01 Inżynieria genetyczna - zajmuje się - odradzanie lub zapobieganie wyginieciu niektórych gat. Zw. - zwiekszenie wydajności rośl. I zw. - produkcja lekow i szczepionek - diagnozowanie chorob - badanie ekspresji genow - produkcja tkanek i narządów z Komorek multipotencjalnych
02 Eksperyment Griffitha - przeprowadzony w 1928 roku eksperyment polegał na demonstracji u bakterii zjawiska transformacji i wykazaniu istnienia czynnika transformującego leżącego u podłoża zaobserwowanego zjawiska.Frederick Griffith zajmował się badaniami nad szczepionką przeciw zapaleniu płuc, na które dziesięć lat wcześniej umierały setki tysięcy chorych podczas epidemii grypy „hiszpanki”. Badał dwa szczepy bakterii Pne ococcus: szczep S, które wytwarzały polisacharydową otoczkę i były zjadliwe oraz szczep R, które bez otoczki były bezbronne wobec układu immunologicznego organizmu. Wirulentne bakterie szczepu S po zabiciu przez podgrzanie i wstrzyknięciu myszom nie powodowały objawów chorobowych. Jednak jeśli martwe bakterie szczepu S wstrzyknięto razem z żywymi niezjadliwymi bakteriami szczepu R myszy umierały.
03 Procej transkrypcji DNA - polega na przepisaniu informacji genetycznej z kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) na mRNA, zwany informacyjnym RNA (messenger RNA). Proces ten przebiega trójetapowo. Etap pierwszy, inicjacja, zaczyna się od znalezienia w DNA miejsca rozpoczęcia transkrypcji (promotora) przez polimerazę RNA. Enzym ten wiąże się do odpowiedniej sekwencji nukleotydowej poprzez białko sigma. Z powodu dużej ilości miejsc startu transkrypcji prędkość przeszukiwania DNA musi być wysoka, co prowadzi czasem do inicjacji poronnych poprzedzających właściwą inicjację. Proces transkrypcji biegnie tylko na jednej z dwóch nici DNA (tzw. nić matrycowa), dlatego są one przejściowo oddzielane od siebie. Polimeraza RNA miejscowo topi i przesuwa się po nici DNA syntetyzując mRNA o zasadach komplementarnych (odpowiadających) do nukleotydów matrycy. Substraty do budowy mRNA to ATP (adenozynotrifosforan), GTP(guanozynotrifosforan), CTP (cytydynotrifosforan) oraz UTP (urydynotrifosforan). Reszty monofosforanowe tych substratów dołączane są do końca 3' powstającego mRNA za pomocą wiązań 3'-5' fosfodiestrowych. Uwalniany w tej jest reakcji pirofosforan, który hydrolizowany jest do fosforanu organicznego co czyni cały proces egzoergicznym. Etap syntezy mRNA z trifosforanów rybonukleozydów nazywa się elongacją i trwa aż do napotkania przez polimerazę tzw. terminatora transkrypcji. Kompleks hybrydowy mRNA-DNA ulega wtedy dysocjacji i proces transkrypcji jest zakończony.
04 Otwarta ramka odczytu - jest każdą sekwencją DNA lub RNA, która potencjalnie może ulectranslacji na białko. W genie ORF mieści się pomiędzy kodonem 'START' (lub sekwencją START), a kodonem 'STOP'. ORF-y odnajduje się zwykle podczas przeczesywania sekwencji DNA przy poszukiwaniu potencjalnych genów. Dla różnych organizmów, z powodu różnorodności sekwencji A'START' istnieją zatem różne ORF-y. Typowy algorytm poszukiwania ORF uwzględni zatem kod genetycznydanego organizmu (łącznie z możliwymi jego odmianami) i wyszuka wszelkie możliwe ORF (z czego nie wszystkie muszą być prawidłowe).
W rzeczywistości, obecność ORF, szczególnie długiego, jest zazwyczaj dowodem na obecność genu, gdzieś w okolicznej sekwencji. W takim wypadku ORF jest częścią sekwencji kodującej, podlegającej translacji przez rybosomy. Jednak można spotkać także ORF-y nie będące częścią genu - zazwyczaj są one krótkie i kończą się zaledwie po kilku kodonach.
05 Kod genetyczny - Kolejność aminokwasów w białku jest zapisana w postaci kolejności nukleotydów w mRNA. Taki sposób zaszyfrowania informacji nazywa się kodem genetycznym. Jeden aminokwas jest kodowany przez 3 nukleotydy. Jest, zatem trójkowy. Ta trójka nukleotydów to kodon, inaczej triplet. Kod genetyczny został przedstawiony, jako zespół wszystkich możliwości występowania trójek mRNA. Pamiętając, że mamy 4 rodzaje zasad azotowych RNA (A, G, C i U), można obliczyć liczbę możliwości powstania takich trójek. Jest ich 64 (43). Taka jest jest liczba kodonów w kodzie genetycznym organizmu. AUG- start; UAA, UAG, UGA- stop
CECHY KODU GEN.
