1. Chromatografia żelowa - opisać technikę + przykład

Kolumny z żelu sefadeks lub podobne matryce, mające „pory” o wiadomym rozmiarze kalibruje się, stosując białka o znanej masie cząsteczkowej. Poszukiwaną masę cząsteczkową nieznanego białka oblicza się z porównania jego objętości elucyjnej z objętościami elucyjnymi białek wzorcowych. Można popełnić duże błędy, jeżeli cząsteczka białka jest bardzo asymetryczna albo oddziałuje silnie ze związkami, z których zostały wyprodukowane molekularne sita. (B.Harpera)

W filtracji żelowej rozdział białek odbywa się na podstawie ich wielkości i kształtu. Używa się do tego kolumn chromatograficznych wypełnionych kulistymi cząsteczkami żelu (średnica 10-500) wykonanymi z nierozpuszczalnego, ale bardzo uwodnionego polimeru. Średnie i małe białka mogą wejść do kanalików w ziarnach, natomiast większe lub o wydłużonym kształcie nie mogą. Cząsteczki większe natomiast występują tylko w płynie otaczającym ziarna, co sprawia, że przemieszczają się przez kolumnę szybciej i wypływają(ulegają elucji) jako pierwsze. Objętość elucyjna białka zależy od jego masy cząsteczkowej.

Przykłady:

- do odsalania

- do oznaczania rozkładu masy cząsteczkowej (rozkłady temperatury wrzenia)

- do rozdzielania fulerenów oraz nierozpuszczalnego materiału i neznanych zanieczyszczeń niskocząsteczkowych

2. Zalety enzymów unieruchomionych (immobilizowanych)
-immobilizacja może stabilizować strukturę białek, dzięki czemu zwiększona jest termostabilność i oporność na działanie czynników denaturujących
-możliwość stosowania enzymów w środowisku organicznym
-łatwe oddzielenie enzymu od mieszaniny reakcyjnej po zakończeniu procesu, dzięki czemu otrzymujemy produkt o wysokie czystości
-możliwość wielokrotnego wykorzystania biokatalizatora
-ograniczenie inhibicji enzymu, zarówno przez substrat jak i przez produkt, podnosi wydajność procesu biokatalizy
-możliwość pracy w systemach ciągłych

3. Wymień kilka metod unieruchamiania enzymów i omów dokładniej jedną z nich.

Metody fizyczne:

-Adsorpcja na nierozpuszczalnych nośnikach

-Inkluzja w sieci polimerowej

-Mikrokapsułkowanie wewnątrz półprzepuszczalnych membran

Metody chemiczne:

-Kopolimeryzacja

-Usieciowanie czynnikami wielofunkcyjnymi

-Kowalencyjne wiązanie z nośnikami rozpuszczalnymi i nierozpuszczalnymi w wodzie

Adsorpcja na nierozpuszczalnych nośnikach składa się z trzech etapów

1. przygotowuje się kolumnę szklana wypełnioną adsorbentem.

2. na kolumnę nanosi się roztwór enzymu, jest to proces ciągły, trwający kilka, nawet kilkanaście godzin, prowadzony w ściśle kontrolowanych warunkach (temp, pH, stężenie enzymu)

3. kolumna jest ponownie wielokrotnie przemywana wodą destylowaną w celu wymycia nadmiaru enzymu.

Tak przygotowana kolumna z unieruchomionym w adsorbencie enzymem jest gotowa do przeprowadzania reakcji biokatalizy.

4. Podaj jakie preparaty enzymatyczne i w jakim celu stosuje się w przemyśle skrobiowym i gorzelniczym.

AMYLAZY -Mianem tym określa się zespół enzymów katalizujących przemianę skrobi i glikogenu do cukrów prostszych- maltozy (i niekiedy do glukozy).
zastosowanie:
1. w gorzelnictwie rolniczym- przy zacieraniu i cukrowaniu surowców skrobiowych, głównie ziemniaków, żyta, kukurydzy
2. w browarnictwie - przy scukrzaniu skrobi zawartej w samym słodzie, w wyniku czego otrzymuje się brzeczkę.
3. likwidacja zmętnień skrobiowych (przy produkcji soków, kawy zbożowej, wina)
4. uławianie procesu klarowania

CELULOZY, HEMICELULOZY, PENTOZANAZY- grupa enzymów, która hydrolizuje wielkocząsteczkowe cukrowce występujące głównie w błonach komórkowych roślin i w tkankach podporowych.
W przemyśle spożywczym preparaty celulityczne stosuje się do trawienia tkanek roślinnych ich rozluźnienia, co ułatwia wydobywanie soku z owoców, brzeczki browarniczej z ziarna jęczmienia, skrobi z komórek ziemniaka, olejków z różnych części roślin, ekstraktu z nasion kawy. Te wszystkie wyżej wymienione preparaty znalazły również zastosowanie w przemyśle paszowym.
Zastosowanie enzymów:
• Rozkład hemicelulozy we wstępnej obróbce ziarna kawowego
• Rozkład celulazy przy produkcji sosów (łącznie z preparatami amylolitycznymi), do intensyfikacji ekstrakcji z białek z roślin (m.in. z zielonej herbaty) oraz jako preparaty ułatwiające przyswajanie pasz (celulazy z preparatami pektolitycznymi)
• Szerokie zastosowanie w przemyśle owocowo-warzywnym
• W przemyśle winiarskim, farmaceutycznym, podnosząc zawartość cukrów fermentujących
• W piwowarstwie do rozkładu β-glukanu w jęczmieniu (ułatwiona filtracja piwa i zapobiega zmętnieniom)

