Chromatografia to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania lub badania składu mieszanin związków chemicznych.W każdej technice chromatograficznej najpierw rozdziela się badaną mieszaninę, a następnie przeprowadza się detekcję poszczególnych składników. Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną. Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące zdolności sorpcyjne lub zdolne do innych oddziaływań na substancje przepływające. Podczas przepływu eluenta (fazy ruchomej) przez fazę rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) substancji. Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny. Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie dłużej, a inne krócej, dzięki czemu może następować ich separacja. Czas przebywania danego składnika w kolumnie określany jest mianem czasu retencji.
W zależności od rodzaju eluentu czyli substancji w której rozpuszcza się badaną mieszaninę rozróżnia się następujące techniki chromatograficzne:
chromatografia cieczowa - w której eluentem jest ciekły rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników
chromatografia gazowa - w której eluentem jest gaz (zwykle hel, argon lub wodór, czasem azot).
chromatografia nadkrytyczna - w której eluentem jest gaz w stanie nadkrytycznym.
W zależności od rodzaju i sposobu przygotowania fazy rozdzielczej:
chromatografia cienkowarstwowa (TLC)- w której fazę rozdzielczą stanowi cienka warstwa fazy stałej naniesiona na sztywną płytkę. Na tak spreparowaną płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania sił kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ i rozdział mieszaniny;
chromatografia bibułowa - w której fazę rozdzielczą stanowi pasek lub arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły chromatograficznej;
chromatografia kolumnowa - w której faza rozdzielcza jest umieszczona w specjalnej kolumnie, przez którą przepuszcza się następnie roztwór badanej mieszaniny. Przepływ roztworu przez kolumnę można wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;
chromatografia powinowactwa - w której odpowiednio spreparowana faza rozdzielcza jest zdolna do oddziaływań chemicznych o zmiennym powinowactwie wobec rozdzielanych substancji;
chromatografia jonowymienna - w której substancje oddziałują ze złożem za pomocą oddziaływań jonowych.
W zależności od parametrów procesu:
HPLC - wysokosprawna/ciśnieniowa chromatografia cieczowa - odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej z użyciem eluentu pod wysokim ciśnieniem;
FPLC - szybka, białkowa/szybkosprawna chromatografia cieczowa - odmiana HPLC działająca na niższych ciśnieniach, stosująca prócz złóż sorpcyjnych, także zwykłe złoża typu sit molekularnych, służąca głównie do rozdziału białek i polipeptydów. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy Pharmacia;
UPLC - ultrasprawna chromatografia cieczowa - odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej. Działa na wyższych ciśnieniach i mniejszych przepływach, a kolumny mają mniejsze ziarno (1,7 - 1,8 μm). Pozwala uzyskiwać krótsze czasy retencji i wyższe rozdzielczości. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy Waters.
GPC -chromatografia żelowa - odmiana kolumnowej chromatografii cieczowej. Polega na rozdziale składników mieszaniny na sitach molekularnych ze względu na ich wielkość (masę). Stosowana m.in. do określania średnich mas cząsteczkowych polimerów
Chromatografia, metoda chemicznej analizy instrumentalnej, w której dokonuje się podziału substancji (w przeciwprądzie) między fazę nieruchomą (bibuła filtracyjna, cienka warstwa adsorbentu naniesiona na płytkę, wypełnienie kolumny) i fazę ruchomą, stanowiącą roztwór ciekły (chromatografia cieczowa) lub gazowy (chromatografia gazowa). W tym celu wykorzystywana jest:
1) różnica w zdolności adsorpcyjnej fazy stacjonarnej względem różnych składników znajdujących się w fazie ruchomej (chromatografia adsorpcyjna);
2) różnica wielkości współczynnika podziału składników rozdzielanych między cieczą umieszczoną na nośniku (w fazie stacjonarnej) a fazą ruchomą (chromatografia podziałowa);
3) różnica wielkości cząsteczek separowanych składników (chromatografia sitowa);
4) zatrzymywanie jonów na podłożu jonitowym (chromatografia jonowymienna).
Stopień rozdziału można zwiększyć dobierając zarówno odpowiedni rozpuszczalnik (tzw. eluent), jak i substancję tworzącą fazę stacjonarną oraz temperaturę procesu i szybkość przepływu fazy ruchomej. Obraz analizy chromatograficznej otrzymany bezpośrednio w fazie stacjonarnej (np. barwne plamy w chromatografii bibułowej pochodzące od poszczególnych składników) lub wykres przedstawiający wyniki analizy w postaci pików odpowiadających rozdzielanym składnikom (uzyskany dzięki zastosowaniu odpowiedniego detektora) nosi nazwę chromatogramu.
Chromatografia może być stosowana do badań jakościowych, ilościowych i dla celów preparatywnych. Sprzężenie chromatografii gazowej z innymi metodami, np. spektrometrią masową lub spektrofotometrią w podczerwieni, znacznie rozszerza możliwości identyfikacji rozdzielanych składników badanej próbki.
