2011:

1)
2) Zastosowania bakteriofagów
3) Jak stworzyć mutanta inercyjnego
4) Trzy typy regulacji biosyntezy idiolitów (np. fosforanowa, amonowa, represja kataboliczna)
5) Opisz szlak biosyntezy kwasu glutaminowego i zaznaczeniem etapów kluczowych dla nadprodukcji

1. W jaki sposób i które z podstawowych procesów fizjologicznych mikroorganizmów są

wykorzystywane w biotechnologii i ochronie środowiska? Podaj przykłady i uzasadnij.



fermentacja mlekowa: produkcja kwasu mlekowego, jogurtów, kefirów, masła …



fermentacja alkoholowa: produkcja etanolu



fermentacja metanowa: oczyszczanie ścieków, produkcja biogazu



bioakumulacja: wychwyt toksycznych związków, metali ciężkich



bioremediacja, bioaugmentacja: oczyszczanie skażonych gleb



wytwarzanie antybiotyków: głównie promieniowce oraz rodzaj Bacillus



wytwarzanie bakteriocyn: nizyna – konserwant żywności



wytwarzanie egzopolisacharydów: ksantan, dekstran, pullulan, kurdlan



otrzymywanie aminokwasów z wykorzystaniem nadprodukcyjnych mutantów

2. Co to jest GMO i w jakich przypadkach mogą być szkodliwe dla środowiska?

- powstanie superchwastów – skrzyżowanie GMO odpornych na szkodniki z chwastami, niekontrolowany transfer
stosowanych wektorów,
- wypieranie naturalnych roślin ze środowiska w razie niekontrolowanej uprawy, zwiększone rozmnażanie
zmodyfikowanych organizmów,
- nadprodukcja substancji alergennych,
- szkodliwy wpływ na insekty, nie tylko szkodniki (np. motyle)

3. Opisz drogę prowadząca do uzyskania mutanta insercyjnego na dowolnie wybranym przykładzie.

Przykład – konstrukcja kolekcji mutantów transpozonowych z użyciem Tn10 Listeria monocytogenes
- konstruujemy wektor niosący kasetę z genem oporności na antybiotyk + innymi sekwencjami, które chcemy
umieścić w genomie
- sekwencje insertowane umieszczamy pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez transpozazę – sekwencja
ulegnie wycięciu
- wektor jest replikonem termowrażliwym (ts) – replikacja zachodzi tylko w warunkach permisywnych (37 stopni),
zaś nie w restrykcyjnych (42 stopnie)
- wprowadzamy wektor do szczepu w temperaturze 37 stopni, bez presji antybiotykowej
- po jakimś czasie hodowli (wyrażenie oporności na antybiotyk – zależnie od zastosowanego markera) przenosimy
szczep na podłoże z antybiotykiem, w temperaturze 42 stopni
- kolonie, które się pojawią, powstaną z rozmnożenia bakterii z kasetą wbudowaną w genom, ponieważ komórki bez
tej kasety będą umierały – plazmid nie będzie się replikował i przechodził do komórek potomnych
- zamiast transpozazy można zastosować po prostu sekwencje homologiczne i oczekiwać wbudowania kasety przez
rekombinazę

4. Wybierz dowolna toksynę bakteryjna i wykaz jej znaczenie zarówno negatywne jak i pozytywne dla

człowieka.

5. Biotechnologia penicylin. Podaj, z uzasadnieniem, warunki niezbędne do syntezy pólsyntetycznych

penicylin.

6. Dlaczego wysoka wartosc stosunku NAD(P)H/NAD(P)+ jest niekorzystna dla nadprodukcji

kwasu cytrynowego?

Przewaga formy zredukowanej prowadzi do transportu e- z udziałem łańcucha cytochromowego i dużej produkcji
ATP, co skutkuje zahamowaniem glikolizy i cyklu Krebsa oraz aktywacją glukoneogenezy. ATP hamuje aktywność
PFK (fosfofruktokinazy) i kinazy pirogronianowej (PEPPyr).
Niski stosunek NADH/NAD+ powoduje wzrost udziału drogi alternatywnej, która nie prowadzi do powstawania ATP,
nie hamuje glikolizy i TCA, czyli wpływa korzystnie na produkcję kwasu cytrynowego.

