TRANSPORT BIAŁEK

W miarę wzrostu komórek zachodzącego w ich cyklu życiowym, organelle błonowe po­większają się przez wbudowywanie nowych cząsteczek a jeśli komórka dzieli się, to orga­nelle również się dzielą i rozdzielane są do dwóch komórek potomnych. Wzrost organelli wymaga dostawy nowych lipidów do rozbudowy błony i odpo­wiednich białek, zarówno białek błonowych, jak i rozpuszczalnych, wypełniających wnętrze organelli. Nawet w komórkach, nie dzielących się, białka muszą być ustawicznie i precyzyjnie dostarczane do organelli, za­równo aby wymienić zdegradowane biał­ka organelli jak i zapewnić ciągłość wydzielania. Głównym problemem w rozbudowie i utrzymaniu organelli bło­nowych jest jak kierować nowo wytworzone białka do właściwej im organelli.

Białka tworzone w cytozolu są dostarcza­ne do różnych miejsc w komórce według specyficznych sygnałów zawar­tych w ich sekwencji aminokwasowej. Gdy białko znajdzie się pod właści­wym adresem, wnika do organelli.

Import białek do organelli jest zapewniony przez różne mechanizmy

Synteza wszystkich białek w komórce rozpoczyna się na rybosomach w cytozolu, w tym również rybosomach związanych z ER. Wyjątek stanowią nieliczne białka mitochondrialne i chloroplastowe, które są syntetyzowane na rybosomach wewnątrz tych organelli; jed­nak większość białek mitochondriów i chloroplastów jest tworzona w cytozolu i następnie importowana. Los cząsteczki białka syntetyzowanej w cytozolu zależy od jego sekwencji aminokwasowej, mogącej zawierać sygnał sortujący, kierujący białko do określonej organelli, w której jest ono po­trzebne. Białka, które takiego sygnału nie mają, pozostają stale w cytozo­lu. Różne sygnały sortujące kierują białka do jądra, mitochondriów, chloroplastów, peroksysomów i do ER.

Głównym problemem dla organelli błonowej importującej białko z cy­tozolu lub innej organelli jest przeprowadzenie białka przez błony, które są normalnie nieprzepuszczalne dla hydrofilowych makrocząste­czek. Uzyskuje się to drogami różnymi dla różnych organelli, przy czym wszystkie one wymagają nakładu energii.

1. Białka przechodzące z cytozolu do jądra są transportowane przez pory jądrowe, przenikające wewnętrzną i zewnętrzną błonę jądro­wą. Pory działają jak selektywne bramki, które aktywnie transportu­ją specyficzne makrocząsteczki, ale zarazem umożliwiają swobodną dyfuzję mniejszych cząsteczek.

2. Białka przechodzące z cytozolu do wnętrza ER, mitochondriów, chloroplastów lub peroksysomów są transportowane poprzez błonę organelli przez translokazy bialek mieszczące się w błonie. Odmiennie niż przy przej­ściu przez pory jądrowe, cząsteczka transportowanego białka musi się najpierw rozfałdować, aby „prześliznąć się" przez błonę. Bakterie mają w swej błonie komórkowej podobne translokazy białek.

3. Białka przemieszczające się od ER dalej oraz z jednego przedziału systemu błon wewnętrznych do przedziału drugiego są transporto­wane przez pęcherzyki transportujące, zawierające białek pochodzących z wewnętrznej przestrzeni, przedziału wyjściowego (np. ER), gdy odpączkowują od jego błony. Następnie pęcherzyki wprowadzają ten ładunek do drugiego przedziału, gdy ich błona ulega fuzji z błoną tego przedziału. W procesie tym przekazy­wane są również błonowe lipidy i białka.