Pierwsze prace w dziedzinie chromatografii ogłosił M.C. Cwiet (1903).
Elektroforeza, zjawisko poruszania się naładowanych cząstek koloidalnych - pod działaniem pola elektrycznego - w stosunku do nieruchomego ośrodka rozpraszającego. Ruch ten można zaobserwować bezpośrednio (w przypadku barwnych koloidów) lub pośrednio, np. dokonując pomiarów współczynnika załamania światła czystego rozpuszczalnika i roztworu koloidalnego.
Szybkość wędrowania cząsteczek zależy przede wszystkim od ich wielkości, posiadanego ładunku i masy cząsteczkowej, co zezwala na rozdział układów o różnej wielkości i budowie cząsteczek. Do najbardziej popularnych technik elektroforetycznych należy elektroforeza płytowa w żelu poliakryloamidowym w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS). Często używany jest także żel agarowy lub skrobiowy.
Elektroforeza jest powszechnie stosowana w laboratoriach do rozdzielania aminokwasów, białek, fragmentów DNA i RNA.
W skali technicznej za pomocą elektroforezy można nakładać powłoki ochronne na mokrą powierzchnię metalu, co stanowi o specyfice tej metody. Służy także do utwardzania gruntów, garbowania skór, usuwania cząstek koloidalnych z roztworów, odpylania gazów.
Elektroforeza - technika analityczna, rzadziej preparatywna, stosowana w chemii i biologii molekularnej, zwłaszcza w genetyce. Jej istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym.
Cząsteczki różnych substancji różnią się zwykle ruchliwością elektroforetyczną. Parametr ten jest w przybliżeniu wprost proporcjonalny do ładunku elektrycznego cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny do jej wielkości. Zależy także od kształtu cząsteczki.
Istnieje wiele wariantów tej techniki. W zależności od ośrodka, w którym następuje rozdział, wyróżnić można elektroforezę bibułową (dziś już przestarzałą i praktycznie nie używaną), żelową i kapilarną.
Elektroforeza żelowa
W elektroforezie żelowej ośrodkiem ,w którym przemieszczają się badane substancje, jest żel elektroforetyczny wykonany z agarozy, poliakrylamidów[1], agaru lub skrobi (metoda historyczna), uformowany w płytkę długości kilkunastu - kilkudziesięciu centymetrów i grubości od ułamka do kilku milimetrów (rzadziej jest to słupek - elektroforeza dyskowa). Kroplę analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienie w żelu - studzienkę. Próbka rozpuszczona jest z reguły w roztworze o większej gęstości (np. w formamidzie), dzięki czemu rozpływa się na dnie studzienki, a po włączeniu zasilania migruje do żelu jako wąski prążek. W zależności od techniki, cały żel lub jego końce zanurzone są w przewodzącym prąd roztworze buforowym. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną, elektrody, do których przykłada się stałe lub asymetryczne pulsujące napięcie elektryczne rzędu 50-3000 V. Ze względu na zróżnicowaną mobilność elektroforetyczną, ruchliwsze (zazwyczaj mniejsze) cząsteczki w oddalają się szybciej od miejsca naniesienia próbki. Przebieg elektroforezy można monitorować nanosząc (na osobnych ścieżkach lub razem z preparatem) specjalne barwniki (tzw. markery) o znanej mobilności elektroforetycznej.
Po zakończeniu procesu żel wydobywa się z aparatu i analizuje przez wybarwienie bądź obserwację absorpcji światła (zazwyczaj UV) przez żel. Wizualizację elektroferogramów preparatów znakowanych izotopowo uzyskuje się przez zaczernienie kliszy fotograficznej (autoradiogram). W przypadku technik preparatywnych obszary żelu zawierające pożądany produkt wycina się i poddaje procesowi elucji.
Elektroforeza jest najczęściej stosowana do rozdzielania DNA, RNA lub białek wyekstrahowanych z komórek lub syntetycznych. Jest też czasami stosowana jako jedna z technik pomiaru masy cząsteczkowej i badania polidyspersji polimerów syntetycznych. Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu wpływu kształtu cząsteczek na szybkość ich elektroforetycznej wędrówki i na ściślejszym powiązaniu ich ruchliwości z masą cząsteczkową, to może badane substancje poddać denaturacji, np. przy pomocy detergentu SDS (w przypadku białek) lub mocznika (w przypadku DNA lub białek).
Z poziomu molekularnego elektroforeza polega na ukierunkowanym przesuwaniu analizowanych cząsteczek przez prąd i ich interakcji z fazą stałą żelu, która w tej cząsteczkowej skali wygląda jak przestrzenna sieć. Bardziej ruchliwe są mniejsze cząsteczki bo łatwiej się przeciskają przez tą sieć, większe się opóźniają. Plusowy prąd uruchamia te które 'utknęły' po drodze i daje lepszej jakości rozdział.