ENZYMY PEKTOLITYCZNE- enzymy działające na pektyny. .
W przemyśle spożywczym najpowszechniej stosuje się preparaty pektolityczne przy tłoczeniu soków i klarowaniu wina, w produkcji soków owocowych, napojów bezalkoholowych konserw owocowych (w celu zapobiegania powstawania żelu w sokach skoncentrowanych), w produkcji wódek i likierów, w produkcji kawy i koncentratów kawowych (usuwanie warstwy żelu z powierzchni ziaren kawy surowej).
Obróbka miazg i depektynizacja soków owocowych, produkcja soków pitnych i win owocowych

ENZYMY PROTEOLITYCZNE znalazły zastosowanie w piwowarstwie. Używa się ich w celu rozpuszczenia białek i zapobieżeniu zmętnieniom piwa przy jego chłodzeniu. Aktywność rodzimych proteaz ujawnia się w procesie słodowania ziaren (zwykle jęczmienia), przyczyniając się jednocześnie do sklarowania brzeczki i podniesienia jej wartości, zarówno jako substratu dla drożdży, jak i końcowego produktu spożywczego.

5. Zastosowanie enzymów w przemyśle piekarniczym.

Grzybowe alfa- amylazy- katalityczne przyspieszenie rozkładu skrobi z mąki na krótsze cukry. Te z kolei są wykorzystywane przez drożdże piekarnicze zawarte w cieście, wskutek czego ułatwia fermentacje ciasta, produkowany jest dwutlenek węgla, spulchniający ciasto. Przedłuża się w ten sposób także jego trwałość. Używane w produkcji pieczywa białego, bułek itp.

Proteazy -producenci ciastek używają ich do obniżenia poziomu białka w mące.
Polepszenie pulchności, konsystencji ciasta. Skracanie czasu wyrabiania, zmiękczania ciasta i zwiększenie jego objętości.

6. Enzymy używane w przemyśle mleczarskim i ich funkcje.

Dzięki enzymom możliwa jest produkcja większości produktów mleczarskich. Laktaza- enzym rozkładający cukier mlekowy (laktozę). Wykorzystywana także przy przerobie serwatki.

Enzymy proteolityczne:
-koagulacja białek mleka, w procesie wyrobu serów
-degradacja wytrąconego parakazeinianu wapniowego
-produkcja hydrolizatów kazeiny, „mleka sojowego”
-dojrzewanie serów ( enzymy drobnoustrojów zastosowanych jako szczepionki)

7. Mikrokapsułkowanie
Jest metodą polegającą na otaczaniu cząstek substancji rdzenia ściankami uformowanymi z jednej lub kilku substancji okrywających. W przypadku, gdy rozmiary kapsułki zawierają się w przedziale 0,2 - 5000 µm, klasyfikuje się je jako mikrokapsułki, a cały proces nazywa się wtedy mikrokapsułkowaniem. Mikrokapsułki zbudowane są z rdzenia, czyli substancji kapsułkowanej oraz ścianek, które mogą być pojedyncze lub podwójne. Kształt mikrokapsułek zależy od metody mikrokapsułkowania, rodzaju substancji rdzenia i ścianek. Rdzeń stanowi około 10 - 90% ogólnej masy mikrokapsułki. Materiałem ścianek mogą być związki naturalne bądź syntetyczne, np. żelatyna, guma arabska, tłuszcze, pochodne celulozy, żywice, polietylen i wiele innych.

8. Cechy nośników stosowanych do immobilizacji

Uważa się, że dobry nośnik powinien wykazywać następujące cechy:

-obojętność w stosunku do zatrzymywanych mikroorganizmow,

-prostota i łagodność unieruchamiania,

-duża zdolność zatrzymywania komorek,

-wysoka mechaniczna stabilność,

-obojętność chemiczna,

-duża zdolność dyfuzyjna w stosunku do substratu

i produktu,

-możliwość regeneracji i kilkakrotnego użycia,

-łatwa dostępność, niski koszt,
-możliwość zastosowania w skali przemysłowej

9, Elektroforeza
Homogeniczność białka jest najlepiej oceniania przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym (PAGE) przeprowadzoną w różnych warunkach. Jeżeli nałożona jest dostateczna ilość próby, jednowymiarowa PAGE natywnego białka ujawni większe i mniejsze zanieczyszczenia białkowe. W dwuwymiarowej PAGE w pierwszym wymiarze, który zawiera mocznik i gradient pH denaturowane białka rozdzielają się na zasadzie ich wartości pI przez zrównoważenie ich w polu elektrycznym. W drugim wymiarze białka, po zadziałaniu na nie SDS, rozdzielają się na zasadzie wielkości mas cząsteczkowych.

10. Wykorzystanie immobilizacji
Unieruchomione komórki enzymów znajdują zastosowanie w różnych obszarach przemysłu spożywczego, farmaceutycznego, chemicznego, ochronie środowiska oraz szeroko pojętej analityce, diagnostyce i monitoringu; jako elementy receptorowe (czuła warstwa na dany analit) w bioczujnikach i biosensorach. Dużą zaletą komórek immobilizowanych jest ich przydatność do prowadzenia procesów ciągłych i półciągłych, jak również łatwość wydzielania produktu i komórek oraz mniejsze ryzyko zakażeń mikrobiologicznych.

---