W Diagnostyka molekularna chorób 10 09r



GENETYKA 10 PAŹDZIRNIKA 2009


WYKŁADY 2


DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA CHORÓW GENETYCZNYCH


Pozyskiwanie DNA do celów diagnostycznych:

Izolacja DNA- wysoka wydajność i czystość dna

Analiza DNA

Marniał do izolacji DNA

Pełna krew obwodowa 2-3 ml.

Kom. płynu owodniowego (fibroblasty płodu)

Cebulki włosowe

Plamy krwi i nasienia


Przechowywanie materiału biologicznego

krótkie przechowywanie temp +4 stopnie

dłuższe przechowywanie, zamrożone w - 10 st.

materiał suchy temp. pokojowa, chronić przed wilgocią.


Etapy izolacji DNA:

Rozdrobnienie tkanki stałej, lizo erytrocytów i leukocytów

denaturacja i hydroliza białek- trawienie proteinazą K

usunięcie białek i innych zanieczyszczeń - ekstrakcja fenolem

zagęszczenie DNA- precypitacja

wytrącanie DNA z fazy wodnej 96% etanolem lub izopropanolem

Rozpuszczenie DNA


Izolacja RNA- podobny schemat jak w DNA, ale trzeba zapewnić specjalne warunki, zabezpieczenia RNA. W tym celu wprowadza się inhibitory, stosuje sie metodę dezintegrujące komórki i inaktywujące RNA


Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR)- enzymatyczna amplifikacja in vitro fragmentu genomowego DNA o długości od kilkudziesięciu do kilku tysięcy par zasad


startery- jednoniciowe, oligonukleotydy ok 20 zasad.

Syntetyzowanie chemicznie....


Amplifikacja DNA w reakcji PCR odbywa sie przy udziale termo stabilnej polimerazy DNA wyizolowanej z termofilnych bakterii

- reakcja PCR prowadzona jest w cyklach powtarzających sie 20-40 razy

- wszystkie cykle składają sie z 3 etapów, z których każdy zachodzi w innej temperaturze i trwa ok..

- reakcja w probówce umieszczonej w bloku …., który umożliwia szybką precyzyjną zmianę temperatury, właściwą dla poszczególnych etapów procesu PCR

Obj. mieszaniny 20-40 ml


Skład mieszaniny reakcyjnej

- matrycowy DNA (lub RNA)

- 2 startery komplementarne do matrycy

- transmobilna polimeryzacja tag

- odpowiedni bufor



Etapy reakcji PCR

- denaturacja matrycowego DNA w temp ok 94 oC

- przyłączanie starterów do jednonicowych matryc DNA w temp. 40-68 oC

- synteza DNA - wydłużanie starterów przy udzielne polimerazy w temp 72 oC po zakończeniu elongacji do temperatury denaturacji DNA rozpoczyna kolejny cykl

- Po każdym cyklu następuje podwojenie amplifikowanego materiału. Nowo powstające produkty PCR są również matrycą do syntezy następnych


Zastosowanie reakcji PCR

- wykrywanie patogenów infekcyjnych: bakterii, wirusów, pasożytów

- wykrywanie zmian w genowym DNA w chorobach genetycznych

- preimplantacyjna i prenatalna diagnostyka chorób genetyczny

- wykrywanie uszkodzeń DNA

- wykrywanie predyspozycji do chorób nowotworowych

- wykrywanie polimorficznych sekwencji DNA na potrzeby identyfikacji indywidualnej- ustalenie ojcostwa, identyfikacja sprawców przestępstw

- badanie głównego systemu z godności tkankowej w celu prawidłowego dobrania dawców i biorców przeszczepów.