Przykładowe barwniki do nanoszenia próbek na żel
błękit bromofenolowy (BP)
cyjanol ksylenowy (XC)
Przykładowe substancje wybarwiające DNA
Elektroforeza kapilarna
Elektroforeza kapilarna, zwana też elektroforezą w wolnym buforze służy najczęściej do rozdziału niewielkich cząsteczek (podobnie jak HPLC). Metoda ta jest często stosowana w biologii molekularnej do analizy DNA, znacznie rzadziej do rozdziału peptydów. Rozdział mieszanin prowadzony jest w cienkiej (wewn. średnica 25-100 µm) i długiej (0.5-1 m) kapilarze kwarcowej, przypominającej z wyglądu światłowód. Kapilara ta wypełniana jest buforem.
Próbka wprowadzana jest do wlotu kapilary, po czym jest do niej przykładane wysokie napięcie elektryczne (do 30 kV). U wylotu kapilary zamontowany jest detektor, który rejestruje wychodzenie z rurki kolejnych związków chemicznych. Bufor płynie przez kapilarę ze stałą szybkością w stronę jednej z elektrod. Dla układu wodnego jest to zwykle katoda.
Odmianą elektroforezy kapilarnej jest micelarna elektrokinetochromatografia (MEKC). W tej technice w buforze rozdziałowym znajduje się rozpuszczony detergent jonowy (np. dodecylosiarczan sodu - SDS) w takim stężeniu, aby tworzyć trwałą emulsję. Emulsja ta składa się z miceli, które są hydrofobowe wewnątrz i naładowane elektrycznie na swojej powierzchni.
Micele te dzięki swemu ładunkowi poruszają się z inną prędkością niż reszta buforu, a w ich wnętrzach zamknięte są cząsteczki związków chemicznych tworzących analizowaną mieszaninę. Pozwala to rozdzielać związki chemiczne, które nie przyjmują ładunku elektrycznego nawet po przyłożeniu dużego napięcia. Metoda ta umożliwia rozdział i analizę niemal wszystkich związków chemicznych rozpuszczalnych w wodzie.
Kolorymetria, analiza kolorymetryczna, barwometria, metoda analizy chemicznej wykorzystująca pomiar intensywności absorpcji światła przez roztwór, czyli zabarwienia roztworu (przy pomocy oka lub fotokomórki), stosowana do oznaczania zawartości substancji barwnych i rozpuszczalnych albo substancji tworzących w wyniku określonej reakcji barwny i rozpuszczalny związek.
Kolorymetria (chemia) - technika analityczna określania stężenia roztworów barwnych za pomocą wizualnego porównania intensywności barwy roztworu badanego z intensywnością barwy wzorca. W kolorymetrii wykorzystuje się liniową zależność absorpcji promieniowania widzialnego od stężenia roztworu (prawo Lamberta-Beera). Uważana za metodę prostą, szybką i dokładną.
Metody kolorymetryczne:
metoda serii wzorców - próbkę badaną porównuje się z zestawem wzorców w probówkach kolorymetrycznych zawierających roztwory badanej substancji w określonych stężeniach lub ze skalą barw we wzorniku.
miareczkowanie kolorymetryczne - do odpowiedniego rozpuszczalnika w cylindrze Nesslera dodaje się substancję oznaczaną tak długo, aż barwa roztworu zrówna się z barwą roztworu oznaczanego.
oznaczenie stężenia w kolorymetrach lub cylindrach Hehnera, wykorzystując liniową zależność pomiędzy intensywnością zabarwienia a grubością warstwy roztworu.
Obecnie metody kolorymetryczne zostały w znacznej mierze wyparte przez analizę spektrofotometryczną za pomocą urządzeń optoelektronicznych (→ spektrofotometr). Miniaturowe podręczne zestawy kolorymetryczne z tabelami barw wykorzystywane są w warunkach (medycyna, rolnictwo, skażenia środowiska, badanie żywności). Powszechnie stosowana do szybkiego oszacowania pH roztworów za pomocą wyskalowanych papierków wskaźnikowych.
Kolorymetria (fizyka- barwometria) - dział psychofizyki (optyki) zajmujący się ilościowym opisem i charakterystyką barw postrzeganych przez człowieka lub zwierzęta. Obejmuje metody oceny wrażeń wzrokowych za pomocą parametrów fizycznych. Jedną z najprostszych metod jest opis barwy na podstawie przyjętej skali barw. Wyznaczenie barw za pomocą kolorymetrów umożliwia otrzymanie dowolnej barwy poprzez zmieszanie trzech niezależnych barw podstawowych o odpowiednim ich natężeniu (Prawa Grassmanna). Pomiary kolorymetryczne mają duże znaczenie w procesie produkcji barwników, farb, mają zastosowanie również w poligrafii, w fotografii barwnej.