Wirusy – ogólna charakterystyka

• obligatoryjny pasożyt wewnątrzkomórkowy

replikacja tylko w żywej, wrażliwej komórce (tropizm) !!!

• brak enzymów metabolicznych – korzysta z energii i mikromolekuł komórki gospodarza

• enzymy tylko do replikacji – polimerazy: DNA, RNA zależna od DNA, DNA zależna od RNA (odwrotna transkryptaza), RNA zależna od RNA

wirion – pojedyncza kompletna cząstka wirusa, zdolna do zakażenia komórki

wirusy defektywne, niekompletne – do namnożenia wymagają udziału innego wirusa, np.. HDV z HBV

Wirusy - budowa

• wielkość: 20 – 300 nm niewidoczny w mikroskopie świetlnym, tylko elektronowym

• struktura:

* RNA lub DNA - genom, rdzeń; kolisty lub liniowy; jedno- lub dwuniciowy, zakaźny (powstają wirusy potomne) lub niezakaźny

* kapsyd (płaszcz) – adsorbcja i wnikanie do komórki, z kapsomerów - identyczne jednostki białkowe

nukleokapsyd - symetria helikalna(wydłużona) lub ikozahedralna (kulista)

* osłonka – u helikalnych i niektórych kulistych - adsorpcja do komórki

^ białka wirusowe – strukturalne: związane z genomem, kapsydem, osłonką, enzymami

^ enzymy - polimerazy niezbędne do replikacji, jeżeli genom wirusa nie jest „czytany” przez polimerazy komórki zakażonej,

- proteazy, endonukleazy, ligazy

Osłonka – adsorbcja do komórki

• 2 warstwy lipidowe +/- glikoproteiny, lipoproteiny (dodatkowe wypustki)

* HIV: gp 120 – receptor CD4 limfocyta T

* wirus grypy: hemaglutynina – sialyloligosacharyd na krw. czerwonej lub bł. śluz.

* HBV: Pre-S – receptor na hepatocycie

* EBV: gp 350 – CD21(CR2) limfocyt B

* wirus wścieklizny: białko G – receptor cholinergiczny na kom. nerw.

* rinowirus – ICAM-1 na bł. śluzowej nosa

Klasyfikacja wirusów

• homologia kwasu nukleinowego:

* wirusy DNA

* wirusy RNA

• cechy kwasu nukleinowego – typ replikacji DNA DS, DNA SS, RNA SS+, RNA SS-, RNA DS-

• wygląd, kształt, wielkość

• symetria nukleokapsydu

• obecność lub brak osłonki

• wrażliwość na temperaturę, detergenty, naświetlanie..

niektóre nazwy wirusów pochodzą od nazw chorób, miejsca, gdzie dokonano izolacji, nazwiska odkrywcy, cech epidemiologicznych....

Wirusy - replikacja

• adsorpcja – na komórce setki receptorów, po wniknięciu wirusa komórka jest oporna na zakażenie innym wirusem!!!

• wnikanie – endocytoza (pinocytoza, wiropeksja) – wirus wpukla się z receptorem

. fuzja – wirus traci osłonkę (zostaje w błonie kom.), wnika nukleokapsyd

. odpłaszczenie, odbiałczenie – zostaje sam kwas nukleinowy

• eklipsa – replikacja DNA lub RNA, synteza białek wirusa

. zróżnicowana w zależności od kwasu nukleinowego

. może zachodzić w jądrze lub cytoplazmie

. różne efekty cytopatyczne: ciałka wtrętowe, transformacja, aberracja chromosomów (różyczka – wady wrodzone)

. trwa różnie długi okres – zakażenie utrzymujące się (persystentne, latentne)

• dojrzewanie – tworzenie zakaźnego wirionu, nagie wirusy - w jądrze lub cytoplazmie, inne przechodzą przez błonę i tworzą osłonkę

