Sprawozdanie z ćwiczenia nr 4 Data wykonania ćwiczenia: 19.12.2011

Data oddania sprawozdania: 09.01.2012

Tytuł ćwiczenia:

Pomiar wielkości komórek wątrobowca za pomocą mikroskopu. Podstawy statystyki.

Wykonujący ćwiczenie: Sagan Paweł

Wstęp

Mikroskop jest to przyrząd pozwalający na otrzymanie silnie powiększonych obrazów bardzo małych przedmiotów i ich szczegółów. Umożliwia dokonanie analizy jakościowej, ilościowej, właściwości fizycznych i chemicznych obiektu. Mikroskop zbudowany jest z dwóch podstawowych układów:

-Mechaniczny – podstawa i statyw mikroskopu, tuba (nasada okularowa, głowica tubusu), uchwyt obiektywów (rewolwer), stolik mikroskopowy, śruba makro i mikrometryczna, podnośnik kondensora.

-Optyczny – źródło oświetlenia wraz z oświetlaczem (kolektor), kondensor, obiektyw i okular, zwierciadła, pryzmaty, półprzepuszczalne lustra, dodatkowe soczewki powiększające, filtry.

Podział mikroskopów ze względu na:

1. Rodzaj użytego promieniowania

   1. Mikroskop świetlny (optyczny) – wykorzystuje światło naturalne, obiektyw daje obraz rzeczywisty, powiększony, odwrócony, a okular pełni rolę lupy, w której obserwujemy obraz pozorny, powiększony, prosty. Są stosowanie do obserwacji i badań małych obiektów w wielu dyscyplinach naukowych.

   2. Mikroskop elektronowy – do obrazowania obiektów wykorzystują wiązkę elektronów. W mikroskopie tym zamiast wiązki światła padającego na obserwowany preparat użyta zostaje wiązka elektronów biegnąca z dużą prędkością w próżni, a zamiast soczewek szklanych – soczewki elektronowe. Bardzo powiększony obraz przedmiotu otrzymywany jest na płycie fotograficznej lub ekranie fluorescencyjnym. Mikroskop ten pozwala badać materię na poziomie atomowym. Umożliwia obserwację organelli komórkowych i wirusów. Wyróżnia się:

-Elektronowy mikroskop transmisyjny (TEM)- rejestruje elektrony przechodzące przez próbkę powiększa do 1 000 000 razy.

-Elektronowy mikroskop skaningowy (SEM)- znalazła zastosowanie w obrazowaniu topograficznym. Daje powiększenia rzędu 10 000 – 50 000 razy.

-Mikroskop ultradźwiękowy- wykorzystuje falę ultradźwiękowe do otrzymania powiększonego obrazu elementów struktury ośrodka sprężystego. Stosuje się go do badań nieprzezroczystych makroobiektów, analizie lepkości oraz w badaniach nad ruchem cytoplazmy.

1. Metody obrazowania

   1. Konwencjonalne – obszar badany jest wiązką elektronów

   2. Skanujące

   3. Holograficzne – przykładem mikroskopii trój wymiarowej jest mikroskopia konfokalna, charakteryzująca się powiększonym kontrastem i rozdzielczością

2. Zjawiska fizyczne będące podstawą ich działania

   1. Mikroskop fluorescencyjny - to mikroskop świetlny używany w badaniach substancji organicznych i nieorganicznych, którego działanie oparte jest na zjawisku fluorescencji i fosforescencji, zamiast, lub razem ze zjawiskami odbicia i absorpcji światła (co jest wykorzystane w klasycznym mikroskopie optycznym). Fluoroscencja próbki może być pochodzenia naturalnego (np. fluoroscencja chlorofilu) lub być wynikiem dołączenia (kowalencyjnie lub poprzez jakikolwiek inny typ oddziaływań fizyko-chemicznych między substancjami) do elementów obserwowanej próbki fluoroforów, czyli substancji chemicznych, które fluoryzują po wzbudzeniu światłem o określonej długości. Drugi sposób jest najczęściej wykorzystywanym w biologii, a w szczególności w biologii molekularnej, gdyż pozwala, poprzez znajomość oddziaływań, na wyznakowanie interesujących elementów komórki (np. białek, czy organelli), fluoroforami o zadanych właściwościach (np. barwie emisji).