Sekwencje sygnałowe kierują białka do właściwego przedziału

Typowy sygnał sortujący w białku jest ciągłym odcinkiem sekwencji amino­kwasów, zazwyczaj o długości 15-60 aminokwasów. Ta sekwencja sygna­łowa jest często (ale nie zawsze) usuwana z dojrzałego białka, gdy tylko spełniła swą funkcję sortującą. Sekwencje sygnałowe są zarazem niezbędne i wystarczające do skierowania białka do poszczególnej organelli. Sekwencje sygnałowe kierujące do tego samego przedziału mogą się między sobą bardzo różnić, chociaż mają tę samą funkcję.

Białka wnikają do jądra przez pory jądrowe

Otoczka jądrowa we wszystkich komórkach eukariotycznych jest per­forowana dzięki obecności porów jądrowych, przez które wszystkie cząsteczki wchodzą do jądra lub go opuszczają. Ruch po­przez pory zachodzi w obu kierunkach: nowo powstałe białka przeznaczo­ne do jądra wchodzą od strony cytozolu a cząsteczki mRNA i podjednostki rybosomowe, są eksportowane na teren cytoplazmy.

Por jądrowy jest dużą, skomplikowaną strukturą złożoną z ok. 100 róż­nych białek. Każdy por zawiera jeden lub więcej wypełnionych wodą kanałów, przez które swobodnie i nieselektywnie mo­gą przechodzić jedynie małe, rozpuszczalne w wodzie cząsteczki. Jednak większe cząsteczki (takie jak wszystkie RNA i białka) oraz kom­pleksy makrocząsteczek nie mogą przejść przez pory, jeśli nie niosą odpo­wiedniego sygnału sortującego. Sekwencję sygnałową (o nazwie sygnał lo­kalizacji jądrowej), która kieruje białko z cytozolu do jądra, tworzą zazwy­czaj jedna lub dwie krótkie sekwencje zawierające kilka dodatnio nałado­wanych reszt lizyny lub argininy.

Pierwszy etap oddziaływania nowo powstałego białka przeznaczonego do umiejscowienia w jądrze wymaga współdziałania innych białek cytozolowych. Te cytozolowe białka, o nazwie receptory importu jądrowego wią­żą się z sygnałem lokalizacji jądrowej i pomagają w jego wprowadzeniu do poru, oddziałując z włókienkami poru. Przyszłe białko ją­drowe zostaje następnie aktywnie przeniesione do jądra w procesie zużywającym energię hydrolizy GTP. Struktura środka poru jądrowego działa jak ściśle dopasowana przesłona fotograficzna; otwiera się ona tylko na tyle, aby umożliwić przejście kompleksu białkowego. Następnie recepto­ry importu jądrowego powracają do cytozolu, także przez por, i będą uży­wane ponownie.

Pory jądrowe transportują białka w ich całkowicie sfałdowanej konfor­macji i przenoszą składniki rybosomowe jako cząstki zespolone, co odróż­nia ten mechanizm transportu od mechanizmów wprowadzających białka do innych organelli.

Białka ulegają rozfałdowaniu przed wejściem do mitochondriów i chloroplastów

Zarówno mitochondria jak i chloroplasty zawierają własne genomy i wytwarzają kilka własnych białek, jednak większość ich białek jest kodowana przez geny jądrowe i importowana z cytozolu. Białka te mają zazwyczaj przy swym końcu N (aminokwasowym) sekwencję sygnałową, która umożliwia im wejście albo do mitochondrium, albo do chloroplastu. Białka są przeprowadzane równocześnie po­przez obie błony, wewnętrzną i zewnętrzną, w miejscach wyspecjalizowa­nych, w których obie błony są w ścisłym kontakcie ze sobą.

