Biotechnologia roślin Magdalena Wróbel – Kwiatkowska

WYKŁAD I

Crick i Watson w 1953 odkryli strukturę DNA.
DNA ma postać heliksu (inaczej "podwójnej helisy"). Zbudowane jest z deoksyrybonukleotydów. W skład
pojedynczego deoksyrybonukletydu wchodzą: - zasada azotowa: adenina lub guanina (dwupierścieniowa
puryna), cytozyna lub tymina (jednopierścieniowa pirymidyna) - 2-deoksyryboza (pentoza), - reszta
fosforanowa. Zasada azotowa połączona jest z pierścieniem pentozowym cukru wiązaniem N-
glikozydowym. Natomiast deoksyrybonukletydy połączone są ze sobą wiązaniami fosfodiestrowymi.
Wiązanie te występuje pomiędzy atomem 5’ węgla w reszcie cukrowej jednego deoksyrybonukleotydu, a
atomem 3’ reszty cukrowej drugiego.

Biotechnologia – jest nauką zajmującą się otrzymywaniem produktów przy pomocy mikroorganizmów,
wirusów, komórek zwierzęcych i roślinnych. Umożliwia przemysłowe wykorzystanie żywych organizmów
lub ich części. Stanowi połączenie nauk biologicznych, inżynieryjnych i rolniczych.
Inżynieria genetyczna – jest działaniem biologii molekularnej, który zajmuje się modyfikacją informacji
genetycznej poprzez przenoszenie poszczególnych genów między organizmami za pomocą metod
laboratoryjnych.
Biotechnologia pomaga w:
• pozyskiwaniu dodatków i czynników wspomagających produkcję żywności (zamiast dodatków
chemicznych)
• obniżaniu kosztów przetwórstwa
• dostarczaniu szybkich i tanich metod analitycznych zarówno w medycynie jak i procesach
przemysłowych, czy w ochronie środowiska
• przedłużaniu trwałości produktów
• obniżaniu kosztów obróbki odpadów np. przez stosowanie biodegradowalnych materiałów do pakowania
produktów
• otrzymywaniu cennych terapeutyków np. hormonów
• i wielu innych dziedzinach np. ochrona środowiska, biodegradacja, nowych metodach leczniczych, itp.

GMO – Geneticaly Modified Organisms
Wg. Ustawy z 22 czerwca 2001 r. o organizmach genetycznie zmodyfikowanych – jest to organizm w
którym materiał genetyczny został zmieniony w sposób inny niż w warunkach naturalnych (w skutek
krzyżowania lub naturalnej rekombinacji).

Modyfikacje stosowane w roślinach:
Pod względem rodzaju modyfikacje roślin podzielić można na trzy rodzaje:
• zmiana aktywności genów naturalnie występujących w danym organizmie
• wprowadzenie do organizmu roślinnego dodatkowych kopii jego własnych genów
• wprowadzenie genu pochodzącego z organizmu innego gatunku

Metody wprowadzania DNA do komórki
• metody pośrednie – transformacja przy użyciu Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens –

glebowa Gram(-), fitopatogeniczna, o szerokim spektrum patogeniczności (atakuje

ponad 600 gatunków roślin), wywołuje guzowatość korzeni, należy do rodziny Rhizobiaceae, zakaża rośliny wnikając do
skaleczonych tkanek

Agrobacterium rhizogenes –

glebowa, wywołuje włośnikowatość korzeni w miejscu zranienia tkanki, zdolna do

transferu Ri plazmidu do kom. roślinnych

• metody bezpośrednie:
- bezpośrednie wprowadzenie DNA do komórki pozbawionej ściany komórkowej (protoplastu), stosowanie
czynników zwiększających przepuszczalność błony komórkowej
- metoda balistyczna (działo genowe)
- metoda mikroiniekcji

Agrobacterium tumefaciens – wywołuje chorobę roślin dwuliściennych określaną jako choroba guzowatości
szyjki korzenia.
Agrobacterium rhizogenes – powoduje włosowatość korzeni.
Agrobacterium rubi – powoduje choroby malin i porzeczek.
Agrobcterium radiobacter – raczej saprofit niż pasożyt.

Mechanizm wywoływania choroby przez Agrobacterium
A. tumefaciens posiada megaplazmid (200kpz) odpowiedzialny za chorobę, nazywany Ti (Tumor inducing).
U A. rhizogenes wykryto podobny plazmid który nazwano Ri.
Fragment plazmidu Ti (zwany T-DNA ok 20kpz) jest przenoszony do komórki roślinnej i włączany do
genomu.
Guz formuje się na wskutek aktywności małej liczby genów (onkogenów) znajdujących się we fragmencie
T-DNA i kodujących geny odpowiedzialne za syntezę AUKSYN, CYTOKININ i biorące udział w
morfogenezie tumorów.
Geny te odpowiedzialne są również za powstanie specyficznych związków azotowych – opin. OPINY są
pochodnymi aminokwasów (głównie Arg) i są metabolizowane przez bakterie.

