowaniu do mitochondriów – do błony zewnętrznej i wewnętrznej, przestrzeni międzybłonowej oraz macierzy. Na końcu N białka te mają dodatnio naładowaną sekwencję sygnałową, która rozpoznaje receptor z zewnętrznej błony organelli. Do receptora importowane białko jest dostarczane w postaci zwiniętej w kompleksie z cytozolowym białkiem opiekuńczym. Kompleks receptora i kierowanego białka ulega bocznej dyfuzji do miejsc kontaktu błon zewnętrznej i wewnętrznej, w których znajdują się kompleksy translokacyjne – odpowiednio TOM i TIM. Białko jest przenoszone poprzez te kompleksy do macierzy w formie rozwiniętej. Proces translokacji rozpoczyna dodatnio naładowana SS. Zachodzi on dzięki różnicy potencjału w poprzek błony wewnętrznej oraz pułapkowaniu białka w macierzy przez chaperony mitochondrialne. W macierzy SS zostaje odcięta przez proteazę procesorową.

8. Aktualny stan wiedzy nad sekwencjonowaniem genomów roślin

Sekwencjonowanie DNA jest jedną z najpotężniejszych dostępnych technik do analizy i bezpośredniego manipulowania DNA. Ostatecznym celem badania genomów jest poznanie pełnej sekwencji DNA badanych organizmów i ich precyzyjne powiązanie z genetycznymi i fizycznymi mapami genomowymi. Istota swoistości materiału genetycznego tkwi w kolejności nukleotydów. Skuteczność metod sekwencjonowania w połączeniu ze stosowaniem enzymów restrykcyjnych i klonowaniem molekularnym, zapewniła szybki postęp poznawczy w zakresie genetyki molekularnej.

Metody sekwencjonowania:

- Metoda terminacji łańcucha zwana także metodą Sangera lub dideoksy, w której sekwencję cząsteczki jednoniciowego DNA określa się dzięki syntezie komplementarnych łańcuchów polinukleotydowych, a reakcje są zatrzymywane losowo w pozycjach określonych nukleotydów. Oparta jest na zdolności do rozdziału jednoniciowych cząsteczek DNA, różniących się długością zaledwie o jeden nukleotyd, przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym. Oznacza to możliwość rozdzielenia cząsteczek długości 10-150 nukelotydów w postaci widocznych prążków na żelu płytowym lub kapilarnym. ( w skrócie: Sekwencjonowanie metodą terminacji łańcucha wymaga syntezy nowych nici DNA komplementarnych do jednoniciowej matrycy. Synteza nowej nici nie przebiega bez końca gdyż mieszanina reakcyjna zawiera małe ilości każdego z czterech dideoksyrybonukelotydów, które hamują dalszą elongację z powodu występowania wodoru zamiast grupy hydroksylowej w pozycji 3’ węgla. Włącznie ddATP do łańcuchów powoduje losową terminację syntezy w miejscach odpowiadających T w matrycowym DNA. Tak tworzy się pula cząsteczek zakończonych A. Włączenie innych dideoksyrybonukleotydów prowadzi do wytworzenia cząsteczek zakończonych C, G i T. )

- Metoda chemicznej degradacji DNA, nazywana metodą Maxima i Gilberta, w której sekwencję określa się działając na dwuniciowy DNA związkami chemicznymi rozszczepiającymi cząsteczki w specyficznych pozycjach poszczególnych nukleotydów.

Metoda terminacji łańcucha zyskała większą popularność głównie dzięki możliwości jej automatyzacji co pozwoliło na znaczne przyspieszenie procesu sekwencjonowania.

Alternatywne metody do tradycyjnych:

- sekwencjonowanie cykliczne - wyróżnia się tym że materiałem wyjściowym jest zwykle dwuniciowy DNA, a do reakcji wystarcza niewielka ilość matrycowego DNA, nie ma konieczności jego klonowania przed sekwencjonowaniem. Sekwencjonowanie cykliczne przeprowadza się podobnie do reakcji PCR, lecz używane jest tylko jeden starter, a mieszanina reakcyjna zawiera cztery dideoksyrybonukleotydy. Ze względu na obecność jednego startera syntetyzowana jest tylko jedna nić używanej cząsteczki. Produkt reakcji akumuluje się liniowo. Obecność dideoksyrybonukleotydów w mieszaninie reakcyjnej powoduje terminację łańcucha tak jak w metodzie standardowej. W tradycyjny sposób prowadzi się analizę otrzymanej puli nici oraz odczytuje sekwencję.

- pirosekwencjonowanie – metoda która nie wymaga elektroforezy ani innego rozdzielania fragmentów przez co jest dużo szybsza zarówno od sekwencjonowania metodą terminacji łańcucha jak i degradacji chemicznej. W jednym eksperymencie można odczytać zaledwie kilkadziesiąt par zasad. Synteza nowej nici przebiega w mieszaninie reakcyjnej, w której nie ma dideoksyrybonukleotydów. Każdy deoksyrybonukleotyd jest dodawany oddzielenie razem z enzymem- nukleotydazą. Jeśli nukleotyd nie został włączony w syntetyzowana nić jest degradowany przez nukleotydazę. Włączenie nukleotydu rejestruje się jako błysk chemiluminescencji indukowany przez pirofosforan, który uwalnia się z deoksyrybonukleotydu. Umożliwia to rejestrowanie kolejności przyłączanych deoksyrybonukleotydów.

- Hybrydyzacja Chip-DNA: mikro:chip” DNA z naniesionym układem różnych oligonukleotydów. Proces oparty jest na hybrydyzacji sekwencjonowanej cząsteczki do układu oligonukleotydów. Sekwencję badanej cząsteczki ustala się po przeprowadzeniu porównania sekwencji wszystkich oligonukleotydów, z którymi hybrydyzuje. Wadą metody jest mała długość cząsteczki możliwej do sekwencjonowania.

Powszechnie stosuje się dwa różne sposoby przygotowania genomowego DNA do sekwencjonowania. Pierwszy z nich – to metoda shotgun w zastosowaniu do całego genomu, polegająca na pocięciu genomowego DNA wybranymi restryktazami na stosunkowo niewielkie fragmenty z częściowo zachodzącymi na siebie sekwencjami. Każdy z fragmentów jest sekwencjonowany indywidualnie, a zachodzące na siebie odcinki pozwalają uszeregować poszczególne sekwencje we właściwej kolejności. Drugi sposób to metoda klonowania uporządkowanego, polegająca na sekwencjonowaniu bardzo dużych wycinków DNA, pochodzących ze znanych pozycji na chromosomie, i stopniowym dzieleniu każdego dużego fragmentu na mniejsze. Oba sposoby stosowane są do sekwencjonowania dużych genomów z podobnym powodzeniem.

Sekwencjonowanie genomów roślinnych jest zdecydowanie najtrudniejsze bo to w tym królestwie występują największe genomy. Bilans sporządzony na koniec 2000r przez International Human Genome Seguencing Consortium obejmował tylko jeden genom roślinny. Jako pierwszy udało się zsekwencjonować genom rośliny modelowej rzodkiewnika pospolitego Arabidopsis thalina, najmniejszego wśród znanych genomów roślinnych. Stosunkowo mały genom ryżu i bardzo duże znaczenie gospodarcze tej rośliny sprawiły, że to właśnie ryż był pierwszą rośliną uprawną, której genom zsekwencjonowano. Naukowcom z Francji i Włoch udało się zsekwencjonować genom winorośli właściwej (Vitis vinifera). Badania francusko-włoskiego zespołu naukowców zakończyły się uzyskaniem pełnej sekwencji genomu winorośli. Za obiekt doświadczeń obrano odmianę Pinot Noir - przodkinię innych odmian. Naukowcy ze Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego jako pierwsi w Polsce odczytali genom rośliny. Pierwszym genomem roślinnym zsekwencjonowanym w Polsce jest genom chloroplastowy ogórka. Dotychczas na świecie odczytano informację genomu chloroplastowego u około 40-tu organizmów roślinnych. Odczytany genom jest jednocześnie pierwszym w świecie tak dokładnie zbadanym w rodzinie dyniowatych. Natomiast zespół prof. Zbigniewa Przybeckiego ze Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego Warszawie zsekwencjonowali genom jądrowy ogórka północnoeuropejskiego. Genom chloroplastowy zbadany wcześniej liczy 155 tys. nukleotydów, a więc jest ponad 2 tys. razy mniejszy niż genom jądrowy tej rośliny, który zbadano teraz.

Zakończone programy poznania genomów:

- Arabidopsis thaliana (rzodkiewnik) – program International Colaboration,

- Oryza sativa L. ssp. indica (ryż) – Beijing Genomics Institute, Zhejiang University, Chinese Academy of Sciences

Rozpoczęte programy ( stan na 22.04.2008):

- Allium cepa (cebula) – Univ. of Wisconsic, 20 159 kpz

- Actinidia deliciosa (owoc kiwi) - Genesis,

- Ananas comosus (ananas) - Univ. of Queensland

- Avena sativa (owies) – NCBI – 16 000 000 kpz

- Brassica napus (kapusta rzepak) – Phoang Univ., Univ. Of Minnesota

- Coffea arabica (kawa) – Univ. Of Campinas

- Glycine max (soja)

- Gossypium hirsutum (bawełna)- 2 118 000 kpz

- Zea mays (kukurydza)- 1 400 000 kpz

9. Metody otrzymywania haploidów w kulturach in vitro

Haploid – osobnik posiadający gametyczna (1n) liczbę chromosomów w komórkach somatycznych.

Indukowanie haploidów:

• Stymulowana partenogeneza – zapylanie napromieniowanym pyłkiem – uszkodzenie komórek plemnikowych, pyłek nieżywotny, ale indukuje rozwój komórek woreczka zalążkowego

• Krzyżowanie oddalone z eliminację genomu jednego z rodziców – Kasha, Kao, 1970; jęczmień, metoda bulbozowa – w wyniku zapłodnienia jęczmienia pyłkiem innego gatunku jęczmienia, otrzymano zarodek, w którym następowała eliminacja genów pochodzących od innego gatunku jęczmienia

• Androgeneza in vitro – otrzymywanie roślin haploidalnych z gamet męskich – można ją przeprowadzać w kulturach pylników wyizolowanych i położonych na pożywce stałej, kultury mikrospor umieszczanych w kulturze płynnej – dużo wydajniejsza niż kultury plemników, ale trudniejsza i wymaga bardziej profesjonalnego wyposażenia

• Gynogeneza in vitro – otrzymywanie roślin haploidalnych z gamet żeńskich

Czynniki wpływające na efektywność procesu regeneracji roślin haploidalnych w kulturach pylników i mikrospor:

- genotyp roślin donorowych

- warunki wzrostu roślin donorowych

- stadium rozwoju mikrospor

- metody przedtraktowania (chemiczne lub fizyczne)

- pożywki indukujące i regenerujące

- warunki hodowli in vitro

Androgeneza

Czynniki wpływające na wydajność androgenezy:

• Genotyp rośliny wyjściowej

• Warunki wzrostu i stan fizjologiczny roślin wyjściowych – odpowiednie stadium rozwoju mikrospory to jedno lub wczesno dwujądrowe.

• Stres (fizyczny, chemiczny) – stres jest konieczny po to, by zmienić drogę rozwojową mikrospory z gametoficznej na sporofityczną. Pierwszym krokiem tego procesu jest anormalny, czyli symetryczny podział jądra. Stres fizyczny – działanie temperaturą. Stres chemiczny – zwiększamy ciśnienie osmotyczne i traktujemy mannitolem.

• Skład pożywek – często stosujemy pożywki o podniesionej zawartości cukru, ważna proporcja azotu amonowego do azotanowego. Jeżeli mamy pylniki – indukcja na pożywkach stałych, mikrospory – indukcja na pożywkach ciekłych.