Tuż przed translokacją białko ulega rozfałdowaniu, a po translokacji zostaje odcięta sekwencja sygnałowa. Białka chaperony od strony wnętrza organelli pomagają przy przeniesieniu białka poprzez obie błony i przy ponownym sfałdowaniu biał­ka, gdy tylko znajdzie się ono w matriks organelli. Następny transport do poszczególnych miejsc w obrębie organelli, takich jak błona wewnętrzna, przestrzeń międzybłonowa lub błona tylakoidu, zazwyczaj wymaga obec­ności w białku dalszego sygnału, o nazwie sygnał sortujący, który zostaje odsłonięty często dopiero po odcięciu pierwszej sekwencji sygnałowej.

Wzrost i podtrzymanie struktury oraz funkcji mitochondriów i chloroplastów wymaga importu do ich błon nie tylko nowych białek ale i nowych lipidów. Uważa się że większość fosfolipidów błonowych jest importowana z ER, które stanowi główne miejsce syntezy lipidów w komórce. Fosfolipidy są transportowane do mitochondriów i chloroplastów przez hydrofilne białka przenoszące lipidy, które wyjmują cząsteczkę fosfolipidu z jednej błony i przekazują ją do innej.

Do retikulum endoplazmatycznego białka wchodzą w trakcie swojej syntezy

Retikulum endoplazmatyczne (ER) jest w komórce eukariotycznej naj­bardziej rozwiniętym systemem błonowym. Wszystkie białka przeznaczone do aparatu Golgiego, endosomów, lizosomów i błony komórkowej początkowo wnikają z cytozolu do ER. Poszczególne białka, które raz już weszły do światła ER lub do błony ER, nigdy do cytozolu nie powracają. Będą one przenoszone przez pęcherzyki transportujące z orga­nelli do organelli, a także z organelli do błony komórkowej.

Z cytozolu są przenoszone do ER dwa rodzaje białek:

1) białka roz­puszczalne, przechodzące w całości przez błonę ER i uwalniane do świa­tła ER;

2) przyszłe białka transbłonowe, przechodzące przez błonę ER tylko częściowo i ulegające w niej zakotwiczeniu.

Białka rozpuszczalne są przeznaczone albo do wydzielenia na powierzchni komórki, al­bo do pozostania w świetle organelli. Białka transbłonowe albo pozosta­ją w błonie ER, albo przechodzą (wraz fragmentami błony) do błon innych organelli bądź do błony komórkowej. Wszystkie te białka są początkowo kierowane do ER przez sekwencję sygnałową dla ER, będącą odcinkiem 8 lub więcej aminokwasów hydrofobowych, który bierze udział w procesie translokacji przez błony.

Odmiennie od białek wchodzących do jądra, mitochondriów, chloroplastów i peroksysomów większość białek wnikających do ER rozpoczyna przejście przez błonę ER, nim zostanie zakończona synteza całego łańcu­cha polipeptydowego. Możliwe jest to tylko wtedy, gdy rybosom syntety­zujący białko jest przyłączony do błony ER.

Tak więc w cytozolu istnieją pozornie dwie odrębne populacje rybosomów. Rybosomy związane z błoną, przyczepione do cytozolowej strony bło­ny ER (i zewnętrznej błony jądrowej), syntetyzujące białka przeznaczone do translokacji do ER, i wolne rybosomy, nie przyczepione do żadnej błony i syntetyzujące wszystkie inne białka zakodowane w jądrowym DNA. Oba te typy rybosomów są strukturalnie i funkcjonalnie identyczne, a różnią się tylko rodzajem białek, które w danym momencie wytwarzają. Gdy rybosom syntetyzuje białko zawierające sekwencję sygnałową dla ER, sekwencja ta kieruje rybosom do błony ER. W miarę translacji cząsteczki mRNA wiąże się z nią wiele rybosomów, tworząc polirybosom. W przypadku cząsteczki mRNA kodującej białko z sekwencją sygnałową dla ER, polirybosom zostaje sczepiony z błoną ER przez rosnące łańcuchy polipeptydowe, które zostają wprowadzane do wnętrza błony.

