Co to są przeciwciała?
To rozpuszczalne białka syntetyzowane przez organizmy w odpowiedzi na pojawienie się obcej substancji. Mają swoiste powinowactwo do antygenu.
Wymień klasy immunoglobulin i podaj ich zasadnicze funkcje:
IgG - najważniejsza w organizmie, decyduje o ukł. Odpornościowym IgM - wczesne przeciwciała - pierwsza linia obrony przeciw obcym drobnoustrojom w organizmie IgA - ochrona błon śluzowych
IgD - ma wpływ na funkcje limfatyczne
IgE - ochrona przeciwko pasożytom jelitowym, odpowiedzialna także za różne objawy alergiiKtóra z immunoglobulin wytwarza przeciwciała przeciwko bakteriom, wirusom i grzybom?
IgG
Co to jest koniugat?rzeciwciało znakowane enzymem np. fosfatazą alkaliczną.Co to jest okienko serologiczne?
Czas od chwili zakażenia do wytworzenia się przeciwciał zwalczających dany antygen.Wymień odczynniki niezbędne do przeprowadzenia testu ELISA?
1. Substrat -p- nitrofenylofosfat- związek chemiczny o bezbarwnych cząsteczkach, a przy zetknięciu z fosfatazą alkaliczna powoduje reakcję barwną2. Bufory:a) powlekający do rozcieńczenia IgG pH 9,6 (węglan sodu, kwaśny węglan sodu, azydek sodu)b) PBS-T - do płukania pH 7,4c) PBS-T - do płukania próbek i koniugatu (albumina, PVP)d) bufor substratowy pH 9,6Co to jest antygen?Może być każda obca substancja w organizmie, która wykazuje dwie cechy: *immunogenność, czyli zdolność wzbudzenia przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej swoistej, *antygenowość- czyli zdolność do reagowania z przeciwciałami, mogą to być białka, polisacharydy, nukleiny.(obca cząst. w organ. zdolna do wywołania syntezy przeciwciał.)Jaki enzym stosujemy w teście ELISA? Fosfataza alkalicznaNa czym polega ostatni, czwarty etap w teście ELISA?Polega na nanoszeniu roztworu substratu, inkubowaniu go przez jedną godzinę w temp. pokojowej a kończy się oceną wizualną.
Podaj przykłady roślin produkujących przeciwciała?
Nie ma takich roślin !!! bo nic produkują
Wymień zalety testu ELISA.
- wysoka czułość metody
- możliwość badania wszystkich część roślin
- uniwersalna w zastosowaniu
- wczesne uzyskiwanie wyniku badań
Na czym polega liza komórek?
Na mechanicznym uszkodzeniu np. *poprzez ucieranie tkanek w ciekłym azocie *traktowanie chemiczne *trawienie enzymatyczne.
Jest to 1 etap izolacji DNA , zapewnia uwolnienie DNA z komórek do buforu ekstrakcyjnego.
Jaką rolę spełnia detergent w procesie izolacji DNA?
Służy do oczyszczenia materiału z jakiego będzie izolowane DNA.
Pomiar ilości DNA dokonujemy metodą spektrofotometryczną przy długości fali 260 nm.
W jaki sposób oznaczamy zanieczyszczenie DNA metodą spektrofotometryczną?
Dzieląc wynik ilości DNA uzyskany przy długości flai 260nm przez wynik obecności białek w roztworze uzyskany przy dł. fali 280nm. Wartośc ta mówi o czystości próby:
< 1.5 - zanieczyszczona białkami,
1,5 - 1,8 - czysta,
>1,8 - zanieczyszczona odczynnikami
Jakie znasz różnice pomiędzy genomem roślin wyższych a genomem grzybów?
Różnica w liczbie chromosomów.
Wymień co najmniej dwie przyczyny trudności związanych z izolacją DNA z grzybów.- zbyt gruba i ścisła ściana komórkowa - za mało materiału DNA zostało wyizolowane- zanieczyszczenia materiału DNA odczynnikami- zanieczyszczenie materiału białkiem grzybów.W jaki sposób następuje oczyszczanie DNA w procesie izolacji?
1. zastosowanie CTAB - mieszanina fenolu i chloroformu - usunięcie białek2. zastosowanie minikolumn - kilkakrotne płukanie alkoholem menbran silikonowych z materiałem DNA. Co to są nukleazy i jakie znasz sposoby ich dezaktywacji?Nukleazy są to enzymy, rozkładające DNA naturalnie wyst. w komórkach, których funkcją jest obrona przed wirusami, ich dezaktywacja następuje poprzez dodanie EDTA do roztworu lub zastosowanie wysokich temperatur.Podaj przykłady chorób roślin i patogenów, w przypadku których diagnostyka PCR ma szczególne uzasadnienie. Uzasadnij konieczność stosowania analiz PCR w diagnostyce wymienionych patogenów roślin.