• Warunki prowadzenia kultury

Ograniczenia androgenezy:

• Pozytywny efekt tylko u kilku rodzin (psiankowate, trawy, krzyżowe)

• Tylko część pyłku podejmuje androgenezę, z tego tylko część regeneruje

• Niestabilność genetyczna (kalus, zmienność gametoklonalna)

• Powstawanie roślin albinotycznych głównie u traw – przyczyny: uszkodzenia fizjologiczne, uszkodzenia DNA chloroplastów, współdziałanie genów); wypływa: stężenie Fe, cukru, 2,4 – D, forma azotu, temperatura wzrostu donorów, temperatura wzrostu kultur

Gynogeneza

Cel: Możliwość otrzymania haploidów u roślin, u których występują zaburzenia mikrosporogenezy

Zalety:

• Mniej roślin albinotycznych

• Mniejsza zmienność gametoklonalna

Czynniki warunkujące gynogenezę:

• Genotyp rośliny donorowej

• Stan fizjologiczny rośliny donorowej

• Rodzaj eksplantatu – zakłada się kultury zalążków, wykłada się całe pąki kwiatowe

• Stadium rozwoju woreczka zalążkowego

• Chłodzenie

• Składniki pożywki – podobne pożywki jak do kultur pylników czy mikrospor

10. Techniki stosowane w detekcji oraz identyfikacji wirusów

WIRUSY ROŚLIN – to pasożyty roślin bytujące wewnątrz komórek roślinnych a więc tzw. ENDOBIONTY (czyli pasożyty żyjące wewnątrz komórek). Wirusy nie rozmnażają się tak jak organizmy żywe,tzn. nie odbywają procesów płciowych, nie wytwarzają zarodników ani nawet nie dzielą się na potomne elementy. Namnażają się jedynie w komórkach roślin przez odrębną replikację lub biosyntezę elementów składowych, z których montują później swoje pełne cząstki (wiriony). Składnikami tymi są: kwas nukleinowy stanowiący genom wirusa, otoczka białkowa (kapsyd, płaszcz białkowy stanowiący osłonkę genomu) oraz u niektórych wirusów roślin dodatkowa otoczka lipoproteinowa. Genom i najbardziej z nim związana część kapsydu tworzą NUKLEOKAPSYD.

Objawy porażenia roślin przez wirusy dzielą się na lokalne i systemiczne.

Objawy lokalne to objawy powstające w miejscach infekcji, na ogół po inokulacji mechanicznej (inokulacja - sztuczne zakażanie roślin), obejmują niewielkie grupy komórek w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca infekcji. Należą do nich lokalne plamki chlorotyczne (występujące w wyniku zablokowania syntezy chlorofilu w komórkach zakażonych) czy nekrotyczne o zabarwieniu brunatnym pojawiające się po obumarciu komórek ulegających chlorozie.

Objawy systemiczne to wszelkie zmiany w wyglądzie, rozwoju i budowie roślin wywołane przez wirusy, pojawiające się nie tylko w miejscach inokulacji. Powstają na skutek ustrojowego (systemicznego) zasiedlania roślin przez wirusy. Należą do nich: zahamowanie wzrostu, karłowatość a co za tym idzie drobnienie owoców, liści, kwiatów czy skrócenie pędów (wszelkie typy objawów związanych z zahamowaniem wzrostu zalicza się do większej grupy objawów czyli zniekształceń), zmiana zabarwienia (mozaika, pstrość liści, która może także występować na owocach i łodygach, smugowatość, przejaśnienie lub żółknięcie nerwów, rozbicie barwy na kwiatach), nekrozy obejmujące np. całe organy, inkluzje czyli ciała wtrętowe należące do objawów wewnętrznych.

Detekcja i identyfikacja wirusów najlepszym sposobem potwierdzenia, że to wirus lub wiroid jest sprawcą choroby, jest wyizolowanie i zidentyfikowanie patogena. Stwierdzenie, jaki gatunek wirusa jest sprawcą choroby wymaga szczegółowej identyfikacji za pomocą testów biologicznych lub serologicznych albo przez badanie różnych charakterystycznych właściwości wirusów.

• Testowanie biologiczne – wykrywanie i identyfikacja wirusów przy użyciu roślin wskaźnikowych. Jest to gatunek a nawet odmiana rośliny reagująca niezawodnie (to znaczy zawsze kiedy roślina jest inokulowana) i w sposób charakterystyczny dla danego wirusa (tzn. pozwalający odróżnić go od innych wirusów). Dobrze jest, jeśli ta reakcja charakterystyczna występuje szybko po inokulacji, nie później jak 2-3 tygodnie. Przykładem jest test SdY (wykrywanie wirusa Y ziemniaka na odciętych liściach wyselekcjonowanego klonu Solanumdemissum, reakcja w postaci brunatnych plamek po 5-6 dniach). W testach z bioindykatorami ważna jest obserwacja rośliny kontrolnej należącej do tego samego gatunku, znajdującej się w tym samym wieku i tak samo traktowanej (np. liście były opylone proszkiem karborundowym i inokulowane wodą destylowaną lub sokiem ze zdrowych roślin).

• Techniki serologiczne – wykorzystywane są tu antygeniczne (immunogeniczne) właściwości wirusów. Kapsyd wirusa zbudowany jest z podjednostek białkowych, a zatem białko kapsydu ma właściwości antygeniczne. Reakcja immunologiczna na konkretny wirus (antygen) polega na tym, że powstają przeciwciała o budowie pasującej do budowy tego antygenu. W przypadku wirusów przeciwciała łączą się z odpowiadającymi im powierzchniowymi strukturami białka kapsydu (epitopami). Serologiczne badania wirusów polegają właśnie na obserwacji tej reakcji.

1. Test aglutynacji – do kropel surowicy nałożonych na podłoże szklane dodaje się soku wyciśniętego z badanych roślin i miesza bagietką. Czas reakcji 30-45 min, wynik: wytrącanie się dużych agregatów: cząstek wirusa związanych z organellami lub innymi materiałami roślinnymi, połączonych z mostkami przeciwciał. Metoda mało czuła; mogą np. pojawiać się przypadki niewystąpienia reakcji aglutynacji w próbkach soku z roślin zawirusowanych (fałszywy wynik negatywny).

2. Test mikroprecypitacji na szkiełkach – do kropel surowicy dodaje się krople wstępnie sklarowanego soku z badanych roślin. Czas reakcji: 5-6 a nawet 18-24 godziny. Wynik: precypitacja kompleksów cząstek wirusa z przeciwciałami widoczna pod mikroskopem stereoskopowym (powiększenie 10x). Wady: konieczność klarowania soku, dłuższy czas oczekiwania na wynik, możliwość uzyskania fałszywego wyniku negatywnego co związane jest z mniejszą zawartością wirusa. Ale: mniejsze ryzyko reakcji niespecyficznych (dzięki sklarowaniu soku i usunięciu większości materiału roślinnego).

3. Test lateksowy – metoda podobna do dwóch powyższych jednak przeciwciała wydzielone z surowicy nakładane są na niewielkie kuleczki lateksu. Czynnikiem reagującym z cząstkami wirusa są już nie małe przeciwciała ale duże kompleksy kuleczek lateksu opłaszczonych przeciwciałami. Zalety: wyższa czułość, metoda zwiększa szansę wykrycia małych ilości wirusa.

4. Techniki immunoenzymatyczne; test ELISA – o znacznie większej czułości. Składa się z kilku etapów: wyłapanie cząstek wirusa przez przeciwciała zaadsorbowane na stałym podłożu, reakcja tych unieruchomionych cząstek z koniugatem (czyli kolejną porcją przeciwciał sprzężonych z enzymem, który katalizuje reakcję, efektem której jest np. zmiana barwy substratu) i w końcu dodanie do kompleksu przeciwciała –wirus – koniugattegoż substratu zmieniającego barwę w obecności enzymu. Zmiana barwy mierzona jest poprzez pomiar wartości ekstynkcji. Najczęściej stosowaną wersją tej metody jest DAS-ELISA (DoubleAntibody Sandwich) w której antygen wiązany jest pomiędzy dwiema warstwami przeciwciał.

5. Techniki immunoelektronomikroskopowe –w których mikroskop elektronowy to narzędzie do detekcji wirusów dzięki możliwości obserwacji reakcji aglutynacji. Zwiększają czułość metod serologicznych stosowanych do wykrywania wirusów, których mankamentem jest w wielu przypadkach niemożność zaobserwowania reakcji między antygenem a przeciwciałami.

• Technika zbrylania – do kropli surowicy dodaje się sok z badanej rośliny. Następuje zlepianie się cząstek wirusa i przeciwciał w nieforemne bryły. Na kroplę nakłada się siatkę mikroskopową na której bryły te zostają zadsorbowane i obserwuje produkty mikroaglutynacji.

• Technika wyłapywania – na kroplę surowicy nakłada się siatkę mikroskopową. Po wyplukaniu i odsączeniu na siatce pozostaje warstwa zaadsorbowanych przeciwciał. Następnie na taką siatkę nakłada się próbkę i zachodzi wiązanie cząstek wirusa z przeciwciałami.

• Metody biochemii i biologii molekularnej – bardzo ścisłe i precyzyjne ale drogie a więc mało powszechne. Służą do wykrywania wirusów i wiroidów w materiale roślinnym czy określania struktury białek co pozwala na identyfikację gatunku a nawet szczepu patogena.

• Elektroforeza w żelach agarozowych lub poliakrylamidowych – technika rozdziału fragmentów DNA lub RNA według ich wielkości. Aby zidentyfikować wielkość cząsteczek kwasu nukleinowego w prążkach, na żel nakłada się standardy wielkości – mieszaninę DNA lub RNA o znanych długościach łańcucha. Porównując prążki z badanej próbki z prążkami standardu jesteśmy w stanie określić wielkość cząsteczek DNA/RNA w badanej próbce. Aby zobaczyć wynik rozdziału DNA/RNA na żelu należy żel wybarwić w substancji, która wiąże się z kwasem deoksynukleinowym. W tym celu w laboratorium często stosowany jest bromek etydyny lub toluidyny, który wnika w głąb struktury DNA, a następnie po nad wpływem światła UV świeci na pomarańczowo.

• Hybrydyzacja z sondą molekularną – sonda to DNA o sekwencji komplementarnej w stosunku do nici DNA lub RNA, którą chcemy wykryć. Uzyskuje się je w procesie transkrypcji lub odwrotnej transkrypcji w pozakomórkowym systemie enzymów i oznacza jako cDNA. Jeden z nukleotydów służących jako substraty do syntezy sondy jest znakowany radioaktywnym fosforem. Próbki ekstraktów RNA z materiału roślinnego, w którym chcemy wykryć wirus, nanosi się na tzw. filtr nitrocelulozowy i zapieka celem unieruchomienia kwasu nukleinowego zaadsorbowanego na filtrze. Tak przygotowany filtr zanurza się w kąpieli zawierającej sondę molekularną. Sonda wiąże się z komplementarnym RNA. Wystarczy teraz wykonać autoradiogram błony i miejscach, na które naniesiony był ekstrakt z roślin chorych pojawią się czarne plamki na filmie. Często stosuje się też sondy fluorescencyjne.

• PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy. Metoda bardzo przydatna w przypadkach prób wykrywania wirusów występujących w bardzo małej, niewykrywalnej ilości w badanym materiale roślinnym. Przed podjęciem próby wykrycia patogenu można zamplifikować jego kwas nukleinowy. W tym celu należy najpierw przygotować parę starterów flankujących powielany odcinek DNA. Reakcję przeprowadza się w środowisku zawierającym ekstrakt kwasu nukleinowego, którego odcinek jest powielany (matryca), oba startery, termostabilną polimerazę DNA oraz wolne nukleotydy będące surowcami do syntezy DNA i kationy magnezu. Pełny cykl obejmuje denaturację powielanego kwasu nukleinowego w temp 95 st.C, przyłączanie starterów czyli annealing w temp. ok. 50 st. C, wydłużanie łańcucha temp. 72 st. C oraz denaturacja (odłączanie łańcucha zreplikowanego, 30-60 s, 95 st. C). RT-PCR: Większość wirusów roślin ma genom w postaci ssRNA, który nie może być amplifikowany w łańcuchowej reakcji polimerazy. Konieczne jest poddanie takiego kwasu procesowi odwrotnej transkrypcji a dopiero potem produkt tej reakcji może zostać wykorzystany jako matryca do reakcji PCR.

Po reakcji PCR produkty poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu. Można także poddać je analizie długości fragmentów restrykcyjnych, w której odpowiednio dobrane enzymy restrykcyjne tną kwasy nukleinowe w odpowiednich miejscach. Po rozdzieleniu fragmentów restrykcyjnych i denaturacji do form jednoniciowych przenosi się je na filtr nitrocelulozowy i lokalizuje autoradiograficznie. Ta metoda identyfikacji fragmentów DNA nosi nazwę Southern blotting a dla RNA Northern blotting.

11. Mechanizmy regulacji ekspresji genów na poziomie transkrypcji

Transkrypcja:

• przetwarzanie informacji z zapisanej w DNA na zapisaną w RNA

• katalizowana przez zależne od DNA RNA-polimerazy

• podlega ścisłej regulacji

Regulacja ekspresji genów przez sekwencje (w tym geny) regulatorowe

• Regulacja z reguły na poziomie inicjacji transkrypcji

• Działanie typu cis: poprzez oddziaływania strukturalne w czasie tworzenia kompleksu inicjującego transkrypcję:

1. bezpośredni efekt części promotora, czyli wpływ sekwencji bliskich (DNA-białko). Promotor znajduje się przed genem, w określonej odległości od miejsca startu transkrypcji. Zapewnia podstawowy poziom transkrypcji.

2. sekwencje oddalone: ekspresja genów może być kontrolowana przez elementy regulatorowe zlokalizowane w odległości dziesiątek tysięcy par zasad od miejsca startowego (ale na tej samej nici!): nasilacze i wygaszacze.

Czynniki cis – sekwencje oddalone:

• Enhancery stymulują transkrypcję, silencery hamują transkrypcję .

• Jedne i drugie działają niezależnie od orientacji, tj. odwrócenie ich sekwencji nie wpływa na efekt.

• Jedne i drugie działają niezależnie od miejsca położenia w genomie: zlokalizowane w dużej odległości od regulowanego promotora genu.

• Jedne i drugie stanowią miejsce wiązania dla specyficznych czynników transkrypcyjnych, które bezpośrednio oddziałują na transkrypcję oddalonego genu.

Czyli wyróżniamy sekwencje regulatorowe w obrębie promotorów (1) i enhancerów (wzmacniaczy) (2).

• Działanie typu trans: białka wiążące się z sekwencjami regulatorowymi (elementami cis) – czynniki transkrypcyjne.

Pozycjonowanie polimeraz RNA w miejscu rozpoczęcia transkrypcji wymaga u Eucaryota dodatkowych białek zwanych czynnikami transkrypcyjnymi. Polimeraza II RNA rozplata nici DNA, syntetyzuje RNA i łączy ponownie obie nici DNA. Samodzielnie nie jest w stanie rozpoznać promotora genu i zainicjować transkrypcji.

Inicjacja transkrypcji czynniki cis DNA:

Promotor genów transkrybowanych przez polimerazę II:

• Rdzeń, promotor rdzeniowy – miejsce inicjacji, zawiera sekwencje niezbędne dla uruchomienia transkrypcji. Około 25 do 35 bp powyżej miejsca inicjacji transkrypcji znajduje się krótka sekwencja zwana kasetą TATA. Jest to miejsce wiązania kompleksu inicjującego transkrypcję – białka TBP.

• Obok promotora rdzeniowego znajduje się obszar zwany promotorem bliskim obejmujący obszar od -45 do -100. Zawiera sekwencje regulatorowe CAAT ( u roślin) oraz GC-box, które wspólnie określa się jako UAS (upstream activation sequences).

• W większej odległości od promotora rdzeniowego (dalej niż -100) znajduje się promotor oddalony. Występują tu zebrane w moduły sekwencje odpowiedzialne za specyficzną regulację transkrypcji zwane bliskimi elementami cis. Z elementami cis współdziałają czynniki transkrypcyjne mogące nie tylko nasilać ale też hamować bądź wywierać synergistyczny wpływ na przebieg transkrypcji.

Pierwszym etapem inicjacji transkrypcji jest przyłączenie ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID. TBP jest składnikiem tego czynnika rozpoznawanym i wiązanym przez sekwencję TATA. Czynnik TFIID zawiera 12-15 podjednostek zwanych TAF. Są one celem dla białek aktywujących – stanowią mostki pomiędzy aktywatorami a TBP wpływając na wiązanie kompleksu do promotora. Po przyłączeniu się pierwszego ogólnego czynnika transkrypcyjnego dołączają się następne czynniki wraz z polimerazą RNA tworząc kompleks inicjujący transkrypcję. Czynnik TFIIH fosforyluje polimerazę RNA zmieniając jej konformację tak, że polimeraza uwalnia się z kompleksu i rozpoczyna transkrypcję.

Genowo – specyficzne czynniki transkrypcyjne

Białka te zawierają przynajmniej 2 domeny: jedna odpowiedzialna za odnajdywanie i rozpoznawanie elementu cis (domena wiążąca DNA), druga za oddziaływanie z innymi białkami biorącymi udział w aktywowaniu transkrypcji (domena funkcjonalna TAD) – koaktywatory, korepresory.

Domeny wiążące DNA: helisa-zwrot-helisa (domena homeotyczna), helisa-pętla-helisa, palec cynkowy Cop1 u Arabidopsis (negatywny regulator fotomorfogenezy), zamek leucynowy.

Koaktywatory – uczestniczą w aktywacji transkrypcji, ale nie wiążą się z DNA. Działają przez oddziaływania z białkami kompleksu transkrypcyjnego kompleks mediatora jest ogólnym koaktywatorem polimerazy II.

MEDIATOR:

• duży (>2 MD) kompleks białkowy 20-25 białek wymagany dla inicjacji i reinicjacji transkrypcji.

• stanowi mostek między polimerazą a aktywatorami

• moduł ogonowy to integrator sygnałów pochodzących od czynników transkrypcyjnych

• kompleks środkowy i głowa wchodzą w bezpośredni kontakt z polimerazą

• ważny zarówno dla pozytywnej jak i negatywnej regulacji transkrypcji.

Chromatyna - podstawowy element regulacji transkrypcji genów eukariotycznych

Rola architektury chromatyny w regulacji ekspresji genów:

• DNA w obrębie nukleosomu jest zabezpieczone przed transkrypcją i musi być wcześniej odwinięte (enzym odwijający).

• Metylacja cytozyn (Cp*N) z preferencją CpG w promotorach lub ich pobliżu (na początku genu) utrudnia dołączanie czynników transkrypcyjnych do promotora. U roślin metylowane są też trypletu CAG, CTG (*p-fosforan). Metylacja CpG w promotorach powoduje hamowanie ekspresji genów.

• Heterochromatyna – zlokalizowana przede wszystkim w peryferycznej części jądra – w większości jest nieaktywna transkrypcyjnie. Taka struktura chromatyny ogranicza wiązanie czynników transkrypcyjnych.

Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji:

1. Modyfikacje histonów rdzeniowych, najważniejsze: acetylacja i metylacja:

• modyfikacje potranslacyjne zachodzące na N-końcowych ogonach histonów H3 i H4 regulują transkrypcję poprzez:

• ułatwienie przesuwania nukleosomów od promotora

• rekrutowanie czynników transkrypcyjnych

• regulowanie forowania heterochromatyny/euchromatyny

• histony podlegają też: fosforylacji, ADP-rybozylacji, ubikwitynowaniu i SUMOylacji

Acetylacja histonów na lizynie: enzym – acetylotransferaza histonowa (HAT). W wyniku acetylacji znika ładunek, co ogranicza siłę oddziaływań histonów z ujemnie naładowanym DNA. Osłabienie oddziaływań pomiędzy nukleosomami hamuje kondensację chromatyny. Chromatyna staje się dostępna dla czynników transkrypcyjnych i polimeraz.

Metylacja histonów: enzym – metylotransferaza histydynowa (HMT), może funkcjonować jako aktywator bądź represor transkrypcji w zależności od specyficzności substratowej. Metylacja reszt K4, K36, K79 w histonie H3 aktywacja transkrypcji.

2. Remodeling (przebudowywanie) struktury chromatyny:

• przemodelowanie chromatyny zależne od ATP (kompleksy CRC)

• sliping - przesuwanie nukleosomów (cis) - zwalnianie dostępu do miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych

• przesuwanie na inną nić (trans)

• tworzenie dinukleosomów z mononukleosomów

• Kompleksy przebudowujące chromatynę zależne od ATP składają się z wielu białkowych podjednostek: częścią rdzeniową jest ATP-aza zależna od DNA należąca do rodziny SNF2

• drożdżowy SWI/SNF - potrzebny do ekspresji genów decydujących o typie koniugacyjnym drożdży (switching), oraz ekspresji genów regulujących metabolizm sacharozy (sucrose non-fermenting)

2. Metylacja DNA wpływa na strukturę chromatyny i reguluje proces transkrypcji genów eukariotycznych:

Metylacja DNA, czyli przyłączenie grupy metylowej do cytozyny (u ssaków metylacji podlegają sekwencje CpG, do 10% cytozyn jest metylowanych u ssaków ) powoduje zamknięcie danego obszaru chromatyny, może być podtrzymywana podczas podziałów komórkowych, może powstawać de novo.

12. Zastosowanie kultur in vitro w hodowli roślin

Kultury in vitro – kultury komórek, tkanek, fragmentów organów roślinnych prowadzone w naczyniach szklanych, w sterylnych i ściśle kontrolowanych warunkach laboratoryjnych na specjalnie dobranych pożywkach.

• Rozmnażanie klonalne – szybkie i masowe mnożenie

• Rozmnażanie gatunków wymierających i cennych genotypów

• Otrzymywanie roślin wolnych od patogenów [wirusów]

• Otrzymywanie mieszańców międzygatunkowych [przełamywanie barier niekrzyżowalności]

• Nasiona – przełamywanie spoczynku, produkcja somatycznych nasion

Możliwości zastosowania somatycznych nasion

U gatunków o dużej zdolności do somatycznej embriogenezy,

Rozmnażanie roślin, które: nie tworzą nasion (męskosterylne, żeńskosterylne,poliploidalne) lub gdy nasiona są drogie (np. begonia),

 W leśnictwie – skrócenie wieloletniej hodowli,

Klonowanie roślin transgenicznych,

Banki genów.

• Otrzymywanie haploidów i linii homozygotycznych do mieszańców heterozyjnych:

- skrócenie cyklu komórkowego – zastępują kilkupokoleniowy chów wsobny. Przyspieszenie procesu zwłaszcza u roślin dwuletnich.

- łatwiejsza selekcja rekombinantów

- możliwość znalezienia linii DH o dobrych cechach gospodarczych w porównaniu do form wyjściowych

- haploidy i linie DH są materiałem do badań nad mapowaniem genów, analizą genetyczną, dziedziczenia cech, pokrewieństwa filogenetycznego, mutacjami i transformacją genetyczną.