Enzymy restrykcyjne (restryktazy)

- enzymy restrykcyjne to endonukleazy przecinające DNA w ściśle określonych miejscach (sekwencjach)

- naturalne elementy systemu obrany komórek bakteryjnych przed obcymi kwasami nukleinowymi


Klasy enzymów:

I - aktywność nukleazy i metylazy

- zależna od ATP Mg 2+ s- adenozylometaniny

- przecinają DNA w miejscu odległym od rozpoznania sekwencji


III- zależy od ATP Mg 2+ s-adenozylametoniny

- przecinają DNA poza rozpoznaną sekwencją (ok 25 nukleotydów)


II- zależne od Mg 2+


PFLP- polimorfizm dł. fragmentow restrykcyjnych

Polimorfizm- zmnienność genetyczna wynikająca z mutacji i może dotyczyć:

- pojedynczego nukleotydu- SNP (ang. single- nucleotiole polymorphism)

- dłuższej powtarzającej się wielokrotnie określonej sekwencji satlitarnej

- polimorfizm jest wykrywany jako zmienność długości fragmentów restrykcyjnych RFLP.


Analiza RFLP

- wykrywa różnice między długością fragmentów DNA pociętych restryktazami, które powstają w wyniku mutacji i tworzą lub eliminują rozpoznawane poprzez te enzymy

- pozwala na wykazanie powiązań rodzinnych poprzez porównywanie charakterystycznych wzorów.


SSCP- polimorfizm komformacji pojedynczych łańcuchów DNA sprawdzamy czy jest jakaś mutacja. pojedyncze nici DNA równej długości, ale różnią się sekwencjami a przez to strukturą trójwymiarową (konformacją) SS DNA mogą wykazywać różnicę w ruchliwości elektrofonetycznej.

różnice w sekwencji spowodowane mutacja punktową, wywołuje zróżnicowaną migrację i charakterystyczne położenie w żelu poliakrylamidowymi.


Hybrydacja z sondą molekularną

Hybrydacja jest to zdolność dwóch komplementarnych lub częściowo komplementarnych cząstek kwasów nukleinowych do tworzenia stabilnej hybrydacji o zasadach połączonych w pary powstaje hybryda (dupleks).


Hybrydacja może zachodzić między dowolnymi dwoma jedno niciowymi łańcuchami kwasów nukleinowych

-DNA:DNA

-DNA:RNA

-RNA:RNA


Łącznie z sondą zachodzi według reguły komplementarności zasad.


Sondy molekularne

Krótkie, jednoniciowe DNA

Sonda ma powinowactwo do ściśle określonej sekwencji DNA, wyposażone jest w znak umożliwiający jej wykrywanie po zakończeniu reakcji hybrydacji


Hybrydyzacja metodą Southerna

Zadaniem tego typu hybrydyzacji jest identyfikacja poszukiwanych sekwencji DNA w mieszaninie identyfikacja poszukiwanych sekwencji DNA w mieszaninie fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi

Metodę Southerna stosuje się do badania polimorfizmu DNA.


Etapy hybrydacji


Hybrydyzacja metoda Holter…




5




Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
WYKŁADY GENETYKA W Podłoże molekularne chorób $ 10 09r
ĆW Cytogenetyka III Choroby$ 10 09r
Diagnostyka molekularna chorob nowotworowych
WYKŁADY GENETYKA W.Badanie molekularne 10.10.09r....
ĆW Mutacje Choroby genetyczne 3 10 09r
Diagnostyka laboratoryjna chorób serca i mięśni poprzecz (2)
Cukrzyca przezywaczy, Diagnostyka biochemiczna chorob okresu przejsciowego bydla
a22 10 09r
Diagnostyka obrazowa w chorobach reumatycznych, reumatologia
Organizacja Laboratorium Usługowego1B, studia-biologia, Studia magisterskie, Mgr sem III, Diagnostyk
HBV - Diagnostyka, Medycyna, Choroby zakaźne
21 10 09r
Diagnostyka laboratoryjna chorob trzustki oraz cukrzycy koni i bydla mlecznego
22 10 09r
Metodologia?dań naukowych 10 09r
Diagnostyka molekularna niedobo Nieznany
WYKŁADY GENETYKA Genetyka diagnostyka pl. 21.11.09r