* Łamliwość źdźbła zbóż - Tapesia acuformis (typ R) i Tapesia yallundae (typ W) zastosowanie PCR pozawala odróżnić patogena powodującego chorobę oraz zastosować odpowiedni środek ochrony, gdyż te dwa patogeny wymagają odmiennego sposobu zwalczania.* Septorioza paskowana liści - Septoria Tritici - ostatnio pojawiające się mutacje w genach patogena wymagają poszukiwania nowych środków ochronnych, co wymaga zbadania dokładnego DNA patogena.
Wymień etapy reakcji PCR.
1. Denaturacja cieplna 90-94 °C - rozerwanie podwójnych i potrójnych wiązań wodorowych
2. Hybrydyzacja primerów 40-60 °C z komplementarnymi sekwencjami matrycowego DNA 3. Wydłużanie przyłączonych primerów 68-72 °C poprzez polimerazę DNA.
Powtarza się te etapy cyklicznie 25-40 razy.
Wymień komponenty reakcji PCR.
1. genomowi DNA (10 do 100 ng)
2. bufor reakcyjny: 50 ml KCL, 10 mM Tris - HCL
3. nukleotydy dATP, dCTP. dGTP, dTTP
4. MgCl2
5. pollimeraza DNA
6. primery
7. H2O
Podaj przykłady metod PCR stosowanych w badaniach zmienności genetycznej populacji grzybów chorobotwórczych:
1. SCAR- zastosowanie specyficznych gatunkowo starterów dla różnych gatunków
2. RAPD- zastosowanie jednego primera (10par zasad) który może przyłączyc się w kilku miejscach
3. PCR-RFLP- otrzymany produkt poddaje się działaniu enzymów restrykcyjnych. Jeśli enzym znajdzie odpowiadającą sobie sekwencje to ją przetnie. Określamy wtedy zróżnicowanie pomiędzy organizmami.
4. BIO-PCR- fragmenty roślin lub ziarno wykłada się na pożywki i hoduje 24-48godzin. Gdy jest żywy patogen nast. Jego wydzielenie i przeprowadza się wtedy PCR. Stosowany dla wykluczenia fałszywych wyników.
Wymień inhibitory reakcji PCR?
MgCl2, polimeraza DNA, primery
Na czym polega metoda BIO-PCR?
Polega na wykrywaniu mikroorganizmów chorobotwórczych tylko z żywych komórek patogena.
Co to są mykotoksyny? Podaj przykłady mykotoksyny fuzaryjnych i gatunków je syntetyzujących.
Mykotoksyny są to wtórne metabolity grzybów powstające tam gdzie ma miejsce rozwój gatunków toksynotwórczych.
Mykotoksyny fuzaryjne:
1. deoksynivalenol, nivalenol, zearalenol - Fusarium graminearum
2. moniliformina, enniatyna - Fusarium avenaceum
3. trichoteceny - Fusarium sporotrichoides
Produkt reakcji PCR po procesie elektroforezy na żelu agarozowym porównujemy do wzorca masy molekularnej DNA danego gatunku.
Na czym polega diagnostyka PCR poszczególnych chemotypów grzybów z rodzaju Fusarium?
……..
Metoda tradycyjna diagnostyki patogenów grzybowych polega na
Hodowli testowanego materiału w warunkach laboratoryjnych na odpowiedniej pożywce a następnie wizualnej ocenie otrzymanych mikroorganizmów pod mikroskopem
natomiast czynnikiem na podstawie którego następuje wykrycie/identyfikacja patogenu metodą PCR Jest wyizolowanie DNA tego patogena i jego zbadanie.
Dlaczego w reakcji SCAR-PCR następuje specyficzna amplifikacja fragmentu DNA patogenu?
Dlatego ze stosuje się specyficzne gatunkowo starterv. które działają tylko w obecności wymagane gogenomu patogena.
Wymień etapy składające się na proces diagnostyki molekularnej chorób grzybowych roślin:
1. wyodrębnienie i oczyszczenie materiału roślinnego zawierającego patogena.
2. wyodrębnienie i oczyszczenie materiału DNA
3. wymagany proces powielenia DNA.
4. porównanie do wzorca DNA
5. odczytanie wyników i rozpoznanie patogena
Wymień pożywki stosowane w badaniach mikrobiologicznych?
1. organiczna PDA - bogata, szybki wzrost: ziemniak, agar, sacharoza lub glukoza. Czasami zakwaszana aby ograniczyć rozwój bakterii.
2. chemiczna SNA -uboga, powolny wzrost grzybów. Stosujemy aby ograniczyc rozwoj …
Podaj przykłady gatunków grzybów patogenicznych omawianych na ćwiczeniach?
Fusarium Poa,
Fusarium avenaceum
Fusarium culmorum
Botrytis cinereae
Ascochyta pinodes
Wymień charakterystyczne cechy morfologiczne grzybów na podstawie których przeprowadza się identyfikacją mikroskopową?
1. zarodniki
2. grzybnia
3. strzępka.
4. fialidia
5. chlamydospora
6. sporodochium
7. pinnota.
8. kolor grzyba.
9. piknidia.
10. acerwulusy
11. przycistki
12. skleroty.
Podaj jednostki w jakich mierzona jest fotosynteza za pomocą aparatu LI-COR 6400
Zużycie CO2 w milimolach na 1 cm2 * 1s.