• Otrzymywanie form tolerancyjnych na stresy – selekcja in vitro i mutageneza

• Produkcja wtórnych metabolitów dla przemysłu farmaceutycznego

KULTURY ZARODKÓW

1. Otrzymywanie mieszańców międzygatunkowych

• kultury izolowanych zarodków F1 (technika embryo rescue)

• zapylanie zalążków in vitro

2. Skracanie lub przełamywanie stanu spoczynku nasion

3. Badania nad przebiegiem procesów wzrostu i rozwoju oraz wpływem światła, temperatury, regulatorów wzrostu oraz substancji mutagennych na zarodek

13. Metody klonowania genów i stosowane w nich wektory

Metody klonowania:

1. klonowanie w wektorach plazmidowych

2. klonowanie w wektorach eukariotycznych

3. klonowanie w wektorze fagowym

4. klonowanie w kosmidach

5. klonowanie w Yac’u

6. klonowanie w Bac’u

Wybór odpowiedniej techniki zależy od wielkości klonowanego fragmentu.

Etapy klonowania:

1. Uzyskanie materiału zawierającego poszukiwany gen

2. Izolacja preparatu DNA w którym gen ten jest obecny we fragmencie o wielkości pozwalającej na dalsza manipulacje

3. Połączenie tego fragmentu w warunkach in vitro z cząsteczką wektora

4. Wprowadzenie cząsteczek wektora zrekombinowanych z pożądanym insertem do żywych komórek gospodarza, w których są one utrzymywane i namnażane dzięki funkcjom replikacyjnym wektora w efekcie otrzymuje się klony komórek gospodarza ze specyficzną zrekombinowaną cząstką

5. selekcja klonów( zawierających poszukiwany fragm. DNA)

Wektory – cząsteczki starannie zaprojektowane; replikony oparte na wirusach, plazmidach (lub innych pozachromosomowych elem.) lub autonomicznie replikujących się sekwencji , zwykle charakteryzujące się:

a) zdolnością do autonomicznej replikacji przynajmniej w jednym gospodarzu

b) niewielkim rozmiarem

c) możliwością powielania klonowanej sekwencji

d) obecnością unikalnych miejsc trawienia dla wielu enzymów restrykcyjnych

e) obecnością markerów selekcyjnych

f) obecność sygnałów transkrypcyjnych i translacyjnych

h) brak możliwości przenoszenia do innych org- ważne w przypadku klonowania genów toksyn

Rodzaje wektorów:

1. Plazmidowe

• Posiadają:

- miejsce -ori,

-gen odporności na antybiotyk,

-promotor,

-polilinker,

-gen markerowy

• Pochodzą od naturalnie występujących plazmidów bakteryjnych

• Koliste cząsteczki o wielkości 2-20 kpz

• Można do nich wklonować sekwencje do 10 kpz

• Występują w wielu (nawet do kilkuset) kopiach na komórkę

• Łatwe w przygotowaniu, namnożeniu i oczyszczaniu

1. Bakteriofagowe

• Przekształcony genom faga lambda, z którego usunięto nieistotny fragment i na jego miejsce można wprowadzić obcą sekwencję, do 23 kpz

• Fagi wstrzykują jednoniciowy, liniowy DNA do komórki gospodarza, w której przybiera on formę kolistą

• Infekcja może prowadzić do: cyklu litycznego lub lizygenicznego (wbudowanie do genomu gospodarza)

1. Kosmidowe

• Łączą właściwości sekwencji cos faga lambda i plazmidów

• Ulegają pakowaniu do cząstek wirusa

• Zawierają miejsce ori, gen odporności na antybiotyk oraz polilinker

• Pozwalają na wprowadzenie sekwencji 30-45 kpz

• Fagmidy- pochodne faga M13 ( jedyny fragment to M13 ori)

1. Sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC)

• BAC – oparty na czynniku płciowym F, który u bakterii odpowiada za proces koniugacji, występuje w 1-2 kopiach na komórkę

• Pojemność do 300 kpz

• Zawierają: oriS, par A, parB, parC, repE, lacZ,

• Gospodarz: bakterie,

• typ cząsteczki: kolisty,

• lb kopii: 1-2

1. Sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC)

• Zrekombinowany chromosom drożdżowy, w którym pozostawiono sekwencje: centromerową (CEN),

• 2 sekwencje telomeru (TEL),

• Sekwencję autonomicznej replikacji (ARS)

• ORI

• Zawiera markery selekcyjne (TRP1 i URA3 – zapewniają przetrwanie komórkom zawierającym prawidłowo tworzone YAC)

• Gen SUP4-o

• Pojemność 0,2-2 Mpz

• Ligacja dwóch odcinków końcowych wektora z fragmentem DNA

• Kompletny chromosom wprowadza się do komórek drożdży (transfekcja)

1. Wektory eukariotyczne

• Plazmid Ti (tumor inducing)

- z bakterii Agrobacterium tumefaciens, używany do przenoszenia DNA do rośliny

- zawiera:

* fragment T-DNA ( 20 000 bp)

-> onkogeny- synteza hormonów roślinnych ( auksyn, cytokinin)

-> geny biorące udział w morfogenezie tumorów- tml

-> geny syntezy i sekresji opin

* sekwencje graniczne- biorą udział w integracji z genom roślnnym

-> RB- prawa sekwencja graniczna

- > LB- lewa swkencja graniczna

* rejon wirulencji vir

* rejon początku replikacji ori

*rejon katabolizmu opin

• Plazmid Ri

- z bakterii Agrobacterium rhizogenes

- posiada geny rol indukujące rozwój korzeni włośnikowych

• Wektory retrowirusowe – służą do wprowadzania DNA do komórek ssaków; podejmowano próby użycia ich w terapii genowej, ponieważ DNA retrowirusów integruje się z genomem.

14. Mechanizm genetycznej kolonizacji roślin przez Agrobacterium tumegaciens)

A. tumefaciens jest naturalnym patogenem wielu gatunków roślin dwuliściennych. Jest Gram-ujemną bakterią glebową odpowiedzialną za powstawanie tumorowatych narośli. W wyniku infekcji określony segment plazmidu Ti, oznaczany symbolem T-DNA (trensferred DNA), integruje się trwale z jądrowym DNA komórki gospodarza. Ekspresja genów zawartych w T-DNA prowadzi do nadprodukcji fitohormonów stymulujących podziały komórkowe. Nadmierne szybkie podziały komórkowe, za którymi nie nadążają procesy różnicowania komórek, rodzą z kolei tkankę typu nowotworowego („crown gall”).

Proces przenoszenia genów z Agrobacterium do komórek roślinnych obejmuje kilka podstawowych etapów: kolonizację bakterii na powierzchni uszkodzonej tkanki, aktywację genów wirulencji, utworzenie kompleksu T-DNA, przemieszczenie kompleksu do jądra komórki i integrację T-DNA z genomem biorcy. Transformacja za pomocą Agrobacterium jest efektem precyzyjnego współdziałania określonych genów plazmidu i genów jądrowych bakterii, w odpowiedzi na określone sygnały pochodzące z komórek roślinnych. Sygnałem do kolonizacji dla Agrobacterium są wydzielane przez zranioną roślinę związki fenolowe oraz cukry (gł. acetosyringon, alkohol koniferylowy, pochodne kwasu benzoesowego). Związki te stanowią czynniki chemotaktyczne kierujące Agrobacterium w okolicę zranionych komórek roślinnych, gdzie ulegają one adhezji. W procesie tym biorą udział zarówno bakteryjne jak i roślinne czynniki adhezyjne. Operony virA i virG ulegają stałej ekspresji na bardzo niskim poziomie i działają jako komponenty systemu odbioru i przekazywania sygnału. Czynniki chemotaktyczne są rozpoznawane przez dimeryczne, trans membranowe białko sensoryczne VirA zlokalizowane w błonie komórkowej Agrobacterium. Białko to ulega autofosforylacji, po czym grupa fosforanowa zostaje przeniesiona na drugi składnik kaskady sygnałowej białko VirG, które ulega aktywacji. Ufosforylowane białko VirG aktywuję transkrypcję pozostałych genów wirulencji plazmidu Ti. Operon virD koduje kilka różnych białek, z których białko VirD2 i VirD1 to endonukeazy, biorące udział w wycięciu T-DNA. Pierwsze nacięcie ma miejsce w rejonie RB pomiedzy 3 a 4 nukleotydem dolnej nici DNA. Drugie jest mniej specyficzne i zachodzi w dowolnym miejscu rejonu LB. Wycięcia dokonuje białko VirD2 wspomagane przez białko VirD1 i wzmacniacze VirC1 i VirC2 (VirC determinują także zakres gospodarzy). W miejscu nacięcia, do końca 5’ jednoniciowego DNA przyłączają się – za pośrednictwem tyrozyny – białka VirD2 i VirE2, tworząc kompleks T-DNA. Białka VirD2 i VirE2 zawierają jądrową sekwencję sygnalną – NLS. Kompleks T-DNA jest przenoszony przez kanał transferowy (pillus) utworzony z jedenastu białek VirB i białka VirD4. W transferze T-DNA biorą udział także białka roślinne takie jak importyna, która rozpoznaje sekwencję NLS białka VirD2. W procesie integracji T-DNA z genomem gospodarza biorą udział zarówno białka kompleksu T-DNA, jak i białka jądrowe rośliny. W początkowym etapie procesu dochodzi do syntezy komplementarnej nici DNA z udziałem mechanizmów naprawy DNA, a następnie do integracji na zasadzie rekombinacji nieuprawnionej (łączenia „końców” niehomologicznych). Integracja zachodzi głównie w tych regionach genomu biorcy, które są transkrypcyjnie aktywne, co sugeruje możliwość zaburzania ekspresji genów roślinnych.

Transformacja z udziałem Agrobacterium tumefaciens:

1. Zranienie rośliny- wydzielanie związków fenolowych i migracja bakterii

• Acetosyringon

• Pochodne kwasu benzoesowego

W naturze A.tumefaciens infekuje miejsca zranienia- są to wrota przez które bakterie dostają się do przestrzeni międzykomórkowych roślin. Chemotaktycznie działają substancje wydzielane przez rośliny w miejscach zranienia

1. Odbiór i przekazanie sygnału. Aktywność genów virA i vir G. Transmembranowe białko virA odbiera i przekazuje sygnał oraz aktywuje białko virG na drodze fosforylacji.

2. Aktywacja przez białko virG innych genów vir

3. Aktywacja endonukleaz. Operon virD koduje kilka białek w tym virD1 i virD2 które są endonukleazami uczestniczącymi w wycinaniu T-DNA

4. Wycięcie fragmentu T-DNA – nacięcie obejmuje 1 nić DNA. Rozpoczyna się od nacięcia prawej sekwencji granicznej (RB) przez białko virD2 miedzy 3 a 4 nukleotydem dolnej nici T-DNA.. Naciecie w rejonie LB zachodzi mniej precyzyjnie- w dowolnym miejscu sekwencji granicznej. W miejscu nacięcia do końca 5” przyłączają się białka virD2 i virE2 tworząc kompleks T-DNA.

5. Kompleks T-DNA zostaje przeniesiony poprzez strukturę pillusa zbudowanego z białek virB i virD4 do jądra kom roślinnej.