• uwalnianie - . przez pączkowanie – wirusy osłonkowe,

liza komórki – wirusy nagie

Wirusy DNA

Poxviridae: Variola - ospa prawdziwa Vaccinia – krowianka

Adenoviridae – adenowirusy, wiele serotypów – zap. gardła, spojówek, żołądka, jelit

Papovaviridae: Human papilloma virus – HPV – brodawki (typy 6,11,16,18 – dysplazja)

Parvoviridae: Parvovirus – typ B 19 – zap. żoładka i jelit, rumień zakaźny

Hepadnaviridae: HBV – zapalenie wątroby typu B

Herpesviridae

• H.simplex – opryszczka (zak. latentne)

HSV-1 (oralny)

HSV 2 (genitalny)

• Varicella-zoster – VZV - ospa wietrzna, półpasiec

• Cytomegalovirus – CMV - cytomegalia

• Epstein-Barr – EBV – monoukleoza zakaźna, chłoniaki, rak jamy nosowo-gardłowej

• Human Herpes typy 6,7,8 – limfotropowe, w AIDS

Wirusy RNA

Orthomyxoviridae: Influenza A, B, C ( łagodne) – grypa

Paramyxoviridae:

Parainfluenza – zap.gardła, krtani, oskrzeli, płuc

Mumps – świnka

Measles – odra

Respiratory syncytial v. RSV – zap.płuc u małych dzieci

Picornaviridae: grupa enterowirusów –

Polio, Coxsackie A, B, Echo – zak.OUN, m.sercowego, bł.śl.

Hepatitis A virus HAV - zap. wątroby

Rhinovirus – ponad 100 serotypów, przeziębienia

Coronaviridae: - Coronavirus – przeziębienia, SARS

Rhabdoviridae: Lyssavirus – wścieklizna

Retroviridae: Human immunodeficiency virus – HIV 1, 2 – ARC, AIDS

Human Tcell lymphotropic virus – HTLV 1, 2 – białaczki

Togaviridae: Rubella virus - różyczka

Reoviridae: Rotavirus – biegunki u małych dzieci

Filoviridae: wirusy Marburg, Ebola – gorączki krwotoczne

Bunyaviridae: wirus Hantan

Calciviridae: wirus Norwalk

Flaviviridae: żółta febra, Dengue, kleszczowe zapalenie mózgu

inne: HCV, HDV, HEV

arbowirusy – przenoszone przez kleszcze, komary, należą do różnych rodzin

Wirusy – wrażliwość na czynniki fizyczne i chemiczne

• większość jest inaktywowana w 50-60°C, 30 min. nie HBV, papovavirusy (HPV), priony

• niskie temperatury – stabilne

• wysuszenie – różnie

• eter, chloroform – otoczkowe wrażliwe (HSV)

• środki dezynfekujące: związki chloru, glutaraldehyd

• antybiotyki przeciwbakteryjne - niewrażliwe

Izolacja i identyfikacja wirusa

wady: trwa kilka dni, tygodni, droga

• hodowle komórkowe:

• zarodki ptasie

• wrażliwe zwierzęta

!!! ostateczna identyfikacja:

• odczyny serologiczne: test neutralizacji - NT wiązania dopełniacza – OWD immunofluorescencji - IF

zahamowania hemaglutynacji Elisa

• techniki molekularne - PCR

Izolacja – hodowle komórkowe

• pierwotne – nabłonki, fibroblasty, kom. zarodka - kilka pasaży Polio, Influenza

• linie komórkowe – fibroblasty mysie, ludzkie, 30-50 pasaży Rhinovirus, HSV, VZV, CMV

• hodowle ciągłe (ustalone) – kom. nowotworowe: HeLa, Hep-2 Adenovirus, RSV

obserwowane zmiany:

* efekt cytopatyczny – Polio, Adeno, HSV, CMV, VZV, RSV

* efekt łysinkowy - Polio

* hemaglutynacja – Influenza

* hemadsorpcja -Parainfluenza

• zarodki ptasie 9-15 dni:

* woreczek żółtkowy – chlamydie, riketsje

* błona kosmówkowo-omoczniowa - Herpes, ospa

* jama owodni, jama omoczni – grypa (odczyn hemaglutynacji)