3. opisz molekularną zasadę działania szczepionek

5. metody rozdzielania mieszanin racemicznych. (mieszaniny racemiczne aminokwasów)

- poddanie mieszaniny L,D-laktonów działaniu stereospecyficznej hydrolazy – rozdział laktonu i łańcucha
- zastosowanie stereo specyficznej dekarboksylazy Bacillus sphaericus
- zastosowanie stereo specyficznej dekarboksylazy asparaginianowej Pseudomonas dacunhae lub E. coli

1. Opisać etapy screeningu antybiotyków

- pobranie próbki, najlepiej z jakiegoś interesującego źródła
- izolacja mikroorganizmu z próbki – wytrząsanie w roztworze soli fizjologicznej
- odpowiednie rozcieńczenia hodujemy w podłożu płynnym: woda wodociągowa, mączka sojowa, mannitol, pH 7,5
(od razu mamy na uwadze koszta produkcji)
- hodowla w różnych warunkach wzrostu (temperatura, napowietrzanie, wielkość hodowli), hodujemy
- wirujemy
- badamy supernatant: szukanie potencjalnych nowych związków:
HPLC, TLC (każdy Streptomyces ma swój wzór TLC)
- szczep można też wysiać na podłoże stałe i wysiać na niego szczep wskaźnikowy Bacillus pumilis – jeśli nie wyrośnie
w tych miejscach, są związki antybakteryjne
- lub na szalkę ze szczepem wskaźnikowym na krążki bibuły nakraplamy supernatant

2. Zalety i wady bakteriofagów w medycynie

+ Zalety +

-- Wady --

* ich stężenie wzrasta – namnażają się (stężenie
antybiotyków maleje we krwi z czasem);
* są specyficzne – nie niszczą całej flory bakteryjnej;
* nie niszczą komórek gospodarza – specyficzne;
* broń przeciwko szczepom antybiotykoopornym (MRSA,
VRE)

* konieczne uzyskanie specyficznego faga wobec
patogenu – konieczna dokładna identyfikacja;
* trudna hodowla faga – możliwość zarażenia roztworu
patogennym gospodarzem;
* fag jako obca cząsteczka wywołuje odpowiedź
immunologiczną UO i jest przez nią zwalczany’

3. Zalety szczepionek nowej generacji. Podać kilka przykładów (chyba 3)

5. Nadprodukcja kwasu cytrynowego u Aspergillus niger. Warunki. Szlak. Co powinno być
w podłożu

Wytwarzanie kwasu cytrynowego z glukozy w szlaku glikolizy i cyklu Krebsa.
glukoza  fosfoenolopirogronian  pirogronian  acetylo-CoA  cytrynian
warunki syntezy:



deficyt Zn2+  zahamowanie przekształcenia Pyr w produkty inne niż acetylo-CoA



deficyt Fe2+ i Mn2+  niska aktywność akonitazy  brak przekształcenia w izocytrynian



wysoki poziom glukozy i NH4+ w podłożu  represja syntezy dh. 2-oksoglutaranowej (nie wytwarza bursztynylo-
coA)



brak aktywności liazy cytrynianowej w A. niger (liaza rozkłada cytrynian)



dobre natlenienie hodowli



deficyt fosforanów

Produkcja kwasu cytrynowego:

o intensywne napowietrzanie -> aktywacja jałowej energetycznie alternatywnej oksydazy
o wysoka kwasowość (pH 2-3) ogranicza udział innych kwasów w produktach końcowych,.
o dodatek żelazocyjanku potasu wytrąca niepożądane jony metali oraz działa jako promotor wytwarzania kwasu i

inhibitor wzrostu

o niskie stężenie soli fosforowych i amonowych (źródło azotu) limituje wzrost grzybni

6. Nadprodukcja biosyntezy idiolitów poziomem jonów fosforanowych lub amonowych
(wybrać i opisać)

- deficyt fosforanów  wzrost syntezy kwasu cytrynowego
- NH4+ jest konieczny w syntezie aminokwasów, trzeba go dostarczać