6. Integracja T-DNA z genomem gospodarza- udział białek kompleksu T i białek jądrowych rośliny

- synteza komplementarnej nici DNA z udziałem mechanizmów naprawy

- integracja na zasadzie „rekombinacji nieuprawnionej”

15. Uprawa roślin transgenicznych w Polsce i na świecie

Odmiany GM uprawia się od 20 lat

181,5mln ha ~ 10% całkowitej powierzchni upraw

28 państw z uprawami GM

18 mln rolników; 90% małe gospodarstwa w krajach rozwijających się ( Chiny i Indie)

13 państw na świecie przoduje w uprawie roślin GM (>50 000 ha). Wg danych na 2007 rok są to:

1. USA (soja, kukurydza, bawełna, rzepak, papaja, lucerna)- 73 MLN HA

2. Argentyna (soja, kukurydza, bawełna)- 24mln ha

3. Brazylia (soja, bawełna)- 42 mln ha- 42 mln ha

4. Kanada (rzepak, kukurydza, soja) – 12 mln ha

5. Indie (bawełna)

6. Chiny (bawełna, pomidor, topola, petunia, papaja, papryka)

7. Paragwaj (soja)

8. RPA (kukurydza, soja, bawełna)

9. Urugwaj (soja kukurydza)

10. Filipiny (kukurydza)

11. Australia (bawełna)

12. Hiszpania (kukurydza)

13. Meksyk (bawełna, soja)

Dlaczego uprawia się te modyfikowane uprawy?

- odporność na herbicydy

-odporność na szkodniki (owady)

Odporność:

• Na choroby

• Na szkodniki

• Tolerancja stresu abiotycznego

Uprawia się 4 gatunki. Uprawa soi dominuje. Polowa upraw genetycznie modyfikowanych to soja. Druga w kolejności to kukurydza, potem bawełna i rzepak. Oprócz tego jeszcze papaja, drzewa owocowe itp. Udział upraw GM w porównaniu do całego na świecie.98% upraw soi to genetycznie modyfikowana. 94 % upraw soi w USA jest genetycznie modyfikowana. W Bazyli wg starych danych 68% a teraz jest znacznie więcej. Niemodyfikowana soja jest droższa. W Polsce obowiązuje ustawa zakazująca sprowadzania genetycznie modyfikowanych pasz. Świat

75% uprawy soi na świecie – GM

95% śruty sojowej na świecie –GM
Indie- Największy coroczny procentowy przyrost upraw bawełny Bt na świecie

USA- burak cukrowy, soja
Konsekwencja przejścia z normalnej bawełny na GM: areał ten sam, a dwukrotnie większy plon

UE

• Hiszpania, Portugalia, Czechy, Słowacja, Rumunia 143 tysięcy ha kukurydzy Bt

• 90% upraw GM w EU znajduje się w Hiszpanii 132 tysięcy ha

• Hiszpania- kukurydza Bt- 32% stanowią odmiany GM

• Autoryzacja ziemniaka Fortuna wycofana z UE

  • Odporność na zarazę ziemniaka

90% upraw GM w UE jest zlokalizowanych w Hiszpanii, przepisy tam są przychylne do tego typu upraw. W UE można uprawiać tylko kukurydze( jeden rodzaj modyfikacji- kukurydza BT odporna na szkodniki).Przez 3 lata dopuszczony był też ziemniak GM.

16. Metody służące do wykrywania obecności transgenu u GMO

Potwierdzanie obecności transgenu u GMO jest najważniejszym elementem weryfikacji efektywności danej metody transformacji. Podstawowe postępowanie obejmuje kolejno:

1. Identyfikację obecności genów markerowych

Wyróżniamy selekcję:

• pozytywną – ekspresja genu selekcyjnego warunkuje przeżycie w określonych warunkach

• negatywną – ekspresja wywołuje efekt letalny (tworzenie GMO bez markera)

Przykładowe geny selekcyjne:

1. Warunkujące odporność na antybiotyki: npt II, hpt

2. -||- Odporność na herbicydy: bar, pat, aroA

3. -||- Zdolność do rozkładu toksycznych zw. chem.: DOG 1

4. -||- Stymulacja wzrostu i rozwoju in vitro: ipt

5. -||- Zdolność do przekształcania określonych węglowodanów: pmi

1. Wykrywanie obecności genu reporterowego

(PCR, Real-time PCR)

Geny reporterowe kodujące białka:

1. GFP – białko zielonej fluorescencji- fluorescencja pobudzana UV

2. GUS – koduje enzym β-glukuronidazę który rozkłada wiązanie β-glukuronidowe w substracie X-Gluc, rezultat = niebieskie zabarwienie

3. Gen luc – Lucyferaza- katalizuje zależne od ATP utlenianie lucyferyny z wydzieleniem światła

4. LacZ – koduje β-galaktozydazę, rozkłada substrat X-Gal, rezultat = niebieskie zabarwienie

1. Wykrywanie obecności genu w genomie:

• Southern Blot

• Mikromacierze

• Real-time PCR

1. Wykrywanie produkty genu czyli mRNA

• Nouthern Blot

1. Wykrywanie obecności białka:

• Western Blot

• Test Elisa

• Lateral Flow Strip (paski z przepływem bocznym)

Po dokonaniu samozapylenia otrzymanych osobników bada się następnie poziom ekspresji genu u osobników potomnych i stabilność przekazywania transgenu następnym pokoleniom.

17. Metody stosowane w analizie proteomu

Elektroforeza w warunkach natywnych PAGE: Białka są cząsteczkami obdarzonymi ładunkiem elektrycznym, więc poruszają się w polu elektrycznym. Białka rozdziela się w polu elektrycznym na podstawie ich wypadkowego ładunku ujemnego i masy cząsteczkowej. Im większy ładunek wypadkowy, tym szybciej się ona porusza. Cząsteczki o mniejszych rozmiarach także migrują szybciej. Żel działa jak sito molekularne (małe cz. Przechodzą swobodnie przez kanaliki, a duże są zatrzymywane) i tłumiąprady konwekcyjne (wytwarzane przez małe gradienty temp.). Żele poliakryloamidowe są używane jako nosnik bo sa chemicznie obojętne i łatwo je otrzymać przez polimeryzacje akryloamidu. W PAGE pH buforu znajdującego się w żelu oraz w górnym i dolnym zbiorniku wynosi 9.

Elektroforeza denaturująca SDS-PAGE: Umożliwia sprawdzanie stopnia czystości preparatu danego białka, jego masy cząsteczkowej i liczby polipeptydowych podjednostek. Rozdział białek jest oparty tylko na różnicach w masie cząsteczkowej, gdyż wszystkie maja ten sam ładunek ujemny. Działanie na białka czynnikiem denaturującym (ditiotreitol, β-merkaptenol) prowadzi do usunięcia wszystkich wiązań dwusiarczkowych; detergent anionowy SDS(dodecylosiarczan sodu) prowadzi do zerwania prawie wszystkich wiązań niekowalencyjnych i rozfałdowania łańcucha polipeptydowego. Zdenaturowane białko posiada wypadkowy ładunek ujemny, proporcjonalny do jego masy cząsteczkowej. Ruchliwość większości łańc. Polipept. Zależy liniowo od log ich masy. Jest to metoda popularna i szybka.

Izoogniskowanie (ogniskowanie izoelektryczne): To elektroforetyczny rozdział białek i metoda zagęszczania na podstawie względnej zawartości grup obdarzonych ładunkiem dodatnim lub ujemnym. Kiedy białko znajduje się w swoim punkcie pI (punkt izoelektryczny-wartość pH, przy której cząsteczka ma zerowy ładunek wypadkowy) dalszy ruch w polu elektr. Jest niemożliwy. W metodzie tej stosuje się żel poliakryloamidowy o dużym rozmiarze kanalików z dodatkiem mieszaniny poliamfolitów (małe polimery o dużej gęstości ładunku, które wykazują wiele wartości pI). W wyniku działania pola elektrycznego, poliamfolity migrują i tworzą gradient pH. Każde białko zatrzyma się w żelu w miejscu, którego pH odpowiada jego wartości pI. Amfolity migrują + - Białka migrują - +

Elektroforeza preparatywna: umożliwia izolacje z żelu tej części preparatu, która zamierzamy użyć do dalszych prac. Do tego stosuje się różne techniki elucji. W przypadku technik preparatywnych obszary żelu zawierające pożądany produkt wycina się i poddaje procesowi elucji. Stosowana jest jako etap oczyszczania białka w celu uzyskania go o możliwie najwyższej homogenności. E. preparatywna polega na przeprowadzeniu SDS PAGE, a następnie wycięciu z żelu odpowiedniego paska. Następnie przemywa się je odpowiednim buforem i poddaje homogenizacji. Otrzymaną zawiesinę rozcieńcza się w buforze i inkubuje w 4EC. Dalej zawiesinę poddaje się wirowaniu, a otrzymany supernatant jest ultrafiltrowany i wirowany. Dzięki temu można uzyskać pożądane białko.

Elektoforeza kapilarna CE: Umozliwia wykonanie dużej liczby oznaczeń w stosunkowo krótkim czasie, przy małych kosztach i minimalnym zużyciu odczynników. Jest to metoda o dużej selektywności, czułości i rozdzielczości. W elektroforezie następuje przemieszczenie się naładowanych cząsteczek lub ich grup pod wpływem pola elektr. w przewodzącym ciekłym medium, zwykle wodnym, umieszczonym w kapilarze. Separacja składników mieszanin zachodzi w kapilarze ze stopionej krzemionki, napełnionej roztworem buforu zwanego elektrolitem podstawowym. Kapilara z obu stron jest zanurzona w naczynkach zawierających ten sam bufor. W naczynku wlotowym znajduje się anoda, a w wylotowym – katoda. W końcowej części kapilary znajduje się detektor, a całość układu jest kontrolowana i sterowana za pomocą komputera. W kapilarach kwarcowych(ujemny ładunek ściany z grup silanowych) bufor porusza się od anody do katody, jest to przepływ elektroosmotyczny i zależy on od ładunków elektrycznych rozłożonych na ściankach kapilary. Ich ładunek i rodzaj są związane z jonizacja grup funkcyjnych na powierzchni ścianek lub adsorpcją na nich jonów buforu. Przy pH>3 gr. silanowe dysocjują na powierzchni ścianki i powstaje ład. Ujemny. Ładunki ujemne są częściowo zobojętniane kationami buforu – powstaje trwała warstwa Sterna, a pozostałe grupy tworza ruchoma warstwę z kationami znajdującymi się w pewnej odległości. W ten sposób tworzy się warstwa podwójna dyfuzyjna kationów. Porusza się ona od anody do katody tworząc przepływ elektroosmotyczny. Aniony poruszają się wolniej niż bufor, kationy szybciej.

Western blot: metoda służy do wizualizacji białek rozdzielonych metodą SDS PAGE lub 2DE. Metoda umożliwia wykrycie jednego lub więcej antygenów w mieszaninie. Próby białkowe sa przeniesione (odciśnięte) na materiał bardziej dostępny dla przeciwciał(dużych białek). Żel umieszcza się na arkuszu nitrocelulozy lub nylonu i poddaje działaniu pola elektrycznego – białka migrują do arkusza i tam zostają związane. Następnie blokuje się niespecyficzne miejsca wiązania białek poprzez inkubacje odcisku w obecności kazeiny, co zapobiega niespecyficznemu wiązaniu się cz. Przeciwciała. Kolejny etap – reakcja białek ze znakowanym przeciwciałem, usuwanie nadmiaru przeciwciała, uwalnianie i identyfikacja przeciwciał. Autoradiografia – metoda identyfikacji dla przeciwciał znakowanych radioizotopem. Uwidacznianie poprzez inkubacje z innym przeciwciałem: rozpoznaje ono przeciwciało pierwszorzędne. Przeciwciało drugorzędowe może być znakowane promirniotwórczo (autoradiografia) lub połączone z enzymem wytwarzającym barwny produkt.