• wrażliwe zwierzęta

* myszy, oseski mysie (Coxackie, wścieklizna),

* chomiki (arbowirusy),

* małpy (wirus żółtej febry)

* świnki, króliki

Bakteriofagi – wirusy związane z Procaryota

struktura: dsDNA or ssRNA or ssDNA + osłonka białkowa

  „strzykawko”-podobna (ogonek i główka) wiążąca się do receptorów na powierzchni komórki, następnie „wstrzykiwana” do komórki

Bakteriofagi

• fagi lityczne – produkują liczne kopie zabijające komórki, w efekcie liza komórki

• profagi – w komórce dają stan lizogenii, nie lizy, replikacja kwasu nukleinowego faga następuje z replikacją DNA komórki

* bakterie lizogenne = „noszące” profaga, może on warunkować produkcję np. toksyny błoniczej

* stan lizogenii może przejść w stan lizy

*wrażliwość bakterii na bakteriofagi wykorzystywana jest do typowania bakterii 

Prion – proteinaceus infectious particle lub virion

• Prusiner 1981 – nazwa nowej klasy patogenów: białko zakaźne odpowiedzialne za powolne choroby zwyrodnieniowe mózgu:

• kuru – drżenie, spożywanie mózgu zmarłych (forma rytualnego kanibalizmu, plemię Fore, Papua, Nowa Gwinea), Gajdusek przeniósł na szympansy zakażając wyciągiem z mózgu chorych ludzi

• choroba Creutzfelda-Jacoba – pojedyncze zachorowania w świecie, postępujące otępienie, zaburzenia ruchowe, przeniesiono na szympansy

• choroba Gerstmanna-Sstrausslera-Scheinkera – wrodzona, dziedziczona w sposób autosomalny dominujący

• śmiertelna rodzinna bezsenność (FFI – fatal familial insomnia)

• scrapie – swędzenie, ocieranie, wyrywanie wełny, owce i kozy

• BSE – bovine spongiform encephalopathy (bydlęca encefalopatia gąbczasta), choroba wściekłych krów

• encefalopatia norek, jeleni, łosi..

Priony - charakterystyka

• białko PrP-sc – zakaźne białko o m.cz. 27000-30000, nieprawidłowa izoforma PrP-c, białka błonowego występującego fizjol. w komórkach, różnią się organizacją przestrzenną, nie budową aminokwasową

• oporne na trawienie proteazami

• oporne na promieniowanie UV

• gromadzi się wewnątrz komórki, w pęcherzykach cytoplazmatycznych – nie wzbudza żadnego typu reakcji immunologicznej

• powstają zmiany gąbczaste, płytki amyloidowe, odczyn astrocytów bez cech reakcji zapalnej wokół obszarów zwyrodnienia

• PrP-sc po wprowadzeniu do komórki zmienia PrP-c ?

Priony - diagnostyka

• badanie histopatologiczne mózgu

• przyżyciowo – objawy kliniczne, potwierdzenie w ok.20%, (możliwe inne przyczyny), nie ma metody wczesnego wykrycia

• testy w BSE:

*szybkie

- Prionic Western blott – trawienie proteazą, potem blotting

- Elisa (Bio-Rad, Enfer Tech),

- 5 nowych w badaniach

*próby biologiczne - domózgowe zakażenie myszy (200x czulsze niż per os) – 0,01-0,1g tkanki, domózgowe zakażenie cieląt (1000x czulsze niż myszy) wynik po 7 latach

Diagnostyka zakażeń wirusowych

bezpośrednie:

• izolacja i identyfikacja wirusa – metoda referencyjna dla wszystkich innych metod – gold standard!!!