Białka rozpuszczalne są uwalniane do światła ER

Sekwencja sygnałowa kierująca białko do ER jest doprowadzana do błony ER przez dwa elementy molekularne. Są to: 1) cząstka rozpozna­jąca sygnał (SRP) - obecna w cytozolu i wiążąca sekwencję sygnałową dla ER, oraz 2) receptor SRP, umieszczo­ny w błonie ER.

Związanie sekwencji sygnałowej syntetyzowanego białka z SRP powoduje przyha­mowanie syntezy aż do momentu, gdy rybosom i zwią­zana z nim SRP połączą się z receptorem SRP w błonie ER. Po związaniu ze swym re­ceptorem, SRP pozostaje przy błonie krótki czas, potrzebny na odszukanie przez sekwencję sygnałową tworzonego białka, kanału translokacyjnego w błonie ER, i dopiero wtedy powraca do cytoplazmy; w tym momen­cie synteza białka zostaje wznowiona, a polipeptyd zostaje przesuwany jak nić do światła ER poprzez kanał translokacyjny w błonie. Tak wiec SRP i receptor SRP działają jako molekularne układy dopasowu­jące rybosomy (które syntetyzują białko zawierające sekwencje sygnałową dla ER) z dostępnymi w ER kanałami translokacyjnymi.

Z chwilą gdy kompleks rybosom-mRNA-SRP został przyłączony do błony ER, sekwencja sygnałowa, pełni dodatkową funkcje otwarcia ka­nału translokacyjnego i pozostaje związana z kanałem, w czasie gdy reszta łańcucha białka jest przesuwana poprzez błonę. W pewnych etapach translokacji sekwencja sygnałowa zosta­je odcięta przez peptydazę sygnałową występującą od strony wnętrza ER. Peptyd sygnałowy opuszcza wtedy kanał translokacyjny i ulega szybkiej degradacji do aminokwasów. Skoro tylko koniec C białka przejdzie przez błonę, białko zostaje w całości uwolnione do światła ER.

Sygnały start i stop wyznaczają ustawienie białka transbłonowego w dwuwarstwie lipidowej

Nie wszystkie białka wnikające do ER są uwalniane do jego światła (wnętrza); nie­które z nich pozostają zakotwiczone w błonie ER jako białka transbłonowe. Proces translokacji tych białek jest bardziej skomplikowany niż w przypadku białek rozpuszczalnych, ponieważ pewne części łańcucha polipeptydowego muszą być przeprowadzone na drugą stronę dwuwarstwy lipidowej, a inne nie.

W najprostszym przypadku, jakim jest białko transbłonowe o pojedyn­czym segmencie transbłonowym, sekwencja sygnałowa przy końcu N za­początkowuje translokację tak jak przy białkach rozpuszczalnych. Jed­nakże proces przenoszenia zostaje zatrzymany przez dodatkową sekwen­cję hydrofobowych aminokwasów — sekwencję stop-transfer znajdującą się na dalszym odcinku łańcucha polipeptydowego. Ta druga sekwencja zostaje przez przemieszczenie boczne (w płaszczyźnie błony) uwolniona z kanału translokacyjnego do dwuwarstwy lipidowej, gdzie tworzy α-helisę zakotwiczającą białko w błonie. Równocześnie sekwencja sygnałowa przy końcu N zostaje również przesunięta z kanału do dwuwarstwy lipido­wej i odcięta. W wyniku tego przemieszczane białko staje się białkiem transbłonowym o określonej orientacji — koniec N jest po stronie wnętrza ER, a koniec C po cytozolowej stronie dwuwarstwy lipidowej. Białko transbłonowe raz wprowadzone do błony nie może zmienić swojej orientacji, która zostaje zachowana podczas wszelkich dalszych procesów powstawania i fuzji pęcherzyków.