Trójkowy - zdegenerowany - jednoznaczny - bezprzecinkowy -
06 Organizmy modelowe WIRUSY bakteriofag lambda - bakteriofag ΦX174 - wirus mozaiki tytoniu JEDNOKOMORK ORG MODELOWE - Bakterie Escherichia coli, Bacillus subtilis
- Drożdże Saccharomycese ZWIERZĘTA MODELOWE nicień muszka owocówka jeżowce kura domowa platana szponiasta ryby mysz szympans ROŚLINY MODELOWE ryż siewny, toczek, rzodkiewnik posp., tytoń, groch
07 Właściwości fizyczne i chemiczne kwasów nukleinowych 1 stabilnosc kw. Nukl. 2 wplyw srod. Kwasnego 3 wplyw srod. Zasadowego 4 lepkosc 5 gestosc (wynosi 1,7 g/cm3)
08 Interkalacja zjawisko wiązania niewielkich cząsteczek, wewnątrz cząsteczek związków wielkocząsteczkowych lub wewnątrz struktur ponadcząsteczkowych zbudowanych z cząsteczek związanych ze sobą np. wiązaniami wodorowymi, czy oddziaływaniami van der Waalsa.
Przykładem interkalacji jest tworzenie się stabilnych kompleksów z przeniesieniem ładunku pomiędzy DNA a planarnymi cząsteczkami, które dzięki swej płaskiej strukturze maja zdolność wsunięcia się pomiędzy sąsiadujące ze sobą pary zasad nukleinowych. Takie niewielki cząsteczki przyłączające się do makrocząsteczek nazywane są interkalatorami. INTERKALATORY: - bromek etydyny, DAPI, hoechst, SYBR Greek
09 Struktury superhelikalne - 1- Kolisty DNA-występuje często w bakteriach 2- Superhelikalne zwijanie się DNA: __ superhelisy wynikają z owijania się DNA wokół własnej osi __ Cząsteczka DNA z charakterystyczną dla siebie liczbą opleceń jest topoizomerem
10 Endo / Egzo-nukleazy (def i zast) - Endonukleazy - enzymy należące do klasy hydrolaz, które działając na DNA i RNA doprowadzają do ich rozkładu do oligonukleotydów przez rozerwanie wiązań fosfodiestrowych wewnątrz łańcucha kwasu nukleinowego.
Występują w niemal wszystkich komórkach organizmów. Służą one komórce do cięcia, niszczenia DNA obcego lub zbędnego własnego.
Wśród endonukleaz występują tzw. endonukleazy restrykcyjne, które w zależności od mechanizmu, w jakim następuje cięcie DNA, dzielimy na trzy rodzaje, Typ I, Typ II, Typ III. W okresie pełnienia procesów metabolicznych komórka chroni swoje DNA przed nimi, natomiast gdy życie komórki się kończy, wykorzystuje je do autodestrukcji.
Egzonukleazy - enzymy należące do klasy hydrolaz, które działając na jedno- lub dwuniciowe DNA i RNA powodują odłączenienukleotydów od końców ich łańcuchów.
Ze względu na kierunek, w którym działają, wyróżniamy 5'- i 3'-egzonukleazy. Te działające w kierunku 3'→5' spełniają ważną funkcję, sprawdza bowiem, czy ostatni przyłączony nukleotyd jest prawidłowy.