• wykazanie antygenów wirusowych w materiałach klinicznych

* metody mikroskopowe

* metody immunologiczne

* metody genetyczne

pośrednie:

• diagnostyka serologiczna – wykrycie swoistych przeciwciał w surowicy krwi

badania wirusologiczne - cel:

- określenie czynnika etiologicznego niektórych zakażeń – hepatitis, meningitis, biegunki

- większość zakażeń – charakterystyczne objawy

- epidemiologia, ustalenie typów szczepionkowych – np. grypa

- znaczenie rokownicze – HBV, HCV

- nie – celowane leczenie

Diagnostyka wirusologiczna – pobieranie materiału

• z miejsca, gdzie obserwuje się proces chorobowy

• w ostrym okresie choroby

• krew, płyn mózgowo-rdzeniowy, plwocina, popłuczyny z nosa, oskrzeli, bronchoaspirat, mocz, kał, zmiany skórne, ze spojówek, płyn owodniowy

• w przypadku trudności z izolacją wirusa z narządu docelowego (wątroba, tkanka mózgowa) pobieramy z innych miejsc – wrota wnikania lub wydalania: drogi oddechowe, kał, mocz

• transport próbki: w niskiej temp. -4^o C, -70^o C

• podłoża transportowe VIB, SPG (inne niż do bakterii)

• wstępne opracowanie materiału (dodanie antybiotyku)

Bezpośrednie wykazanie wirusa w materiale

• ciałka wtrętowe (mikroskop świetlny) - wścieklizna, HSV, CMV, ospa, odra

• cząstki wirusa (mikroskop elektronowy) - w kale – Rota, Norwalk, HAV, Ebola, w moczu CMV, węzły chłonne HIV, płyn mózg. rdz. – Herpes, Mumps

• wykrywanie antygenów wirusowych lub składników strukturalnych (białka, geny)

* metody immunologiczne z użyciem przeciwciał monoklonalnych

- immunofluorescencja IF (mikroskop fluorescencyjny) - wścieklizna, grypa,

odra, HSV, VZV, CMV, adenowirusy, ospa

- testy immunoenzymatyczne Elisa – HBV, HAV, RSV,CMV

- aglutynacja lateksowa – Rotavirus w kale

- western blot – HIV

* techniki molekularne

- hybrydyzacja in situ – sondy genetyczne radioaktywne i nieradioaktywne

CMV, HPV,HSV

- PCR – wykrycie HCV-RNA

- RT-PCR

Diagnostyka serologiczna wykrycie swoistych przeciwciał w surowicy

wartość diagnostyczną mają badania wykonywane co najmniej 2 x w odstępach 2-3 tygodni!!!

w ostrej fazie choroby i później

• testy serologiczne – NT (neutralizacji), IIF (immunofluorescencji pośredniej), Elisa (immunoenzymatyczny), OWD (odczyn wiązania dopełniacza), OZHA (odczyn zahamowania hemaglutynacji)

• interpretacja wyników:

* IgM – u niemowląt: wskazuje na zakażenie wrodzone lub okołoporodowe

* IgM - u dorosłych: świeże zakażenie lub reaktywacja zakażenia latentnego

* IgG – badanie 1x – przebyte zakażenie bez możliwości określenia czasu

* IgG – badanie 2x – wzrost miana 4 x – tzw. serokonwersja , potwierdzenie aktualnego zakażenia

* IgA – utrzymuje się zakażenie przewlekłe

Charakter zakażenia CMV

pierwotne – wrodzone: przezłożyskowe -okołoporodowe

nabyte: bezpośredni kontakt, transplantacja, transfuzje

wtórne (reaktywacja zakażenia latentnego, zakażenie nowym szczepem) - spadek odporności: leczenie immunosupresyjne, choroby nowotworowe, AIDS

Grypa- zakażenie drogą kropelkową, uogólnione!!