W pewnych białkach transbłonowych do rozpoczęcia translokacji przez błonę używana jest sekwencja umieszczona na wewnętrznych, a nie końco­wych odcinkach łańcucha polipeptydowego; sekwencja taka nie jest później usuwana. Taki system występuje w tych białkach transbłonowych, których łańcuch polipeptydowy przechodzi przez dwuwarstwę lipidową wielokrot­nie np. białka kanałów wapniowych, receptorów np. acetylocholiny czy rodopsyny.

Wniknięcie do ER jest zazwyczaj pierwszym etapem wędrówki białka do innego miejsca przeznaczenia, którym, przynajmniej początkowo, jest apa­rat Golgiego. Transport z ER do aparatu Golgiego i z aparatu Golgiego do innych przedziałów systemu błon wewnętrznych przebiega przez ciągłe pączkowanie i fuzję pęcherzyków transportujących. Drogi transportu prowadzonego przez pęcherzyki transportujące sięgają, albo od ER do błony komórkowej, albo od błony komórkowej do lizosomów. W czasie gdy białka i lipidy są trans­portowane wzdłuż tych dróg na zewnątrz, wiele z nich ulega różnego typu modyfikacjom chemicznym, takim jak dodanie bocznych łańcuchów cukrowcowych (zarówno do białek, jak i lipidów) i powstawanie wiązań dwusiarczkowych stabilizujących strukturę białek.

Większość białek ulega w ER kowalencyjnej modyfikacji

Większość białek jest po wejściu do ER modyfikowana chemicznie np. przez tworzenie wiązań dwusiarczkowych. Wiązania te, pomagają w stabilizacji struktury tych białek, chronią je przed degradacją enzymatyczną bądź zmianami pH.

Wiele białek wchodzących do światła ER lub do błony ER jest tam za­mienianych w glikoproteiny, przez kowalencyjne przyłączenia krót­kich bocznych łańcuchów oligosacharydowych. Ten proces glikozylacji jest prowadzony przez enzymy glikozylujące, znajdujące się w ER, a nieobec­ne w cytozolu. Oligosacharydy przyłączone do białek pełnią różne funkcje zależnie od rodzaju biał­ka. Mogą one ochraniać białko przed degradacją, przetrzymywać białko w ER, dopóki nie zostanie ono właściwie sfałdowane, lub też pomagać we wprowadzeniu białka do odpowiedniej organelli, służąc jako sygnał trans­portowy przy pakowaniu danego białka do odpowiednich pęcherzyków transportujących. Oligosacharydy, gdy znajdują się na powierzchni komór­ki, wchodzą w skład glikokaliksu - warstwy osłaniającej komórki i uczestniczącej w rozpoznawaniu jednej komórki przez in­ną, współtworząc tak zwany kod powierzchniowy komórki (układ antygenów zgodności tkankowej).

W obrębie ER boczne łańcuchy oligosacharydowe powstają przez dołączenie od razu, w całości rozgałęzionego „drzewka” oli­gosacharydowego, zawierającego 14 cukrów. Oligosacharydy są początkowo przyłączane do tkwiącego w błonie ER bardzo specyficznego lipidu o na­zwie dolichol i dopiero później przeniesione do amidowej grupy asparaginowej reszty białka, natychmiast gdy ta reszta wyłoni się do światła ER podczas translokacji. Dołączenie oligosacharydu zachodzi w pojedynczej reakcji enzymatycznej katalizowanej przez enzym błonowy, którego miejsce aktywne jest eksponowane w błonie ER od wnętrz cystern; to wyjaśnia, dlaczego białka cytozolowe nie są glikozylowane tą drogą. Takie przyłą­czenie łańcuchów grup oligosacharydowych do grupy NH₂ asparaginy w białku określa się jako wiązanie N-glikozydowe; jest ono najczęstszym typem wiązania występującym w glikoproteinach.