Regulacja fosforanowa
- niskie stężenie fosforanów  spadek ATP  produkcja chlorotetracykliny, streptomycyny, kandycydyny
- wysokowydajny Streptomyces aureofaciens charakteryzuje się niskim stężeniem fosforanów w komórce
- fosforany hamują działanie fosfataz, które uczestniczą w defosforylacji metabolitów pośrednich do streptomycyny
- fosforany przyspieszają przyswajanie glukozy, co blokuje ekspendazę i syntezę cefalosporyny
- wyjątki: gramicydyna S, nowobiocyna (wymagają wysokiego stężenia fosforanów)

Regulacja jonem amonowym
- wysokie stężenie hamuje syntezę tylozyny (makrolidu) przez hamowanie deaminacji AA pośrednich
- wysokie stężenie hamuje syntezę penicyliny przez represję syntetazy glutaminianowej (ogranicza dostępność
donora grupy aminowej) oraz represja ekspandazy (synteza cefalosporyny)

- niski poziom hamuje biosyntezę streptomycyny i alfa-toksyny

1. Podaj przykłady zastosowania toksyn w biotechnologii.

toksyna botulinowa – Clostridium botulinum



w medycynie – leczenie zeza, skurczy mięśni, nadmiernej potliwości



w kosmetyce – wygładzanie zmarszczek
immunotoksyny

toksyna Bacillus thuringiensis  rośliny GMO odporne na ataki szkodników (kukurydza Starlink)

2.Opisz znane Ci bakteriofagi, które zastosowano w procedurach inżynierii genetycznej.

Kosmid plazmid z wstawionymi sekwencjami cos bakteriofaga Lambda, dzięki czemu wektor uzyskuje właściwości
plazmidu i faga. Kosmidy są koliste i replikują się jak plazmidy, a następnie są pakowane w kapsydy. Zastosowanie
kosmidów pozwoliło na klonowanie dłuższych sekwencji.

Retrowirusy wykorzystanie odwrotnej transkryptazy

Fag T4 – w inżynierii genetycznej stosuje się jego LIGAZĘ oraz POLIMERAZĘ T4 do wytępiania końców po cięciu
enzymem restrykcyjnym (wypełnianie końców asymetrycznych)

Fag FiX174 – pierwszy zsekwencjonowany genom fagowy, posiada geny zachodzące na siebie, bywa używany jako
kontrola pozytywna w sekwencjonowaniu DNA dzięki niewielkiej cząsteczce

Fag MS2 –wykorzystywane w technice „MS2 Tagging” służącej do detekcji i lokalizacji RNA w komórce

3. Podaj znane Ci sposoby podniesienia wydajności procesu transformacji.

- traktowanie bakterii roztworami soli – zwiększenie przepuszczalności błony (chlorek wapnia, chlorek rubidu –
metoda rubidowo-cezowa)
- elektroporacja – poddawanie bakterii krótkiemu działaniu wysokiego napięcia

komórki niebakteryjne:
- mikroiniekcja
- elektrotransformacja
- lipofekcja – podanie DNA zamkniętego w lipo somie
- poddawanie protoplastów działaniu glikolu polietylenowego

4. Zaprojektuj najprostszy eksperyment prowadzący do uzyskania i izolacji rekombinantów
genetycznych przez koniugację.

- założyć hodowle nocne dwóch szczepów (biorcy dawcy + ew. helper), każdy z jakimś markerem
- zawiesić w LB po odwirowaniu podłoża z antybiotykiem
- zmieszać w proporcjach 200ul biorca + 100ul helper + 100ul dawca
- wysiać na LB głaszczką – koniugacja
- wyrosłą murawkę zdrapać głaszczką po dodaniu LB, wysiać w rozcieńczeniach na podłoże selekcyjne z presją dwóch
czynników (jeden na marker biorcy, jeden na marker dawcy – wyrosną tylko koniuganty)

5. Podaj i opisz etapy szlaku biosyntezy aminokwasu, który prowadzi do jego nadprodukcji.

Biosynteza L-glutaminianiu
Pobór glukozy, która jest substratem dla:
- HMP, który generuje NADPH konieczny w redukcji 2-oksoglutaranu do L-glutaminianu
- wytwarzania PEP, który jest przekształcany w pirogronian (włączany do TCA i przekształcany w oksoglutaran) oraz
karboksylowany do szczawiooctanu (też włączany do TCA, kondensuje z acetylo-coA – produktem przemiany
pirogronianu)
- suboptymalne stężenie biotyny w podłożu zwiększa wydzielanie L-glutaminianu do podłoża

