Data: 11-03-2008	Imiona i Nazwiska: Urszula Lorenc, Cezary Łaksa, Katarzyna Łącz, Robert Łoś, Magdalena Łukasik, Katarzyna Makowska, Przemysław Machura, Michał Macura, Olgierd Marcinkowski, Joanna Madej, Magdalena Madej, Magdalena Machota, Marchewka Marta, Małgorzata Mazur,
GrupaVI
Technologia Żywności
Ocena:	Temat ćwiczenia: Spektrofotometryczne oznaczenie stężenia białka.

I.Wstęp teoretyczny:

Spektrofotometria jest to dział analizy instrumentalnej polegający na ilościowym pomiarze absorpcji, emisji lub odbicia światła. Wiązka promieniowania monochromatycznego przechodząca przez warstwę roztworu jest osłabiona w stosunku do padającego. Promieniowanie o natężeniu ulega częściowo odbiciu lub rozproszeniu, częściowo pochłonięciu, a tylko część przechodzi przez roztwór.

Absorpcja (pochłanianie) ma charakter selektywny, czyli każda substancja inaczej absorbuje światło i jest to cecha charakterystyczna dla każdej z nich. Istnieją substancje zdolne do pochłaniania światła o długości 180-800 nm. Tą zdolność zawdzięczają posiadaniu wewnątrz cząsteczki grupy atomów które powiązane są ze sobą wiązaniami wielokrotnymi tak jak na przykład w grupie karbonylowej, tiolowej, alkenowej, azowej, nitrowej, nitrozowej, fenylowej.

Innym przykładem mogą być związki aromatyczne, heterocykliczne z pierścieniami skondensowanymi, lub też jony metali przejściowych o niezapełnionych powłokach elektronowych. Wszystkie te związki nazywane są chromoforami.

Prawa rządzące spektrofotometrią:

1.Prawo Lamberta:

Prawo to głosi, że stopień absorpcji światła jest proporcjonalny do grubości warstwy i jej własności optycznych, np. w przypadku roztworów należy uwzględnić stężenie molowe czynnika powodującego pochłanianie.

2.Prawo Beera:

głosi, że wielkość absorbancji światła (ABS) przez roztwór jest wprost proporcjonalna do stężenia c substancji pochłaniającej światło.

3. Prawo addytywności absorpcji:

mówiące iż w układzie wieloskładnikowych, absorpcja jest równa sumie absorbancji poszczególnych składników przy określonej fali.

Oznaczenie dla pojedynczego składnika selektywnie absorbującego światło o określonej długości przeprowadza się przy długości fali odpowiadającej maksimum absorpcji. Pomiary polegają na porównaniu natężenia wiązki promieniowania przechodzącego przez badaną próbkę odniesienia np. rozpuszczalnik. Zależność pomiędzy wynikiem pomiaru a zawartością oznaczonego składnika ustala się przy pomocy próbek wzorcowych. Jest to tak zwana metoda krzywej kalibracyjnej. Sporządza się serię wzorców o składzie naśladującym próbkę badaną, o zakresie stężeń pokrywającym cały przedział analityczny. Na podstawie pomiarów sporządza się wykres zależności absorpcji do stężenia roztworu, co umożliwia określenie stężenia badanego roztworu.

II. Wykonanie Oznaczenia:

Posiadając roztwór białka wołowego albuminy o stężeniu 1mg/ml sporządzono serię próbek wzorcowych o stężeniach: 0,2 mg/ml ; 0,4mg/ml ; 0,6mg/ml ; 0,8mg/ml ; 1,0 mg/ml. Zmierzono ich absorbcję światła przy długości 280nm, zerując wcześniej spektrofotometr na próbce wody destylowanej. Na koniec zmierzono absorpcję badanej próbki.

III. Pomiary:

	Stężenie (mg/ml)	absorpcja
0	0,00	0,0002
1	0,2	0,1147
2	0,4	0,2488
3	0,6	0,3814
4	0,8	0,5098
5	1,0	0,6443
x		0,3076

x- badana próbka

Opracowanie wyników:

Wyniki pomiarów można przedstawić w postaci równania funkcji:

y=ax+c, gdzie:

y - wartość mierzona

x - stężenie analitu

a - współczynnik kierunkowy

b - przesunięcie prostej regresji

W procesie kalibracji współczynniki a i b równania y=ax+c można obliczyć na podstawie wzorów:

n	xi	yi	xiyi	xi^2	yi^2
1
2
3
4
5
6
suma:

a=0,6483

b= - 0,0076

y = 0,6483x - 0,0076

---