Wyjście z ER jest kontrolowane, aby zapewnić poprawną jakość wyprowadzanego białka

Pewne białka powstające w ER mają w nim zostać i tam działać. Utrzymy­wane są w ER (i wracają do ER, jeśli umknęły do aparatu Golgiego) przez czteroaminokwasową sekwencję przy końcu C, zwaną sygnałem po­zostawania (retencji) w ER, który jest rozpoznawa­ny przez błonowe białko receptorowe w ER i w aparacie Golgiego. Jed­nak większość białek wchodzących do ER jest przeznaczona do innych miejsc - są one pakowane w pęcherzyki transportujące, które odpączkowują z ER i ulegają fuzji z aparatem Golgiego, przy czym wyjście z ER jest wysoce selektywne. Białka nieprawidłowo sfałdowane pozostają aktywnie przytrzymane w ER przez związanie z białkowymi chaperonami znajdującymi się w świetle ER. Integracja z chaperonami przytrzymuje białka w ER aż do uzyskania odpowiednie­go sfałdowania; jeśli ono nie nastąpi, białka ulegną degrada­cji. Na przykład, cząsteczki przeciwciał są tworzone z czterech łańcuchów polipeptydowych, które w ER układają się w kompletną cząsteczkę przeciwciała. Przeciwciała złożone tylko częścio­wo zostają zatrzymane w ER, dopóki nie połączą się wszystkie cztery łań­cuchy polipeptydowe; każda cząsteczka przeciwciała nie ułożona w kom­pleks ulega w końcu degradacji. W ten sposób ER kontroluje jakość bia­łek, które eksportuje do aparatu Golgiego.

Jednakże czasem ten mechanizm kontroli jakości może być dla organi­zmu szkodliwy. Na przykład, mutacja wywołująca mukowiscydozę, prowadzi do powstania białka trans­portowego błony komórkowej, które jest nieco źle sfałdowane i jest z tego powodu zatrzymywane w ER. Białko takie funkcjonowałoby zupełnie prawidłowo, gdyby dotarło do bło­ny komórkowej. Zatrzymanie białka w ER prowadzi do rozwoju wyniszczającej choroby.

Białka są dalej modyfikowane i sortowane w aparacie Golgiego

Aparat Golgiego (AG) jest zazwyczaj umieszczony blisko jądra komórkowego, a w komórkach zwierzęcych także blisko centrosomu. Stanowi zbiór spłaszczonych woreczków błonowych (cystern) ułożonych jak stos talerzy. Każdy taki stos (diktiosom) zawiera 3-20 cystern. Ilość diktiosomów w komórce jest bardzo zmienna i zależy od typu komórki; niektóre zawie­rają tylko jeden duży diktiosom, inne zaś setki małych diktiosomów.

Każdy AG ma dwie różne strony: wejściową, czyli cis, i wyjścio­wą, czyli trans. Strona cis jest zorientowana ku ER, natomiast strona trans — ku błonie komórkowej. Najbardziej zewnętrzna cysterna każdej strony jest częścią sieci powiązanych między sobą błonowych rurek i pęcherzyków. Rozpuszczalne białka i błona wchodzą do sieci cis Golgiego poprzez pęcherzyki transportujące pochodzące z ER. Białka wędrują przez kolejne cysterny poprzez pęcherzyki transportujące, które odrywają się od jednej cysterny i łączą przez fuzję z następną. Białka opuszczają sieć trans Golgiego w pęcherzykach transportujących, kierowanych albo do po­wierzchni komórki, albo do innych przedziałów.

Uważa się, że obie brzeżne sieci strefy Golgiego cis i trans są istotne dla sortowania białek. Białka wchodzące do sieci cis mogą albo przechodzić dalej przez cysterny Golgiego, albo — jeśli mają sygnał retencji w ER —powrócić do ER. Białka występujące w strefie trans są sortowane według swego przeznaczenia albo do lizosomów, albo do powierzchni komórki.

Wiele grup oligosacharydowych dodanych do białek w ER ulega dal­szym modyfikacjom w aparacie Golgiego.

---