   2. Mikroskop polaryzacyjny – Posiada między okularem a źródłem światła dwa filtry polaryzacyjne (polaryzator i analizator) które przepuszczają tylko tę część światła, która ma ściśle określoną polaryzację. Płaszczyznę polaryzacji analizatora można zmieniać, uzyskując wygaszenie jednych obrazów i rozjaśnienie innych, czemu zazwyczaj towarzyszą efekty barwne, ze względu na różnice w skręcalności właściwej dla różnych długości światła.

   3. Mikroskop interferencyjny – mikroskop optyczny, w którym do badania przedmiotu wykorzystuje się interferencję wiązek światła przechodzących przez przedmiot lub wiązki przechodzącej i wiązki odniesienia; stosowany do badania preparatów biologicznych, a także w metalografii i fizyce włókien. Przykładem mikroskopu interferencyjnego jest mikroskop kontrastowo-fazowy.

Średnia arytmetyczna pomiarów to wartość najbardziej prawdopodobna i jest średnią arytmetyczną poszczególnych pomiarów.$\ X = \frac{x_{1} + x_{2} + \ \ldots\ldots\ldots x_{n}}{n}$

błąd przypadkowy jest to błąd, który przy wielokrotnym powtarzaniu pomiarów (obliczeń) tej samej wartości w tych samych warunkach zmienia się w sposób nieprzewidziany.

Odchylenie Standardowe - miara zmienności danych (takich jak dane produkcyjne, wiek, kurs walut itp.)  wokoło ich średniej. Im większy rozrzut danych tym wyższe odchylenie standardowe. Odchylenie standardowe jest liczone jako pierwiastek kwadratowy z wariancji $SD = \sqrt{\frac{\sum_{i = 1}^{n}{(x_{i} - X)}^{2}}{n - 1}}$

Błąd standardowy średniej jest wartością określaną dla serii pomiarowej, określa błąd przypadkowy wartości średniej $SE = \frac{\text{SD}}{\sqrt{n}}$

Wykonanie ćwiczenia

Do cechowania mikroskopu potrzebna jest skala mikrometryczna, która została umieszczona na stoliku. Następnie ustawia się skalę mikroskopu tak aby pokrywały się ze sobą. Potem za pomocą śruby mikrometrycznej wyznacza się położenie podwójnej kreski. Mikroskop został wycechowany dla obiektywów 4x, 10x, 40x.

Po wycechowaniu mikroskopu zostały wyznaczone średnice dowolnie wybranych 10 komórek dla obiektywu 10x. Czynność zostało powtórzona dla obiektywu 40x, dodatkowo zostały policzone chloroplasty znajdujące się w komórkach wątrobowca.

Obserwacje

Obiektyw	Liczba podziałek skali okularu x	Liczba podziałek skali mikrometrycznej y	Długość podziałki okularu [mm]	Liczba działek
4x	4	56	0,2193	100
10x	8	13	0,1095	89
40x	8	13	0,0271	22

100×0, 01 = 1

1 ÷ 4, 56 = 0, 2193

89×0, 01 = 0, 89

0, 89 ÷ 8, 13 = 0, 1095

0, 22 ÷ 8, 13 = 0, 0271

Obliczanie średnicy komórki dla 10x:

1. 0,55×0, 1095 = 0, 060225

2. 0,79×0, 1095 = 0, 086505

3. 0,61×0, 1095 = 0, 066795

4. 0,53×0, 1095 = 0, 058035

5. 0,61×0, 1095 = 0, 066795

6. 0,49×0, 1095 = 0, 053655

7. 0,59×0, 1095 = 0, 064605

8. 0,67×0, 1095 = 0, 073365

9. 0,64×0, 1095 = 0, 07008

10. 0,47×0, 1095 = 0, 051465

Obliczanie pola powierzchni przekroju komórki:

1. π(0,060225)²=0,011389

2. π (0,086505)²=0,023011

3. π (0,066795)²=0,014009

4. π (0,058035)²=0,010576

5. π (0,066795)²=0,014009

6. π (0,053655)²=0,009040

7. π (0,064605)²=0,013106

8. π (0,073365)²=0,016901

9. π (0,07008)²=0,015421

10. π (0,051465)²=0,008317

Obliczanie średniej wartości Pp. ± SD_Pp:

Pp =$> \overset{\overline{}}{X}$= $\frac{1357,79}{10}$=0,0135779

SD_Pp=$\sqrt{\frac{(0,011389 - 0,0135779)^{2} + (0,023011 - 0,0135779)^{2} + (0,014009 - 0,0135779)^{2} + (0,010576 - 0,0135779)^{2} + \ldots + (0,008317 - 0,0135779)^{2}}{9}}$=

=0, 04296

Pp. ± SD_Pp=0,0135779±0, 04296

Obiektyw	L.p. komórki	Średnica komórek d [mm]	Pole pow. Komórki Pp [mm^2]	Średnia wartość Pp [mm^2] Pp±SDPp	Liczba chloroplastów N	Średnia liczba chloroplastów N±SDN
10x	1. 55 2. 79 3. 61 4. 53 5. 61 6. 49 7. 59 8. 67 9. 64 10. 47	0,060225 0,086505 0,066795 0,058035 0,066795 0,053655 0,064605 0,073365 0,07008 0,051465	0,011389 0,023011 0,014009 0,010576 0,014009 0,009040 0,013106 0,016901 0,015421 0,008317	0,0135779 0, 04295	-	-
40x	1. 1,068 2. 0,92 3. 0,89 4. 0,52 5. 1,024 6. 0,93 7. 0,85 8. 0,92 9. 1,029 10. 1,038	0,0289428 0,024932 0,024119 0,014092 0,0277504 0,025203 0,023035 0,024932 0,0278859 0,0281298	0,00263033 0,001952 0,001827 0,000624 0,00241807 0,001995 0,00248464 0,001952 0,00244174 0,001666	0,001999 0,001999± 0,000589	6 5 4 7 7 3 4 6 8 6	5,6 5,61,5776

Obliczanie średnicy komórki dla 40x:

0,0289428
0,024932
0,024119
0,014092
0,0277504
0,025203
0,023035
0,024932
0,0278859
0,0281298

1. 1,068×0, 0271=

2. 0,92×0, 0271=

3. 0,89×0, 0271=

4. 0,52×0, 0271=

5. 1,024×0, 0271=

6. 0,93×0, 0271=

7. 0,85×0, 0271=

8. 0,92×0, 0271=

9. 1,029×0, 0271=

10. 1,038×0, 0271=

Obliczanie pola powierzchni przekroju komórki:

0,002630
0,001952
0,001827
0,000624
0,002418
0,001995
0,001666
0,001952
0,002441
0,002484

1. π(0,0289428)²=

2. π (0,024932)²=

3. π (0,024119)²=

4. π (0,014092)²=

5. π (0,0277504)²=

6. π (0,025203)²=

7. π (0,023035)²=

8. π (0,024932)²=

9. π (0,0278859)²=

10. π (0,0281298)²=

Obliczanie średniej wartości Pp. ± SD_Pp:

Pp =$> \overset{\overline{}}{X}$=0,001999

SD_Pp=$\sqrt{\frac{(0,0263033 - 0,001999)^{2} + (0,001952 - 0,001999)^{2} + (0,001827 - 0,001999)^{2} + (0,000624 - 0,001999)^{2} + \ldots + (0,248464 - 0,001999)^{2}}{9}}$=0,000589

Pp. ± SD_Pp=0,001999±0,000589

Obliczanie średniej liczby chloroplastów N±SD_N

• N=> $\overset{\overline{}}{X}$=$\frac{6 + 5 + 4 + 7 + 7 + 3 + 4 + 6 + 8 + 6}{10}$= 5,6

• SD_N=$\sqrt{\frac{(6 - 5,6)^{2} + (5 - 5,6)^{2} + (4 - 5,6)^{2} + (7 - 5,6)^{2} + (7 - 5,6)^{2} + (3 - 5,6)^{2} + (4 - 5,6)^{2} + (6 - 5,6)^{2} + (8 - 5,6)^{2} + (6 - 5,6)^{2}}{10 - 1}}$

=$\sqrt{2,488889}$=1,5776

N±SD_N= 5,61,5776

Wnioski

Komórki plechy wątrobowca mają podobne średnice, oraz posiadają podobne pola powierzchni , co skutkuje małym odchyleniem standardowym. Odchylenie standardowe jest większe dla obiektywu 10x.Komórki wątrobowca posiadają podobna liczbę chloroplastów przez co ich odchylenie standardowe jest małe. W komórkach jest od 3 do 8 chloroplastów.