Na plazmidzie znajduje się również grupa genów zwanych vir, które kodują proteiny odpowiedzialne za
wycięcie i transfer regionu T-DNA. Geny vir (24 geny) zorganizowane są w 8 operonów ( vir -A, -B, -C, -D,
-E, -F, -G, -H):
Vir A i G – aktywacja pozostałych genów vir
Vir B – koduje białka błonowe tworzące struktury przez które przechodzi odcinek T
Vir C i E – w ochronie i transporcie odcinka T-DNA
Vir D – odpowiedzialny za wycięcie T-DNA
Vir F i H – odpowiedzialny za podtrzymanie procesu rakowacenia

W transformację zaangażowane są geny chvA, B i E na chromosomie bakteryjnym
- chvA i B odpowiedzialne są za połączenie bakterii z komórką roślinną
- chv E – uczestniczy w aktywacji genów vir
Geny chv i virA – transkrybowane są konstytutywne, pozostałe – indukowane przez zranioną tkankę
roślinną

Analizując transfer T-DNA do komórki roślinnej, wyciągnięto trzy istotne dla procesu transformacji fakty:
• guz powstaje wskutek procesu transformacji komórek roślinnych; proces ten jest rezultatem przeniesienia i
integracji T-DNA
• geny kodowane przez region T-DNA ulegają transkrypcji tylko w komórce roślinnej i nie pełnią żadnej
funkcji w czasie transferu
• każde obce DNA umieszczone między sekwencjami borderowymi może być przeniesione do komórki
roślinnej i nie ma znaczenia skąd ono pochodzi.

Wprowadzenie do Agrobacterium przez koniugację, gdzie powstaje zintegrowany z plazmidem Ti (w
procesie HOMOLOGICZNEJ REKOMBINACJI)
Dwa wektory:
• kointegracyjny (transgen w klon. w typowy plazmid replikujący się w E.coli i zawierający T-DNA)

rzadko stosowany ze względu na wielkość
• binarny (T-DNA i geny vir są na oddzielnych plazmidach), plazmid z obcym DNA replikuje się w E.coli
a następnie jest transferowany koniugacyjnie do Agrobacterium które zawierają geny wirulencji, funkcja vir
jest dostarczana w formie trans.

LB, RB – 25-nt sekwencje wymagane do integracji DNA do genomu rośliny
Wektor pomocniczy = modyfikowany Ti, plazmid bez T-DNA bez regionu
Zawiera region virD2 i virE2 odpowiedzialny za wycinanie transfer i integrację do genomu rośliny T-DNA

• transformacja 1-liściennych przez Agrobacterium zakończona sukcesem
• komórki embrionalne ryżu inkubowano z Agrobacterium w obecności acetosyringonu (induktor genów
odpowiedzialnych za transfer)
• jęczmień i kukurydza – wydajność transformacji 5-30% (niedojrzałe zarodki inokulowano Agro)
• ostatnio stosowano wektory superbinarne zawierające fragment DNA z Agrobacterium poprawiający
skuteczność transformacji (geny marker i transgen są na oddzielnych plazmidach, kotransformacja takimi
konstruktami –

w kolejnych pokoleniach otrzymujemy transformanty bez markerów selekcyjnych)

1. POZYSKIWANIE MŁODYCH ORGANIZMÓW (EKSPLANTATÓW) DO TRANSFORMACJI (czas
ok jednego tygodnia)
2. NACINANIE MŁODYCH LIŚCI, INKUBACJA ZRANIONYCH LIŚCI Z HODOWLĄ BAKTERII
ZAWIERAJĄCYCH KONSTRUKCJĘ DNA KTÓRA MA ZOSTAĆ WPROWADZONA DO GENOMU
ROŚLINY (czas trzy dni)
3. OBMYCIE HODOWLI Agrobacterium
4. UŁOŻENIE ZAINFEKOWANYCH LIŚCI NA POŻYWCE Z DODATKIEM HORMONÓW
STYMULUJĄCYCH TWORZENIE TKANKI KALLUSOWEJ (czas ok siedmiu dni)
5. PRZENIESIENIE TKANKI KALLUSOWEJ NA POŻYWKĘ INDUKUJĄCĄ TWORZENIE PĘDU
(czas około miesiąca)
6. UKORZENIANIE ROŚLIN TRANSGENICZNYCH (czas około dwóch tygodni)
7. PRZENIESIENIE DO GLEBY (czas 13. tydzień)

Procedury wyk. Agrobacterium:
• inokulacja (umieszczenie eksplantatów w roztworze bakterii)
• pozbycie się nadmiaru bakterii – opłukanie w wodzie/pożywce
• umieszczenie eksplantatów na pożywkach regeneracyjnych (zawierających antybiotyki w celu eliminacji
bakterii i czynnikiem selekcyjnym)
• CIM – kalus
• SIM – pęd
• RIM – korzenie

METODA INFILTRACJI – transformacja bez kultur in vitro, inokulum wprowadza się do tych części
roślin, w których zachodzą intensywne podziały komórki.