11 Właściwości polimerazy I DNA 5'3' DNA- zależna polimeraza DNA, wymagająca matrycy jednoniciowego DNA (ssDNA) i primera (ok.. 20bp) DNA lub RNA z końcem 3'-OH:
12 Właściwości polimerazy Taq właściwości: ---termostabilność w zakresie temperatur od 37stC do 94stC (optimum działania przy 80stC) --- 5'3' DNA zależna polimeraza DNA, wymagająca od aktywności matrysy ssDNA oraz primera DNA lub RNA z końcem 3'-OH --- 5'3' egzonukleaza, degradująca od końca 5'—P dwuniciowy DNA (dsDNA) lub hybrydę DNA-RNA
13 Enzymy restrykcyjne - zwane skrótowo restryktazami, czynnościowo są bakteryjnym `układem immunologicznym' - chronią przed zakażeniem wirusowym przez rozcinanie materiału genetycznego wirusa wstrzykniętego do komórki bakteryjnej ZASTOSOWANIE ENZYMÓW RESTRYKCYJNYCH sporządzanie map fizycznych genomow izolacja i identyfikacja genów sekwencjonowanie DNA rekombinacja i klonowanie określonych genów diagnostyka chorób genetycznych diagnostyka niektórych typów chorob nowotworowych w transplantologii - do ustalenia zgodności tkankowej w medycynie sadowej do ustalenia pokrewieństwa
14 Rodzaje wektorów plazmidowe fagowe kosmidowe chromosomowe ZASTOSOWANIE WEKTORÓW klonowanie DNA klonowanie genów w zwierzętach - leczenie choroby genetycznej lub raka za pomocą terapii genowej uzyskiwanie roślin i zwierząt transgenicznych uzyskiwanie myszy z inaktywowanym genem produkcja leków i białek na dużą skalę
15 Etapy regulacji ekspresji genu - ekspresja genu regulowana jest na etapie 1 transkrypcji DNA do mRNA 2 składania mRNA 3 transportu do cytoplazmy 4 Translacji - synteza białka 5 degradacji mRNA 6 Aktywacji lub degradacji białka
16 Etapy analizy Southern bott - Analiza DNA (metoda Southerna), lub analiza RNA (metoda Northern) 1 Elektroforeza na żelu agarozowym lub akryloamidowym 2 Przeniesienie rozdzielonego DNA, RNA lub białka na akrusz folii nitrocelulozowej lub nylonowej *DNA - Southern blot *RNA - Northern blot *Białko - Western blot *Białko w elektroforezie dwukierunkowej - Ekstern blot 3 Związanie z folią nylonową (UV, zapiekanie w 80stC przez 3min) 4 Hybrydyzacja - połączenie jednoniciowego kwasu nukleinowego na blocie z sondą (próbą) molekularną, którą jest jednoniciowy DNA lub RNA.
17 PCR reakcja łańcuchowa polimerazy, polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z wykorzystaniem starterów flankujących określony odcinek DNA o długości od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów jest to metoda alternatywna do klonowania i może być używana w celu amplifikacji nawet bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie, ale warunkiem jest znajomość sekwencji otaczającej powielany fragment DNA ZASTOSOWANIE PCR - PCR może być uzywany do amplifikacji specyficznych sekwencji na DNA izolowanym nawet z pojedynczej komórki. Ma to ogromne znaczenie przy: analizowaniu mutacji związanych z szeregiem chorob genetycznych diagnostyce chorob dziedzicznych, pasożytniczych etc. ustalaniu ojcostwa w sądownictwie ETAPY JEDNEGO CYKLU REAKCJI PCR - 1denaturacja kompleksu DNA (temp. 95stC) 2 przyłączenie primerów (starterów) do miejsca komplementarnego na matrycy DNA (temp. 45-60stC, średnio 55stC) 3 wydłużanie primera od konca 3'-OH (temp. 72stC) CZYNNIKI WARUNKUJĄCE PRAWIDŁOWY PRZEBIEG REAKCJI PCR wyposażenie np. typ probowki reakcyjnej, typ termocyklera temperatura i czas termicznego cyklu, ilość cykli stężenie polimerazy DNA (Taq), jakość enzymu i buforu reakcyjnego jakość polimerów jakość matrycowego DNA (ilość i jego czystość) wielkość i struktura amplikowanego produktu
18 RT-PCR i zastosowanie tej analizy - RT-PCR - PCR połączona odwrotną transkrypcją czyli materiałem wyjściowym do namnażania jest mRNA, a nie jak zazwyczaj DNA. CEL BADAŃ wykazanie obecności receptorow trojjodotyroniny (T3) w ścianie pęcherzyków jajnikowych niosącej kury proba określania poziomu receptorow T3 w zrębie jajnika (stromie) oraz pęcherzykach jajnikowych białych, żółtych przedowulacyjnych i poowulacyjnych.
19 Etapy badania ekspresji genu metodą RT-PCR - 1 izolacja całkowitego RNA (lub mRNA) 2 odwrotna transkrypcja (RT) - przy pomocy enzymu odwrotnej transkryptazy i startera oligo(dT) 3 Amplifikacja cDNA metodą PCR: * zaprojektowanie starterów flankujących (20-24 nukleotydów) komplementarnych do danego fragmentu genu (sekwencji genu szukamy w bazie NCBI) * dobieranie odpowiednich czasów i stężeń starterów oraz enzymu polimerazy Taq q reakcji PCR * przeprowadzanie amplifikacji cDNA w termocyklerze 4 Analiza produktu PCR: * elektroforeza * sekwencjonowanie DNA * restrykcja enzymami restrykcyjnymi
20 Przebieg reakcji PCR - fazy reakcji (kinetyka reakcji PCR) - 1 faza początkowa 2 faza wykładnicza (ekspotencjalna) - podwojenie ilości produktu w każdym cyklu reakcji (E=100%) 3 faza liniowa - duża zmienność, składniki reakcji zaczynają ulegać wyczerpaniu, następuje trudny do oszacowania spadek wydajności reakcji 4 Faza końcowa (plateau) - wyczerpanie reagentów prowadzi do zahamowania reakcji PCR