Ćwiczenie X

Metabolizm – źródło azotu, oddychanie

A) Źródła azotu

Występujące w środowisku źródła azotu dostarczają drobnoustrojom materiału do wytwarzania grup aminowych (-NH₂) oraz iminowych (-NH-), które są następnie wbudowywane w cząsteczki aminokwasów, nukleotydów i innych związków chemicznych. Bakterie mogą wykorzystywać różne źródła azotu łącznie z azotem atmosferycznym, który może być przyswajany przez niektóre gatunki symbiotyczne i wolnożyjące.

Szczepy bakteryjne:

1. Staphylococcus albus

2. Escherichia coli

3. Proteus vulgaris (na osobną płytkę)

4. Bacillus subtilis

1) W/w szczepy bakteryjne posiej na następujące podłoża:

1. Podłoże GTS z glukozą

2. Podłoże GTS z glukozą + 0,2% NH₄Cl

3. Podłoże GTS z glukozą + 0,2% KNO₃

4. Podłoże GTS z glukozą + 0,2% peptonu

5. Podłoże GTS z glukozą + 0,2% hydrolizatu kazeiny

6. Podłoże GTS z glukozą + 0,2% mocznika

7. Podłoże GTS z glukozą + 0,2% (NH₄)₂SO₄

Po inkubacji badanego materiału 24 godz. w 37°C na podłożach stałych zaobserwuj wzrost lub jego brak.

2) Test na ureazę

W/w szczepy wysiej na skosy z podłożem z mocznikiem wg Christensena

Materiały:

Podłoże z mocznikiem wg Christensena

pepton 1,0 g

NaCl 5,0 g

K₂HPO₄ 2,0 g

mocznik (20% r-r) 100 ml

czerwień krezolowa 4,8 ml

H₂O 900 ml

Drobnoustroje wytwarzające duże ilości ureazy alkalizują podłoże, wskutek rozkładu mocznika do jonu amonowego i CO₂, co przejawia się zmianą zabarwienia na kolor fioletowy.

B) Oddychanie bakterii

Oddychanie, czyli utlenianie biologiczne jest procesem metabolicznym, dzięki któremu, poprzez przemiany określonych związków chemicznych, komórka uzyskuje energię do przeprowadzania endoergicznych reakcji chemicznych. Substratem oddechowym są najczęściej cukry, ale mogą być wykorzystywane również tłuszcze, aminokwasy i inne. Utlenianie biologiczne związków wykorzystywanych w procesie oddychania polega na odrywaniu elektronów i przyłączanie ich do końcowego akceptora. W przypadku oddychania tlenowego akceptorem elektronów i protonów jest tlen atmosferyczny, a w oddychaniu beztlenowym utleniony związek organiczny lub nieorganiczny.

Szczepy bakteryjne:

1. Staphylococcus albus

2. Streptococcus lactis

3. Escherichia coli

4. Salmonella typhimurium

5. Bacillus subtilis

6. Enterobacter aerogenes

3) Próba na wykrywanie katalazy

Do wykonania ćwiczenia użyj płytek z pożywką LB wysianych na poprzednich zajęciach.

Po inkubacji w 37°C na kolonie nakropić 3% r-r H₂O₂. Zaobserwuj wydzielanie się pęcherzyków tlenu (pienienie się).

4) Próba na redukcję azotanów

Nocne hodowle w/w szczepów w bulionie azotowym (8 ml), podziel na dwie części. Do jednej części dodaj odczynnika Griessa: 1 ml odczynnika (A), a następnie kroplami 1 ml odczynnika (B). Kolor czerwono-buraczkowy świadczy o redukcji azotanu do azotynu. Przy braku zabarwienia, w celu stwierdzenia, czy azotan został redukowany dodajemy do próbki odrobinę cynku (Zn) w pyle i ponownie dodajemy odczynnika (A) i (B). Jeśli teraz wystąpi czerwony kolor oznacza to, że cynk zredukował azotan do azotynu. Ponowny brak zabarwienia świadczy o tym, że reakcja zaszła dalej tzn. do amoniaku lub wolnego azotu.

Materiały:

• bulion azotowy:

wyciąg mięsny 1000 ml

pepton 5 g

KNO₃ 0,2 g

pH = 7,5

• odczynnik Griessa:

(A) kwas sulfanilowy 8 g

5N kwas octowy 1000 ml

(B) α-naftylamina 5 g

5N kwas octowy 1000 ml

5) Oznaczanie stosunku bakterii do tlenu

Za pomocą prostych metod hodowlanych można sprawdzić szczepy pod względem ich stosunku do tlenu.

Posiej po 2 probówki bulionu LB (5 ml) każdym z w/w szczepów dodając uszko ezy. Powierzchnie jednej z dwóch posianych pożywek zalej ok. 1,5 ml płynnej parafiny.

C) Procesy życiowe bakterii

Szczepy bakteryjne:

1. Staphylococcus albus

2. Escherichia coli

3. Salmonella typhimurium

4. Proteus vulgaris

5. Enterobacter aerogenes

6) Oddziaływanie drobnoustrojów na węglowodany

Fermentacja cukrów prostych

Próby na fermentację cukrów prostych przeprowadza się w probówkach z podłożem, które oprócz badanego cukru i składników niezbędnych do wzrostu, zawiera wskaźnik określający odczyn środowiska (czasami również fermentnik Dürhama). Rozkład cukrów określa się na podstawie zakwaszenia podłoża (zmiana zabarwienia wskaźnika) i ewentualnego wydzielania gazów zbieranych w fermentniku.

Do probówek zawierających wodę peptonową (5 ml) i jako jedyne źródło węgla glukozę, laktozę lub sacharozę oraz wskaźnik ( błękit bromofenolowy), wysiej w/w szczepy. Pamiętaj żeby pozostawić jedną probówkę kontrolną (sama pożywka bez bakterii). Po 24godz. inkubacji w 37°C zaobserwuj zmiany w kolorze podłoża w porównaniu z próbkami kontrolnymi.

Rozkład skrobi ( na bieżących ćwiczeniach tylko wysiew bakterii)

Płytkę z agarem skrobiowym (agar odżywczy + 1,2% skrobi rozpuszczalnej) podziel na sektory i posiej badane szczepy (Proteus vulgaris na osobnej płytce). Po 24 godz. inkubacji w 37°C na powierzchnię płytki nalej płyn Lugola. W przypadku rozłożenia skrobi przez bakterie kolor podłoża pozostanie bez zmian. Gdy skrobia pozostanie w podłożu nastąpi zmiana jego barwy na kolor fioletowy.

7) Oddziaływanie drobnoustrojów na białko

Rozkład kazeiny

Płytkę z agarem mlecznym (agar odżywczy + 10% odtłuszczonego mleka) podziel na sektory i posziej badane szczepy (Proteus vulgaris na osobnej płytce). Po inkubacji zaobserwuj strefę przejaśnienia wokół kolonii rozkładających kazeinę mleka.

8) Wytwarzanie siarkowodoru

Bulion LB (5 ml) posiej badanymi szczepami i umieść pod korkiem, w sposób jałowy, pasek bibuły nasyconej octanem ołowiu. Po kilku dniach inkubacji zaobserwuj zmianę zabarwienia paska.