TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

Ćwiczenie VI

Ekspresja domeny wiążącej DNA receptora ekdysteroidowego (EcRDBD) z plazmidu pGEX-2T (pGEX-2T/EcRDBD), w komórkach Escherichia coli szczepu XL1 – Blue.

1. Ekspresja domeny wiążącej DNA receptora ekdysteroidowego (EcRDBD) z plazmidu pGEX-2T (pGEX-2T/EcRDBD), w komórkach Escherichia coli szczepu XL1 – Blue wykonana przez asystenta.

2. Indukcja ekspresji genu z EcRDBD

   1. Z hodowli startowej pobrano 6ml zawiesiny komórek XL1 – Blue transformowanej wektorem pGEX-2T oraz pGEX-2T/EcRDBD i dodano do 50ml świeżego medium LB z 50µl karbenicyliny.

   2. Inkubowano przez 1 godzine w 37°C przy 182 obr/min. Po tym czasie gęstość optyczna (OD) osiągnęła 0,883.

   3. Po inkubacji pobrano 1ml hodowli z obydwu kolb i odwirowano w probówkach Eppendorfa przez 90s przy 13400obr/min. Supernatant odrzucono a osad bakteryjny zawieszono w 100μl 2xSB.

Uzyskano w ten sposób :

• Hodowlę właściwą N1/I z wektorem pGEX-2T/EcRDBD

• Hodowlę kontrolną N1/II z wektorem pGEX-2T

  1. Dodano 27,5 μl ZnCl₂ oraz 27,5 μl induktora IPTG i kontynuowano inkubacje w 37°C przy 182obr/min.

  2. Podczas inkubacji zmierzono absorbancje po 15, 30, 60 i 105 minutach w kolbie z hodowla właściwą i po 105 minutach w kolbie z hodowlą kontrolną.

  3. Odpowiednia ilość hodowli z każdego pomiaru odwirowano i dodano 100μl 2xSB.

  4. Próbki zamrożono w -20°C.

Wyniki:

Po zmierzeniu absorbancji hodowli właściwej w odpowiednich odstępach czasowych otrzymano wyniki:

-po 15 minutach 1,012

-po 30 minutach 1,112

-po 60 minutach 1,209

-po 105 minutach 1,276

W przypadku hodowli kontrolnej:

-po 105 minutach 1,186

Wnioski:

• Cel ćwiczenia został osiągnięty, wraz ze wzrostem czasu inkubacji, wzrastała gęstość optyczna przy α=600nm we wszystkich próbkach. Próba kontrolna ma mniejszą gęstość optyczną po 105 minutowej inkubacji niż próbka z hodowlą właściwą. Ma to związek z brakiem insertu kodującym białko DBD w próbie kontrolnej.

• Wzrost gęstości optycznej w próbkach z hodowlą właściwą związany był z namnażaniem się bakterii oraz syntezą białka DBD.

• Pobrane próbki będą sprawdzane pod względem zawartości interesującego nas białka poprzez SDS-PAGE.