Inne okoliczności sprzyjające:
- zablokowana liaza cytrynianowa  izocytrynian przekształcany jest w 2-oksoglutaran
- zablokowana dehydrogenaza 2-oksoglutaranowa  cały 2-og jest przekształcany w L-glutaminian

6. Omów etapy biosyntezy tetracykliny lub cefalosporyny (do wyboru)

Szlak poliketydowy  ryfamycyny, tetracykliny
Szlak przypomina syntezę KT, lecz wykorzystuje wiele prekursorów: acetylo-CoA,
propionylo-CoA, malonylo-CoA…

1) Wydłużanie łańcucha poliketydowego z wykorzystaniem acetylo-CoA, propionylo-CoA,

malonylo-CoA, amidomalonylo-CoA (Asn donorem grupy aminowej)

2) Redukcja różnych grup w różnym stopniu
3) Cyklizacja układu  jeden lub więcej pierścieni
4) Modyfikacja produktu (może nastąpić także przed cyklizacją)  metylacja, hydroksylacja, chlorowanie

(chlorotetracyklina)

Biosynteza antybiotyków B-laktamowych

1) Kondensacja: kwasu aminoadypinowego, cysteiny i waliny  tri peptyd
2) Cyklizacja
3) Transacylacja
4) Przekształcenie izopenicyliny w penicylinę N
5) Ekspandaza przekształca penicylinę w cefalosporynę – aktywność ekspandazy jest hamowana wysokim stężeniem

fosforanów

1. Opisz i oceń sposoby atenuacji szczepów bakteryjnych wykorzystywanych do produkcji
szczepionek.

Atenuacja – sztuczne usunięcie czynników wirulencji w patogennym organizmie, z zachowaniem jego zdolności do
wywoływania odpowiedzi immunologicznej.

- atenuacja chemiczna: unieszkodliwienie środkiem chemicznym bez zmiany struktury, np. z użyciem formaldehydu,
termiczne; pasażowanie bakterii (np. szczepionka BCG powstała wskutek wielokrotnego pasażowania Mycobacterium
bovis na podłożu z żółcią)

- atenuacja genetyczna: modyfikacja genetyczna (z użyciem mutagenów, metodami inżynierii genetycznej) prowadząca
do utraty zjadliwości; najbezpieczniejsza jest całkowita delecja niebezpiecznego genu (mutacja punktowa może łatwo
rewertować, doprowadzając do powrotu wirulencji), pozostaje jednak niebezpieczeństwo nabycia wirulencji wskutek
horyzontalnego transferu genów przy niezachowaniu najwyższego bezpieczeństwa

3. Zastosowania hodowli tkankowych w biotechnologii.



badanie wpływu związków na komórki (np. potencjalnych leków)



hodowla organizmów, które nie rosną na zwykłych podłożach (pasożyty, Treponema)



produkcja cennych związków organicznych trudnych do uzyskania na innej drodze, np. otrzymywanie taksolu z
hodowli komórek Taxus baccata



produkcja przeciwciał, enzymów



produkcja wektorów wirusowych do terapii genowej



badania nad szczepionkami nowej generacji – patogennymi bakteriami wewnątrzkomórkowymi o roli „strzykawki
biologicznej” wyzwalającej produkcję przeciwciał przeciwko antygenowi

4. Zaproponuj eksperyment w którym udowodnisz przekazanie inf. genetycznej przez
transformację.

Uzyskujemy dwa szczepy bakterii – jeden zjadliwy, drugi nie (np. szczepy otoczkowe i bezo toczkowe Pneumococcus z
eksperymentu Griffitha). Po wstrzyknięciu zjadliwego – mysz zdycha, po wstrzyknięciu niezjadliwego – mysz żyje, po
wstrzyknięciu zabitych termicznie bakterii zjadliwych oraz żywych niezjadliwych – mysz zdycha. Wniosek: musiało
nastąpić przekazanie jakiegoś czynnika wirulencji.
Możemy też zidentyfikować „czynnik transformujący” poprzez traktowanie roztworu z zabitymi bakteriami
proteazami, rybonukleazami i deoksyrybonukleazami. Proteazy i rybonukleazy nie zmienią przebiegu eksperymentu,
zaś DNaza zdegraduje DNA, przez co nie zostanie pobrany przez niezjadliwe bakterie.