Zymografia (barwienie enzymatyczne): jest to zaawansowana metoda elektroforetyczna, umożliwiającą wizualizację określonych aktywności enzymatycznych po rozdziale mieszanin białkowych w warunkach natywnych. Stanowi jedno z podstawowych narzędzi w proteomice funkcjonalnej, pozwalając na identyfikacje aktywności enzymów obecnych w ekstraktach proteomowych, ich analizę ilościową, jak również wstępną ocenę masy i ładunku tych enzymów. Ma ona olbrzymi potencjał badawczy ze względu na możliwość opracowania wielu wariantowych, konkretnych zestawów do barwienia enzymatycznego w oparciu o specyficzne reakcje katalizowane przez wybrane enzymy. Ze względu na możliwość zastosowania wielu różnorodnych syntetycznych donorów i/lub akceptorów elektronów, które w następstwie reakcji redoks dają barwne i nierozpuszczalne produkty, zymografia okazała się szczególnie przydatna w identyfikacji enzymów z grupy oksydoreduktaz. Ta gr. Enzymów jest z kolei kluczowa dla przebiegu istotnych reakcji metabolizmu komórkowego. Podstawowe elementy analizy zymograficznej:

- przygotowanie próby białkowej

- przeprowadzenie rozdiału elektroforetycznego w żelu poliakryloamidowym technika native-PAGE

- Barwienie enzymatyczne żeli za pomocą zestawu barwiącego, zawierającego mieszaninę odpowiednio dobranych substratów, kofaktorów oraz niezbędnych czynników i składników warunkujących aktywność wybranego enzymu (jony metali, obecność soli, optymalny odczyn)

Metodę tą stosuje się do identyfikacji innych enzymów pod warunkiem, że ubytek substratu lub barwienia produktu możan uwidocznić w postaci wyróżniających się z tła prążków.

Elektroforeza dwukierunkowa 2DE: To metoda rozdziału białek o bardzo dużej rozdzielczości. Pozwala to na rozdział dwóch białek o bardzo podobnej lub identycznej wartości pH, a także białek o zbliżonej lub identycznej masie cząsteczkowej. Metoda dostarcza informacje o ilościowej ekspresji białek. Pojedynczą próbkę poddaje się najpierw ogniskowaniu izoelektrycznemu. Pasek żelu, wzdłuż którego rozdzielono białko, wpolimeryzuje się poziomo w górną część żelu poliakryloamidowego z SDS. Uzyskuje się dwuwymiarowy układ plamek: w kierunku poziomym rozdział na podstawie pH i pionowym na podstawie masy cząsteczkowej. Kolejność wykonywania 2DE i analiza wyników:

1. Eksperyment elektroforetyczny: pobranie i przygotowanie próbki, eksperyment w pierwszym wymiarze (izoogniskowanie); eksperyment w drugim wymiarze (SDS PAGE)

2. Wizualizacja wyników eksperymenty za pomocą wprowadzonych do żelu barwników (Coomassie brilliant blue-CBB, pochodne srebra, Spyro Ruby)

3. Zapis obrazu żelu za pomocą skanera lub kamery w postaci cyfrowej

4. Analiza obrazów zakończona wygenerowaniem profili ekspresji protein

5. Analiza profili ekspresji poszczególnych protein

6. Wycięcie odpowiednich białek z żelu i ich wytrawienie

7. Dalsza analiza wybranych protein przy pomocy innych technik proteomicznych.

Analiza obrazu żeli 2DE: akwizycja danych obróbka obrazu detekcja i ocena ilościowa plamek analizy porównawcze żeli opracowanie danych prezentacja i interpretacja wyników tworzenie map 2D oraz konstrukcja baz danych.

Trawienie w żelu (in-gel digestion) - 2DE wycięcie plamkiodbarwienietrawienie(typsyna, chymotrypsyna, SASP)płukanie MS

Spektrometria masowa MS: Technika ta pozwala na poznanie sekwencji aminokwasowej peptydu, a także modyfikacji potranslacyjnych. Wykorzystuje ona bombardowanie rozpędzonymi atomami – technika jonizacyjna. Ta technika jonizacyjna w połączeniu z tandemowym spektrofotometrem masowym pozwala na ustalenie sekw. polipeptydów zawierających ok. 25 reszt. Sekw. polipeptydu wyznacza się na podstawie masz cząsteczkowych różnych fragmentów powstających w wyniku jonizacji. Umożliwia zsekwencjonowanie kilku polipeptydów znajdujących się w mieszaninie, bez konieczności całkowitego oczyszczania każdego z nich przed przystąpieniem do analizy; umozliwia wyznaczanie sekw. polipeptydów z zablokowanym końcem N; możliwe jest także scharakteryzowanie modyfikacji potranslacyjnych: glikozylacji i fosforylacji. Próbkę białka w kwaśnym, lotnym rozpuszczalniku rozpyla się w spektrofotometrze masowym. Otaczający poszczególne małe kropelki rozpuszczalnik zostaje odparowany w odpowiedniej komorze próżniowej, pozostawiając nieuszkodzone, odsłonięte cząsteczki białka, obdarzone licznymi ładunkami dodatnimi. Te naładowane cz. białka uzyskują w polu elektrycznym przyspieszenie, a następnie, pod wpływem pola magnetycznego, ulegają odchyleniu. Rozdzielenie zachodzi zależnie od wielkości m/z – stosunku masy cząsteczkowej do ładunku. Widmo masowe czystego białka stanowi wykres z szeregiem wierzchołków odpowiadających różnej ilości związanych protonów. Na podstawie takiego widma można wyznaczyć masę cząst. białka. MS określając masę cząsteczkową analitu pozwala na jednoznaczną identyfikacje każdego składnika mieszaniny.

Metody jonizacji próbek:

• MALDI – metoda laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą. Stosowana do analizy peptydów całych białek, kontroli jakościowej wielu typów próbek, identyfikacji białek za pomocą metody odcisku palca, analizy modyfikacji potranslacyjnych. Próbkę przed pomiarem miesza się z drobnocząsteczkowym związkiem – matrycą. Jonizuje ona pozostałe cząsteczki, które w przeciwieństwie do niej nie mogą absorbować promieniowania lasera. jonizacja zachodzi w sposób pośredni. po uruchomieniu laseru, wiązka światła trafia na miejsce nałożenia mieszaniny matrycy oraz próbki. matryca absorbuje promieniowanie lasera, ulegając jonizacji, jednocześnie jonizując cząsteczki próbki; pojawiające się oddziaływania kolumbowskie między jonami są tak silne, iż wywołują desorpcję cząsteczek z powierzchni płytki. W wyniku zderzeń cząsteczek próbki z fotowzburzona matrycą, w chmurze zdesorbowanych cząstek postępuje dalsza jonizacja jej cząsteczek.. po kilku nanosek. od uderzenia lasera, w źródle jonów zostaje włączony potencjał przyspieszający, który kieruje zdesorbowane jony do analizatora. W wyniku jonizacji w źródle typu MALDI najczęściej obserwuje się sygnały pochodzące od jonów [M+H]⁺ lub [M+H]^-. Pomiar masy polega zatem na dodaniu lub odjęciu od zmierzonej wartości masy protonu.

• ESI– elektrorozpylanie; to jedno z podstawowych źródeł jonów, służących do jonizacji cząsteczek, makrocz. oraz kompleksów niekowalencyjnych. Stosowana jest do analizy cząst. o stosunkowo dyżej masie, głównie próbek biologicznych; umozliwia obserwację intensywnych jonów pseudomolekularnych. Możliwe jest również przeprowadzenie fragmentacji jonów: w źródle jonów ISD i w analizatorze spektrometru ESI-MS. W ESI analizie podlegają substancje znajdujące się w roztworach, nie wymaga się stosowania obniżonego ciśnienie, odparowania rozpuszczalnika itp. Cząsteczki są jonizowane wielokrotnym ładunkiem. jest to b. łagodna metoda jonizacji przeprowadzana pod ciśnieniem atm. Do pierwszej kapilary wprowadza się analizowana ciecz. Przy wylocie jest dodatkowy strumień gazu, który sprzyja rozerwaniu ciągłego strumienia cieczy opuszczającego kapilarę i rozpyleniu go w chmurę drobnych kropelek. Trafiają one w obszar pola elektrycznego o dużej różnicy potencjałów znajdującej się pomiędzy kapilarami. podczas przelotu kropelek dochodzi także do odparomania rozpuszczalnika z ich powierzchni. Druga kapilara ma na celu zebranie areozolu powstającego w komorze jonizacyjnej i przekazaniu go do analizatora i detektora , zachodzi tam także całkowite wyschnięcie kropelek i uwolnienie „suchych jonów”. Ponieważ ma ona niewielką średnicę, obniża to ciśnienie do poziomu panującego w MS. Źródło jonów typu ESI może działać w trybie jonizacji dodatniej lub ujemnej.

• nanoESI – w metodzie tej kapilary doprowadzające roztwór maja o wiele mniejsze średnice. Zwiększa to efektywność jonizacji i czułość analiz. Na jedną kropelke areozolu przypada mniejsza ilość cząst. analitu.

• EI – jonizacja elektronami; elektrony emitowane przez żarzona katodę są kierowane przez odpowiednie napięcie w poprzek komory jonizacyjnej.

• CI – jonizacja chemiczna; jonizacja substancji następuje na skutek zderzeń z tzw. jonami pierwotnymi występującymi w źródle jonów. Stosuje się jony pierwotne powstałe w wyniku bombardowania elektronami molekuł danego gazu „niereagującego.”

• FAB – bombardowanie szybkimi atomami

• TE – termorozpylanie

• ICP – plazma wzbudzona indukcyjnie

• LD – desorpcja laserowa

• SIMS – bombardowanie jonami; spektrometria mas jonów wtórnych

Analizatory masowe:

• Kwadrupolowy (Q) – działa jako filtr masy; w ustalonych warunkach pracy przepuszcza tylko jony o określonym zakresie stosunku masy do ładunku elektr. Analizator zbudowany jest z 4 symetrycznie ułożonych równoległych prętów, najlepiej o przekroju hiperbolicznym. Przeciwległe pręty sa ze sobą połączone elektrycznie, do dwóch sąsiednich prętów kwadrupola przyłożone jest napięcie, które jest suma napięcia stałego i zmiennego. w tak utworzonym polu elektromagnetycznym tylko jony o odpowiednim stosunku m/z poruszają się w centralnej jego części, pozostałe ulegaja rozproszeniu i nie przechodzą przez analizator. poprzez zmianę napięcia stałego lub zmiennego, a także częstotliwości napięcia przyłączonego do prętów można ustawić analizator tak,, aby przepuszczał jony o określonym stosunku m/z i z określoną dokładnością. Kwadrupol można ustawić tak, aby przepuszczał jony o szerokim zakresie m/z. W takim trybie transportuje on jony do kolejnych przedziałów spektrometru(np. tandemowego). Pomiar masy jest przeprowadzany przez skanowanie: systematyczne zmienianie m/z jonów przepuszczonych przez kwadrupol. Za Q musi znajdować się detektor jonów, którym najczęściej jest powielacz elektr. Wewn. analizatora panuje próżnia.

• Pułapka jonowa (IT) – to analizator pozwalający na przetrzymywanie jonów. Działa on na zasadzie podobnej do Q. manipulując parametrami prądu przyłożonego do elektrod, można uwięzić w pułapce jony o określonym m/z. Pomiaru masy dokonuje się poprzez uwięzienie w IT jonów o szerokim zakresie m/z i wyrzucaniu z pułapki kolejnych grup jonów o określonym stosunku m/z. Wnętrze pułapki jonowej wypełnione jest gazem obojętnym – helem pod ciśnieniem rzędu 0,1 Pa. Jeżeli jony w pułapce zostaną przyspieszone (wzbudzone), zderzenia z at. helu spowodują fragmentację jonów. To metoda o małej rozdzielczości, ale dużej czułości.