• Influenza virus A, B, C (RNA SS-), glikoproteiny:

hemaglutynina H (wniknięcie do komórki)

neuraminidaza N (uwolnienie potomnych wirionów)

• duża zmienność:

* antigenic drift (A, B) - przesunięcie antygenowe, niewielkie, ogniska zakażenia z powodu braku odporności w populacji co kilka lat

* antigenic shift (A) – skok antygenowy, wymiana całego segmentu RNA, nowy podtyp,

pandemie: 1918 H1 N1

1957 H2 N2

1968 H3 N2

1978 H1 N1

1997 H5 N1 – ptasia grypa

• szczepionka: typ A (H1 N1, H3 N2), typ B

Grypa – diagnostyka, cel: wykrycie typu wirusa i przygotowania „dobrej szczepionki”

* materiał: popłuczyny z jamy nosowo-gardłowej

* izolacja wirusa:

^ 9-13 dniowy zarodek kurzy – jama omoczniowa,

inkubacja 2-3 dni,

aglutynacja krwinek kurzych,

OZH, OWD – typ wirusa

^ hodowla komórkowa z nerki psa – jw.

* wykrycie antygenu w błonie śluzowej nosa – szybkie testy, weryfikacja IF

*Inaktywowana szczepionka przeciwko grypie (rozszczepione wiriony - split) (na sezon 2004/2005).

Zawiesina do wstrzykiwań w ampułko-strzykawce:

Fluarix (GlaxoSK), Vaxigrip (Chiron BehringPasteur Sanofi), Begrivac (Chiron Behring)

*Podjednostkowa sub-unit (oczyszczona hemaglutynina i neuraminidaza): Influvac (Solway Pharma)

*Żywe, atenuowane wirusy (USA)

Skład: 2004/5 A/New Caledonia/20/99 (H1N1)	wariant A/New Caledonia/20/99 (IVR-116)	15 µg**
A/Fujian/411/2002 (H3N2)	wariant A/Wyoming/3/2003 (X-147)	15 µg**
B/Shanghai/361/2002	wariant B/Jiangsu/10/2003	15 µg** w 0,5 ml dawce
*namnażane na zarodkach kurzych, **hemaglutynina

2005/2006: A/New Caledonia/20/99, A/California 7/2004, B/Shanghai/361/2002

2006/2007: A/New Caledonia/20/99, A/Visconsin 67/2005, B/Malaysia/2506/2004

2007/2008: A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1) B/Malaysia/2506/2004

Ptasia grypa zwykle atakuje wyłącznie zwierzęta, jednak sporadycznie notowane są przypadki zachorowań wśród ludzi. W 1997 r. w Hongkongu rozpoznano pierwsze przypadki zakażenia wirusem A(H5N1) u 18 osób, z których 6 zmarło. (aktualnie 88). Badania genetyczne dowiodły wówczas związku tych zachorowań z ptasią grypą występującą u drobiu. Ocenia się, że wybicie ok. 1,5 mln ptaków pozwoliło zapobiec większej epidemii u ludzi.

W 2003 r. w Hongkongu wirus H5N1 wywołał 2 przypadki zachorowania i 1 zgon. W tym samym roku wirus ptasiej grypy H7N7 w Holandii spowodował śmierć lekarza weterynarii i objawy grypy u 83 osób.

Na początku stycznia 2004 wirus ptasiej grypy A(H5N1) wywołał epidemię ptasiej grypy u drobiu w dwóch prowincjach na południu Wietnamu. Zakażenie, które rozprzestrzenia się bardzo szybko i jest w 100% śmiertelne, spowodowało śmierć 40 tys. ptaków i ubój 30 tys.

Wirusy grypy są bowiem bardzo niestabilne i łatwo dochodzi do ich mutacji. Eksperci WHO ostrzegają, że ludzka odmiana wirusa ptasiej grypy mogłaby wywołać epidemię o skutkach znacznie groźniejszych niż SARS.

Wścieklizna – choroba śmiertelna

• wirus wścieklizny – RNA SS- neurotropowy

• rezerwuar: dzikie zwierzęta – lis, pies, nietoperze, nie ma w Japonii, W.Brytanii

• wydalany jest ze śliną, także u zwierząt bezobjawowych?