Metoda mikrowstrzeliwania z użyciem działa genowego
- wprowadzenie obcego DNA bezpośrednio do komórki poprzez wstrzelenie do niej mikronośników
(złotych lub wolframowych kulek o średnicy 0.36-0.6mm) opłaszczonych cząsteczkami DNA

Wady i zalety metody biobalistycznej:
• uniwersalność
• niska liczba stabilnych transformantów (1-5%)
• możliwość tworzenia przez wolfram związków toksycznych dla komórki (na wskutek agregacji lub
utleniania)
• cena
• wielkość plazmidu do 10kb, lepsza integracja DNA gdy ma ono postać liniową

Particle Bombardment
• prędkość pocisku – kilkaset metrów na sekundę – siła napędowa pochodzi z rozprężenia helu, azotu lub
powietrza
• uszkadza komórki – mała przeżywalność
• zupełnie przypadkowe umieszczenie DNA (bardzo mały procent trafia do jądra komórkowego)
• wymaga drogiego i specjalistycznego (w porównaniu z innymi metodami) sprzętu, jeden strzał 500µg
pocisków opłaszczonych 1µg)
• efektywność zależy od rodzaju aparatu, ciśnienia gazu napędzającego mikronośniki, wielkości i rodzaju
mikronośników, dystansu jaki muszą pokonać, formy plazmidu, rodzaju transformowanej tkanki

• wydajność tej metody transformacji raczej niska – transformaty przejściowe
• konstrukcja genetyczna nie jest niczym chroniona – narażona na uszkodzenia

Geny reporterowe (łatwe do śledzenia) GFP GUS (beta-glukuronidaza) lucyferaza

Metody alternatywne
• mikroiniekcja
- możliwość transferu całego chromosomu
- uniwersalność (tranformacja zarówno komórek roślinnych jak i zwierzęcych)
- wymagana precyzja i doświadczenie oraz sprzęt
- wysoka efektywność procesu (20-50%)
• transformacja protoplastu (różne techniki)
- transformacja protoplastów przy użyciu glikolu polietylenowego (PEG)
- transformacja przy użyciu PEG i liposomów, w których zamknięte jest DNA
- niska efektywność procesu 1-2% transformatów
• elektroporacja

- uniwersalność
- do tej metody stosuje się protoplasty
- dość wysoka efektywność, zwiększona poprzez użycie PEG (ok. 25-50%)
Istotny wpływ czynników fizycznych takich jak napięcie prądu, pojemność elektryczna kondensatora, czas
trwania impulsu elektrycznego, temperatura roztworu, czas inkubacji protoplastó1) i plazmidu przed i po
elektroporacji, gęstość plazmidu
• metoda włókien silikonowych
- niska cena, łatwość wykonania, szybkość
- uniwersalność
- planuje się zastąpienie włókien silikonowych włóknami waty szklanej

Wirusy jako wektory
• łatwość infekcji
• duża liczba wbudowanych kopii (czyli wysoka ekspresja)
wady:
• limitowana wielkość obcego DNA (np. CaMV może przenosić fragmenty do 0.8 kpz)
• infekcja wirusowa może być letalna lub charakteryzować się objawami typowymi dla wirusa
- np. wyciszanie genów z wyk. TRV wirusa tytoniu
- genom wirusa jest 2-dzielny (RNAI, RNAII)

Stopień ekspresji wprowadzonego genu zależy od:
• ilości kopii wprowadzonego genu
• stabilności wprowadzonego T-DNA
• konfiguracji wprowadzonego T-DNA
• miejsca wbudowania w genom gospodarza
• elementów cis regulujących ekspresję transgenu
• elementów trans regulujących ekspresję transgenu
• czynników środowiskowych

Najczęściej modyfikowane rośliny to:
- soja – 53%
- kukurydza – 27%
- bawełna – 9%
- rzepak – 8%
- ziemniaki, dynia, papaja – 1%

Przykłady upraw GMO
• jabłka – odporne na insekty
• banany – odporne na wirusy i bakterie
• pomidor – wydłużony czas dojrzewania, nie miękną
• winogrona – cecha bezpestkowości
• ziemniaki – odporność na szkodniki (stonka ziemniaczana), zmieniona struktura skrobi, która jest
wykorzystywana do produkcji mas plastycznych samorozkładających się
• rzepak – wyższa zawartość tłuszczu
• truskawka – cecha mrozoodporności
• ryż żółty – zwiększona zawartość beta-karotenu