• Analizator czasu przelotu (TOF) – jony wprowadzone do analizatora sa przyspieszane przy pomocy impulsu elektr. i zaczynają dryfować przez komorę analizatora. na końcu analizatora znajduje się detektor jonów połączony z urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przspieszającego do momentu uderzenia określonego jonu w detektor. Pomiar m/z jest ooparty na fakcie , że czas przelotu zależy od prędkości jonu, a prędkośc uzyskana przez jon w polu elektrycznym zależy od jego masy. Analizatory TOF charakteryzują się stosunkowo dużymi rozdzielczościami oraz dosyć dużą czułoscią. jest to pusta w środku tuba ze źródłem jonów z jednej strony oraz z detektorem z drugiej strony. działanie TOF opiera się na założeniu, że wszystkie jony o tej samej krotności jonizacji, które ulegaja przyspieszeniu w polu elektr. maja taka samą energ. kinetyczną. Wredy prdkoś jonu jest odwrotnie proporcjonalna do jego masz. Jonz o maej masie poruszaja się szybko, a jony cięższe wolniej. Mierzac czas przelotu tych jonów można określić ich m/z. jony mogą mieć nadmiar energii, który prowadzi do ich fragmentacji.

Tandemowa spektrometria mas: pozwala na określenie struktury danego związku. Strukturę identyfikuje się na podstawie jonów fragmentacyjnych, które sa charakterystyczne dla danego związku lub grupy związków. Fragmentacyjne widma masowe mogą dostarczyć wielu informacji o budowie badanego związku, a także o sekwencji białka. Metoda MS/MS polega na tym, iż z widma masowego selekcjonuje się dany jon (najczęściej jon molekularny). Jon ten poddawany jest kolizjom (zderza się z wprowadzonym gazem obojętnym). na skutek zderzeń jon macierzysty rozpada się na jony fragmentacyjne.

Źródło jonów (wszystkie jony)pierwszy analizator(jon o wybranym m/z)komora kolizyjna(fragm.. jonu macierzystego)drugi analizator rejestracja

Sekwencjonowanie de novo – ‘de novo’ oznacza, ze w czasie sekwencjonowania nie używa się bazy danych sekwencji, a jedynie „surowe” dane pochodzące z widm MS/MS. technika ta polega na otrzymaniu w pierwszej fazie widma fragmentacyjnego dobrej jakości, a następnie na jego późniejszej manualnej analizie polegającej na przypisaniu sygnałom na widmie fragmentacyjnym odpowiedniej sekwencji. Problemem jest rozróżnianie aminokwasów o takiej samej lub zbliżonej masie. należy wtedy stosować MS o wysokiej rozdzielczości. najpierw należy odnaleźć piki zawierające informacje o sekwencji i odrzucenie pików bez tej informacji. Odnalezienie kilku jonów tej samej serii skutkuje utworzeniem ścieżki fragmentacji pomaga ona odkryć część sekwencji bez ustalenia z jakiego końca pochodzi (N czy C). Zakres małych bądź dużych mas umożliwia wyodrębnienie i identyfikację przynajmniej jednego z końców peptydu. dalsze postępowanie powinno się opierać na poszukiwaniu ścieżki fragmentacyjnej zawierającej ten fragment.

Podstawa sekwencjonowania de novo jest wyszukiwanie na widmie masowym różnic pomiędzy pikami, odpowiadających masom reszt aminokwasowych. jeśli uda się odnaleźć ciąg pików, pomiędzy którymi róznice odpowiadają idealnie masom tych reszt, można wstępnie założyć, że został odnaleziony fragment sekwencji.

Metody chromatograficzne – frakcjonowanie białek

Poniższe metody umożliwiają rozdział i analizę białek pod względem ich właściwości.

Filtracja na żelu (chromatografia na sitach molekularnych) – Rozdział cząsteczek na podstawie ich wielkości i kształtu. roztwór z białkiem umieszcza się na kolumnę wypełniona porowatymi ziarnami. Wykonane są z nierozpuszczalnego, wysoce uwodnionego polimeru. małe cząsteczki wchodzą do kanalików w ziarnach, znajdują się w płynie o większej objętości. Cząsteczki większe lub o wydłużonych kształtach nie wchodzą do ziaren. Przemieszczają się przez kolumnę szybciej i ulegają elucji jako pierwsze. Metoda służy do odsolenia białka i wyznaczania masy cząst.

Chromatografia jonowymienna –rozdział białek na podstawie ich wypadkowego (całkowitego) ładunku. Jeśli w pH=7 ładunek białka jest ujemny, to wiąże się z kolumna wypełnioną ziarnami z ładunkiem dodatnim; białko o ładunku dodatnim lub bez ładunku nie może się wiązać – chromatografia wymieniająca aniony. Chrom. wymieniająca kationy działa w odwrotny sposób. Białko związane z kolumna można z niej wymyć poprzez przepłukanie roztworem NaCl o wzrastającym stężeniu (gradiencie) i odpowiednim pH. Jony Cl^- zastępują białko przy ziarnach; białka o małej gęstości ładunku ujemnego wypływają jako pierwsze.

Chromatografia anionowymienna – kolumny mają gr. dietyloaminoetylowe o ład. dodatnim. Białka można wymywać poprzez zmniejszanie pH. Chrom. kationowymienna – kolumny zawierają gr. karboksymetylowe (ujemne). Zwiększając pH zmienia się ładunek wypadkowy białka i wymywa je z kolumny.

Chromatografia powinowactwa – wykorzystuje specyficzne, niekowalencyjne i wykazujące duże powinowactwo wiązania się białka z ligandem. Mieszaninę białek przepuszcza się przez kolumnę z unieruchomionym (związanym kowalencyjnie z obojętnym i porowatym nośnikiem) ligandem. Jako ligandu można użyć inhibitora (enzym), przeciwciała (antygen), hormon (wykrywa receptor). Białko wiąże się z ligandem, a pozostałe przechodzą przez kolumnę> niespecyficznie związane białka usuwa się poprzez przemywanie buforem. Białko związane z ligandem można uwolnić z kolumn poprzez zmianę właściwości buforu (zmiana pH lub stęż. soli). Można także przemyć kolumnę roztw. z ligandem w wolnej postaci, który silniej wiąże białka związane z pierwszym ligandem. Po elucji białka ligand ten musi zostać usunięty z cz. białka np. poprzez dializę.

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych – w przebiegu tej chromatografii białko wiąże się z materiałem hydrofobowym. Metoda ta wykorzystuje obecność obszarów hydrofobowych i hydrofilowych co umożliwia rozdział białek ze względu na ich odmienne właściwości hydrofobowe. Białka oddziałują z silnie hydrofobowymi grupami ligandów, które sa trwale przymocowane na powierzchni nośnika pozbawionego ładunku elektrycznego. Przebiega ona w środowisku wodnym, a eksponowanie regionów hydrofobowych następuje pod wpływem dużych stężeń soli. W celu związania białka do nośnika stosuje się bufory o wysokiej sile jonowej środowiska (np. 1,5M siarczan amonu). Uwalnianie białek następuje przez ich wymywanie buforem o zmniejszającym się gradiencie soli. Innym sposobem elucji jest zwiększane pH roztworu, bądź dodatek komponentów wykazujących silne powinowactwo do ligandu lub zwiększające hydrofilność białek. Wiele czynników ma wpływ na zachowanie się cząsteczek białkowych w kontakcie z hydrofobowym adsorbentem: skład solwentów, temperatura, stęż. jonów wodorowych, rodzaj i stęż. soli, rodzaj nośnika, typ liganda oraz jego gęstość na powierzchni nośnika.

Chromatografia cieczowa – zasada działania polega na rozdzieleniu składników próbki na złożu (fazie stacjonarnej) z udziałem ciekłego medium np. rozpuszczalnik. Złoże należy dobrać w ten sposób, by składniki próbki oddziaływały z nim z różnym powinowactwem. Wymycie składników ze złoża odbywa się z udziałem fazy ruchomej w ten sposób, że składniki słabo oddziałujące z fazą stacjonarna eluowane są szybciej niż składniki oddziałujące mocniej. Istnieje kilka odmian chrom. cieczowej: kolumnowa, cienkowarstwowa, wysokosprawna i ultrawysokosprawna.

Średniociśnieniowa chromatografia cieczowa – metoda ta wymach rozpuszczalników, które denaturują białka. Wykorzystywana do rozdziału pochodnych DNA, nukleotydów, białek, peptydów, biopolimerów. Stosuje się niższe ciśnienie (3-4MPa), dzięki czemu jest mniej przecieków, ale czas separacji cząsteczek jest dłuższy.

Chromatografia cienkowarstwowa – technikę tą często łączy się ze źródłem jonów typu MALDI. W tej metodzie stosuje się płytkę odpowiednio przygotowaną, którą następnie wprowadza się do źródła jonów. Widma masowe otrzymuje się bezpośrednio z materiału rozdzielanego na płytce. Złoże np. żel krzemionkowy, jest nałożone na płytkę szklaną lub plastikową w postaci cienkiej, sprasowanej formy. Rozdział następuje poprzez powolne wnikanie roztworu w złoże.

Wysokosprawna (wysokociśnieniowa) chromatografia cieczowa - stosuje się podłoże w postacie ziaren (faza stała). Im mniejsza jest średnica ziaren, tym większa jest powierzchnia oddziaływania ze składnikami mieszaniny i tym więcej półek teoretycznych znajduje się w jednostce długości kolumny. Zmniejszenie średnicy ziaren powoduje jednak wzrost ciśnienia hydrostatycznego niezbędnego do „przepchnięcia” eluenta wraz próbka przez kolumnę chromatograficzną. Zmniejszenie granulacji zmniejsza długość półki teoretycznej, a liczba tych półek jest coraz mniej zależna od prędkości przepływu eluenta. W praktyce zwiększenie liczby półek teoretycznych powoduje dokładniejsze rozdzielanie składników mieszaniny na kolumnie chromatograficznej. Ciśnienie 10 – 50MPa; jest ono proporcjonalne do wysokości złoża i do wymuszonej szybkości przepływu.

Peptide mass fingerpriting – najprostrzy sposób identyfikacji białek z wykorzystaniem MS Każde białko ma unikatowa sekw. aminokw., więc metoda PMF wykorzystuje charakterystyczne cechy danej sekwencji. Dane białko strawione wysoce specyficznym enzymem ma charakterystyczny zestaw peptydów. Peptydy te stanowią tzw. „mapę peptydową” , która jest charakterystycznym śladem „odciskiem palca” pozwalającym zidentyfikować białko. PMS składa się z 2 etapów: 1- trawienie proteolityczne białka i pomiar mas powstałych peptydów; 2- część obliczeniowa: komputer porównuje otrzymany zestaw peptydów z wynikami trawienia teoretycznego wszystkich znanych sekwencji białkowych w bazie danych. Z bazy wybiera się sekwencję, która jest najlepiej dopasowana do badanej mapy peptydowej. Metoda stosowana jest do analizy pojedynczych białek.