• zakażenie: po ugryzieniu, oślinieniu, wdychaniu zakażonego aerozolu (jaskinie – nietoperze wampiry)

• powinowactwo – tkanka mózgowa, transport drogą nerwów, tygodnie – 2 lata

• szczepionka !!! – skuteczna, jeżeli okres inkubacji wynosi > 30 dni

• diagnostyka – badanie zwierzęcia!!! – zakłady higieny weterynaryjnej

* obserwacja zwierzęcia przez 10 dni – brak objawów, nie ma obawy

* badanie głowy zwierzęcia – wykrycie w tk. mózgowej ciałek Negriego – IF, PCR

* zwierzę żywe – izolacja wirusa ze śliny – zakażenie domózgowo myszy

• szczepionka - inaktywowana hodowana na diploidalnych komórkach ludzkich

• surowica odpornościowa – podać do 72 godz. jeżeli pogryzienie w okolicy twarzy

Wirusowe zapalenia wątroby

• HAV – fekalno-oralna, 7-10, 15-20 lat, wirus w kale, IgM w surowicy, objawy ostre, niski poziom higieny, zagęszczenie, szczepionka Havrix A

• HBV (DNA) – parenteralna, seksualna, perinatalna, narkotyki, różne markery, objawy ostre lub przewlekle, Engerix B

• HCV – nonA-nonB, parenteralna, narkotyki, objawy poronne, przewlekłe, IgG, RNA-PCR, brak szczepionki, problem!!!

• HDV – czynnik delta, parenteralna, narkotyki, objawy ostre, na ogół razem z HBV

• HEV- fekalno-oralna, objawy ostre, zanieczyszczona woda

• HFV, HGV

Markery HBV: HbsAg, HBeAg, anty-HBs, anty-HB-c, anty-HBe

wzw B – mimo szczepień - wciąż problem ogólnoświatowy
350 mln przewlekle zakażonych –marskość, pierwotny rak wątroby

• Szczepionki: HBsAg – białko ilościowo dominujące na powierzchni wirusa

obecnie zarejestrowane są 4 szczepionki monowalentne, 5 skojarzonych

Engerix B, Hepavax Gene

preparaty rekombinowane – zawierają rekombinowany HBs

produkowany przez Saccharomyces cerevisiae lub Hansenula polymorpha

• Odpowiedź: humoralna i komórkowa ? (utrzymuje się 15 lat mimo niekiedy braku przeciwciał), 2-10% nie wytwarza odpowiedzi

w praktyce bada się przeciwciała anty-HBs – minimalny poziom ochronny 10 IU/l

* dobrze odpowiadające , wysokie miano – responder

* słabo odpowiadające, niskie miano – low-responder

* nie odpowiadające – non-responder

• Obniża immunogenność: starszy wiek, HIV, niewydolność nerek, cukrzyca, otyłość, palenie tytoniu

HIV 1 i HIV 2 u ludzi, u małp SIV – duże podobieństwo

Genom HIV – duża zmienność nawet pomiędzy izolatami od tej samej osoby !!

atakuje pw. T CD4, makrofagi, monocyty, kom.Langerhansa, dendrytyczne

Zakażone komórki obecne w: szpik, śledziona, grasica, węzły chłonne, płuca, mózg, jelita, krew, nasienie, szyjka macicy, napletek

Testy przesiewowe: * EIA (immunoenzymatyczne) – wykrywają ogólnie przeciwciała (antyHIV-1,2; antyHIV1,2,0)

* przeciwciała antyHIV i/lub antygen HIV (p24) (testy IV generacji)

* przeciwciała antyHIV w klasie IgM (test III generacji)

Testy potwierdzenia: * Western blot –przeciwciała anty HIV-1: rdzeniowe - p17, p24, p55; polimerazy - p31,p51,p66; otoczki - gp41, gp120/160 (białka HIV uzyskane przez lizę cząstek wirusa są rozdzielone elektroforetycznie na nitrocelluozowym pasku testowym) -

* LIA – line immunoassay – różnicuje antyHIV-1 i antyHIV-2

Hodowla – trudna: krwinki białe chorego+linia komórek T wskaźnikowa +PHA