Dyfrakcja promieniowana X (krystalografia rentgenowska) - technika ta umożliwia ustalenie przestrzennego położenia atomów w cząst. białka. Materiałem wyjściowym sa kryształy białka. Do pomiarów rentgenograficznych potrzebne sa trzy podstawowe elementy: źródło promieni rentgenowskich, kryształ białka i detektor. Rozpędzony strumień elektronów uderzający w miedzianą anodę wytwarza wiązke promieni X o dł. fali 0,154nm; część promieni pada na kryształ białka, część przechodzi przez kryształ bez zmiany kierunku, a pozostałe rozpraszają się w różnych kierunkach. Promienie ulegające dyfrakcji można rejestrować używając filmu rentgenowskiego – zaczernienie emulsji jest proporcjonalne do natężenia rozproszonej wiązki promieni X. Elektrony powodują rozproszenie promieni X. Amplituda fali rozproszonej przez dany atom jest proporcjonalna do liczby jego elektronów. Fale rozproszone nakładają się. Każdy atom bierze udział w rozpraszaniu promieni. Sposób nakładania się fal rozproszonych zależy wyłącznie od rozkładu przestrzennego atomów. Kryształ jest umieszczany na kapilarze w odpowiedniej pozycji wzdlęgem promieni X i filmu rentgenowskiego.. Kryształ wprowadzony w ruch precesyjny powoduje pojawienie się na filmie regularnych plamek – refleksów. W wyniku pomiary natężenia plamek otrzymuje się podstawowe dane eksperymentalne; na ich podstawie rekonstruuje się obraz białka. Stosuje się do tego matematyczną zależność – przekształcenie Fouriera. W ten sposób uzyskuje się dla każdej plamki fale gęstości elektronowej o amplitudzie proporcjonalnej do pierwiastka z natężenia obserwowanej plamki. Następnie obliczeniami wyznacza się gęstość elektronów dużej liczby punktów regularnie rozmieszczonych w krysztale. Potem te trójwymiarowe mapy elektronowe można interpretować.

Dichroizm kołowy - to wyraz aktywności optycznej białka. Białka są aktywne optycznie bo sa asymetryczne; ich odbicia lustrzane nie pokrywają się. Istnieją dwa rodzaje asymetrii: konfiguracyjna i konformacyjna. Aktywność optyczna jest pochodną pasm absorpcji asymetrycznych składników. Współczynniki absorpcji dla światła spolaryzowanego kołowo prawo- i lewoskrętnie różnią się jeżeli elektrony uczestniczące w przejściu do stanu wzbudzonego znajdują się w środowisku asymetrycznym. Tak wyrażona aktywność optyczna to dichroizm kołowy (CD). Do pomiarów CD wymagana jest czuła apatarura. Widmo CD białka w obszarze dalekiego nadfioletu dostarcza dokładnych danych o konformacji głównego łańcucha polipeptydowego. Do pomiarów CD wykorzystuje się zakres UV 170-240 nm, ponieważ w tym zakresie gr. amidowe peptydów mają liczne, nakładające się pasma adsorpcji.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego(NMR) - technika ta umożliwia poznanie atomowej struktury makrocząsteczek w roztworze. Niektóre jądra atomowe wykazują właściwy sobie magnetyzm. każda wirująca cząsteczka wytwarza moment magnetyczny, Po przyłożeniu zewnętrznego pola magnetycznego moment ten może przyjąć orientację alfa (niższy energetycznie) lub beta. Różnica energii tych dwóch stanów jest proporcjonalna do siły przyłożonego pola magnetycznego. Przejście stanu energ. alfa do wyższego beta zachodzi gdy jądra absorbują promieniowanie elektromagnetyczne o odpowiedniej częstotliwości. Jądro znajdujące się w różnych środowiskach pochłania energię z nieznacznie różniącą się częstotliwością rezonansową.

Metody CD i NMR służą do modelowania struktury białek i ich dynamiki.

Metody spektroskopowe w badaniach białek:

• absorpcyjna

• emisyjna

• Ramana

• elektronowa

• oscylacyjna

• rotacujna

• EPR

(elektronnowy rezonans paramagnetyczny)

• NMR

• radiospektroskopia

• sp. mikrofalowa

• sp. podczerwieni

• UV-VIS

Techniki immunodetekcji białek – przeciwciała (immunoglobina) to białko syntetyzowane w odpowiedzi na obecność antygeny – substancji obcej. Przeciwciała mają powinowactwo do antygenu. grupa rozpoznana przez przeciwciało nazywa się determinanta antygenową (lub epitopem). Białka blisko spokrewnione można rozróżnić za pomocą przeciwciał; można je stosować jako nadzwyczaj specyficzny odczynnik analityczny do oznaczeń ilościowych białka lub antygenu.

• ELISA - test immunoenzymatyczny do wykrywania i określania ilości specyficznego białka antygenowego. Stosuje się studzienki plastikowe, gdzie przeciwciało sprzęga się z plastikiem. Badane próby daje się do studzienek, gdzie antygen jest rozpoznawany przez przeciwciało. Płytki przepłukuje się i stosuje drugie przeciwciało, które rozpoznaje inny epitop tego samego antygenu. przeciwciało jest znakowane enzymem, który powoduje fluorescencję lub zmianę barwy.

• Western blotting – (dokładnie opisane wcześniej). otrzymany odcisk poddaje się reakcji ze znakowanym przeciwciałem. nadmiar mieszaniny się usuwa, a prążki białka związane z przeciwciałem uwidacznia i identyfikuje. Uwidocznić można w ten sam sposów jak w ELISA lub używając radioizotopu.

• chromatografia immunopowinowactwa – w technice tej przeciwciało swoiste względem białkowego antygenu jest łączone z obojętnym chemicznie nośnikiem upakowanym w kolumnie. Białkowy antygen wiąże się z kolumną, a pozostałe cząsteczki przechodzą przez kolumnę. Antygen wypłukuje się z kolumny w oczyszczonej formie.

Ultrawirowanie - to metoda wyznaczania wielkości, kształtu i stopnia agregacji protein. Pierwszym etapem jest wirowanie w gradiencie gęstości, gdzie białka rozdzielają się zależnie od ich współczynnika sedymentacji. Masę cząsteczki można wyznaczyć bezpośrednio technika sedymentacji równowagowej. Preparat białka wiruje się przy małych obrotach, tak aby sedymentacja została zrównoważona przez dyfuzję. Wtedy tworzy się łagodny gradient stężenia białka. Zależność stężenia od odległości od osi rotacji wyznacza masę cząsteczki.

Źródła: „krótkie wykłady z mikrobiologii”, „biochemia” Styer i „proteomika i metabolomika” silberring.

18. Czynniki stresowe oraz mechanizmy obronne roślin

Stres - odpowiedź organizmu (stan) na czynnik stresowy (stresor)

Czynniki stresowe dzieli się na abiotyczne i biotyczne

ABIOTYCZNE: promieniowanie (niedobór lub nadmiar), temperatura (wysoka, mróz), woda (susza glebowa, zalanie), gazy

BIOTYCZNE: inne rośliny (duże zagęszczenie, allelopatia, pasożytnicze), mikroby (wirusy, bakterie grzyby), zwierzęta (żer, przygryzanie, deptanie, pasożytnictwo), antropogeniczne (zanieczyszczenia przemysłowe chemiczne, herbicydy, metale ciężkie etc.).

Odbiór bodźców stresowych zachodzi przez błony (lipidy, białka). W błonach i cytozolu zachodzą perturbacje:

• poniżej progu tolerancji – powoduje to aktywację pomp (H+, ATPazy), regenerację stosunków wodnych i bilansu jonowego. Dzięki temu możliwa jest regeneracja całej komórki

• powyżej progu tolerancji – prowadzi to do inhibicji pomp i degradacji lipidów i białek, inaktywacji enzymów. Wynikiem tego jest wzrost przepuszczalności błon, przez co zwiększa się wyciek jonów. konsekwencja tego jest wyciek jonów.

Reakcja roślin na stres jest jednorodna. polega na przeprowadzaniu podobnych mechanizmów w sytuacji działania czynnika stresowego; synteza podobnych substancji.

- synteza specyficznych białek stresowych oraz proliny

- synteza enzymów i związków o charakterze antywolnorodnikowym (katalazy, dysmutazy)

- akumulacja kwasu abscysynowego i jasmonowego, wydzielanie etylenu.

Reakcje roślin (mechanizmy obronne):

stres wodny

Wskaźniki stresu suszy:
- Potencjał wody w roślinie
- Względna zawartość wody w roślinie (RWC) – stosunek obecnej do turgorowej, wyrażany w proc.

stres łagodny (RWC 8-10%): zahamowanie wzrostu komórek, grubienie ściany komórkowej (syntaza celulozy), hamowanie aktywności reduktazy azotanowej, hamowanie syntezy białek, zwiększenie zawartości ABA i kwasu jasmonowego, spadek zawartości cytokinin, zamykanie aparatów szparkowych

umiarkowany(więdnięcie przejściowe) RWC o 10-20%: depresja fotosyntezy (zamknięcie aparatów szparkowych i zahamowanie aktywności RuBisCO, i reduktazy azotanowej), zaburzenia oddychania, akumulacja proliny, cukrów

duży (więdnięcie trwałe i nieodwracalne) RWP ponad 20%: uszkodzenie struktur komórkowych, hamowanie krążenia protoplazmy
Niski potencjał osm – duże stężenie jonów, cukrów i pochodnych, drobnocząsteczkowych związków N: prolin, betain, poliamin.

Potencjał wody = potencjał osmotyczny + ciśnieniowy + matrycowy
Podstawowym warunkiem odporności na stres suszy jest sprawna osmoregulacja

chłód i mróz (0 – 10EC): zmiana funkcjonalności błon cytoplazmatycznych wzrost przepuszczalności, wyciek jonów i innych substancji, uszkodzenie PS II, wzrost fluorescencji chlorofilu, zaburzenia w transporcie asymilatów, utrata turgoru, więdnięcie liści

zasolenie

- unikanie stresu poprzez akumulację soli w wakuoli, osmoregulację, rozcieńczanie, wydzielanie

- tolerowanie zasolenia: synteza białek stresu solnego, substancji ochronnych

metale ciężkie: blokują grupy funkcyjne białek, powodują stres oksydacyjny, uszkodzenie struktur komórkowych, hamowanie fotosyntezy i oddychania, a także wzrostu, przyspieszenie starzenia.

Rodzaje odporności roślin

O odporności roślin na stres decydują:

- możliwości dostosowawcze - adaptacja i aklimatyzacja (adaptacja jest trwałym skutkiem zachodzącym w genach poprzez mutację, przyczyną zróżnicowania roślin metabolicznie i morfologicznie. Aklimatyzacja to modyfikacja struktury i funkcji organizmu o charakterze nietrwałym, nieprzekazywanym potomstwu.)

- faza rozwojowa roślin, aktywność fizjologiczna rośliny (organ). Mechanizmy obronne najłatwiej uruchamiane są u roślin młodych.

W reakcji na stres wyróżnia się 3 fazy:

faza alarmu – reakcja i restytucja

faza odporności – hartowanie i dostosowanie

faza wyczerpania – uszkodzenia chroniczne i śmierć

Odporność może być biologiczna (przetrwanie), populacyjna (wiąże się z grupą osobników – dotyczy grupy, szczególnie ważne w zakresie rozważań ekologicznych) lub rolnicza (dana odmiana czy gatunek zachowuje odpowiednie cechy – jest wysokoplonująca – w warunkach różnych stresorów)

Sekwencja zjawisk indukowanych niekorzystnymi czynnikami środowiska:

Błony są pierwszą strukturą odbierającą stres. Odbiorcą są błony (lipidy, białka) -> perturbacje w błonach i cytozolu, które możemy podzielić na poniżej i powyżej progu tolerancji.

Poniżej progu: aktywowane są pompy H+ ATPazy, dochodzi do regeneracji stosunków wodnych i bilansu jonowego oraz regeneracji całej komórki.
Powyżej progu: inhibicja pomp oraz degradacja lipidów i białek, inaktywacja enzymów wzrost przepuszczalności błon, zwiększony wyciek jonów, wreszcie uszkodzenia i śmierć komórek.
Różne czynniki stresowe powodują w roślinach zaburzenia w gospodarce wodnej (stres wodny), powstawanie wolnych rodników (stres oksydacyjny), zmiany hormonalne.

Reaktywne formy tlenu:
Peroksydacja lipidów, hamowanie fotosyntezy, uszkodzenie kwasów nukleinowych, rozkład polisacharydów